专利名称：一种以短杆菌生物合成胞外型胆固醇氧化酶及其转化产物