专利名称：向日葵白锈病菌实时荧光pcr检测试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测技术，具体的说涉及向日葵白锈病菌检测用试剂盒。
背景技术：
向日葵白镑病(Albugo tragopogi (Persoon)Schruter var helianthiNovotlenova)是危害向日葵的病害之一，此病近些年来在国外少数国家和地区严重发生、经济影响大、传入风险高，成为国际上关注的检疫性有害生物。向日葵白锈病主要发生在美国、阿根廷、澳大利亚、玻利维亚、法国、肯尼亚、加拿大、津巴布韦、南非、前南斯拉夫、前苏联、乌拉圭等国，1992 1994年在南非大面积发病，形成茎杆倒伏，发病严重的田块倒伏达80%以上，造成重大经济损失。2002年，此病随进口向日葵种子传入我国新疆伊犁地区，成为当地向日葵上的主要病害之一。目前该病害已在新疆北疆各地州均有发生。发生面积达96800hm2。经济损失10 30%。国外M. Thines等人报道了德国向日葵白锈病的危害、病原特征及传播特性等；
H.Voglmayr等人报道了向日葵白锈病菌等12种白锈菌的分子特征及其亲缘性关系；
A.Riethmuller等人报道了采用PCR法分析霜霉属和白锈菌属真菌的系统发育特征。国内陈卫民、李征杰等人分别对向日葵白锈病的病原鉴定、发生规律、防治技术等进行了研究。目前国内外未见有关该病菌的检测试剂盒研究的报道。因此，有必要建立一种准确率和灵敏度均高的快速检测试剂盒来检测向日葵白锈病菌。由于该病是我国的检疫性病害，因此在我国检疫是主要的控制此病害的手段，严格限制或禁止从发生此病害的国家和地区进口向日葵种苗，从其它国家进口的向日葵种苗也必须在口岸检验检疫局进行检验。由于向日葵白锈病菌是专性寄生菌，无法在培养基上进行分离培养，目前国内外检测向日葵白锈病菌所采取的手段主要是种植观察将进境的向日葵种苗按照检验检疫机构的要求进行隔离种植，在种植期间定期观察有无表现向日葵白锈病菌的典型症状。此法只能作为初步判断，且费工、费时、结果判断的准确率低。随着我国对外开放不断发展，农产品进出口日益频繁，传带农业植物有害生物的机率进一步加大，有害生物的危害性进一步增强。向日葵自上世纪以来迅速发展，国内外调种批次多，数量大，来源复杂，检疫问题非常突出。自2000年以来，我国每年从美国、德国等地引进大量向日葵种子，进口的数/重量均位居进境植物繁殖材料的前列，口岸检验检疫局每年从进口的向日葵种子检出多种有害生物。但目前我国各口岸检验检疫机构缺乏对向日葵白锈病菌的有效检测试剂盒。病害防治、预测预报及植物检疫需要有准确快速的检测试剂盒，尤其是需要我国拥有自主知识产权的检测试剂盒，从而可以将之投入到商业生产和应用中，目前国内外在这一领域还没有向日葵白锈病菌实时荧光PCR检测试剂盒的报道。此项发明满足了这些需求。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中向日葵白锈病菌的种植观察所需周期长、鉴定困难、准确率低等问题，提供向日葵白锈病菌的快速检测试剂盒。本发明通过分析本实验室测序的结果和已报道的向日葵白锈病菌核糖体基因序列，设计引物和荧光探针。引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表ATHfMTHr所示；探针的核苷酸序列如序列表ATHp所示,该探针一端标记有报告突光染料，另一端标记有淬灭突光染料。可用的报告突光染料有FAM/hex/tet/joe/vic/fitc/cy3/cy5,可用的萍灭突光染料有 TAMRA/rox/dabcyl/bhql/bhq2。根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告突光染料标记在探针的5'端,淬灭突光染料标记在探针的3'端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq DNA聚合酶具有5'端到3'端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对向日葵白锈病菌的检测。本发明应用上述引物和探针进行实时荧光PCR检测，其以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。具体的说本发明以样品总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应。即在25 μ L反应体系中加入 Real-time PCR MixlO μ L, 5 μ M 弓丨物(ATHf/ATHr)各 2 μ L, 2 μ Μ/L 的 ΑΤΗρδ μ L,样品DNA模板2ng。实时荧光PCR反应程序采用三步法第一步50°C，2min,第二步95°C，IOmin,然后进入第三步循环，95°C，10s,60°C，lmin,共40个循环。本发明具有非常好的特异性和稳定性，检测方法快速简单，准确性和灵敏性高，为可能携带向日葵白锈病菌植物材料的进出口安全提供了保证。
图1.本发明检测向日葵白锈病菌结果图1.向日葵白锈病叶片；2向日葵白锈病茎杆；3.向日葵白锈病种子；4-10.健康向日葵叶片和向日葵其他病害植株图2.本发明检测向日葵白锈病菌灵敏度结果图1、22· 3ng，2、2. 23ng，3、223pg，4、22· 3pg，5、2. 23pg，6、223fg，7、0fg。
具体实施例方式下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。实施例1引物及探针设计根据本实验室测序的结果和已报道的向日葵白锈病菌核糖体基因序列，采用引物探针设计软件DNAMAN设计引物及探针，引物序列为ATHf :5，-CTGACTTTGACTCCTCCGTGGC-3，ATHr :5，-GAGACCGATAGCGAACAAG-3，探针序列为ATHp:5’ -TTTCAGCAGTTTCAGGTACTCTTTAAC-3’，该探针的 5，端标记为报告荧光染料FAM，3’端标记为淬灭荧光染料TAMRA。
实施例2向日葵样品检测1.向日葵材料DNA的提取米用试剂盒法(TaKaRaUniversal Genomic DNA Extraction Kit Ver3. 0)提取向日葵材料核酸。向日葵种子核酸的提取将向日葵种子浸泡后，挑取种皮，然后采用试剂盒方法(DNA Extraction Kit for GMO Detection Ver. 2. 2)提取基因组 DNA。2.实时荧光PCR反应体系以向日葵材料总DNA为模板，进行实时荧光PCR反应。在25 μ L 反应体系中加入 Real-time PCR MixlO μ L，5 μ M 引物(ATHf/ATHr)各
2μ L，2 μ Μ/L 的 ΑΤΗρδ μ L，样品 DNA 模板 2ng。3.实时荧光PCR反应条件 将样品管放入Applied Biosystems7300荧光PCR仪后，设置反应程序第一步500C，2min,第二步95°C，IOmin,然后进入第三步循环，95°C，10s,60°C，lmin,共40个循环。每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。实施例3向日葵白锈病菌实时荧光PCR检测试剂盒的特异性实验以表现症状的向日葵白锈病菌叶片总DNA为模板，以健康向日葵叶片和向日葵其他病害植株为对照，通过实时荧光PCR检测荧光强度变化。实验结果以表现症状的向日葵白锈病菌叶片总DNA为模板，通过实时荧光PCR检测可观察到明显的荧光强度变化，而健康对照和向日葵其他病害植株的荧光强度没有变化，结果见图1。实施例4向日葵白锈病菌实时荧光PCR检测试剂盒的灵敏度实验用三蒸水倍比稀释总DNA，进行相对灵敏度检测。在25 μ L反应体系中，总DNA分别为 22. 3ng，2. 23ng，223pg，22. 3pg，2. 23pg，223fg，Ofg，检测结果如图 2 所示，最低检测限是 2. 23pg。
权利要求
1.一种向日葵白锈病菌检测用引物，其核苷酸序列为ATHf :5’ -CTGACTTTGACTCCTCCGTGGC-3’ATHr :5， -GAGACCGATAGCGAACAAG-3，。
2.—种与权利要求1所述引物配合使用的探针，其核苷酸序列为=ATHp :5’ -TTTCAGCAGTTTCAGGTACTCTTTAAC-3’，该探针的一端标记为报告荧光染料，另一端标记为淬灭荧光染料。
3.—种检测向日葵白锈病菌的方法，其特征在于实时突光PCR反应过程中的退火温度为 60。。。
4.含有权利要求1所述引物的试剂盒。
5.如权利要求4所述的试剂盒，其还包括权利要求2所述的探针。
全文摘要
本发明提供了一种向日葵白锈病菌实时荧光PCR检测试剂盒。试剂盒所采用的引物核苷酸序列如序列表ATHf&ATHr所示，探针核苷酸序列如序列表ATHp所示。该试剂盒以样品总DNA为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光PCR扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果。本发明具有非常好的特异性和稳定性，检测方法快速简单，准确性和灵敏性高，为可能携带向日葵白锈病菌植物材料的进出口安全提供了保证。
文档编号G01N21/64GK103060437SQ201210436718
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月6日 优先权日2012年11月6日
发明者张祥林, 王翀, 刘彬, 陈燕 申请人:新疆出入境检验检疫局检验检疫技术中心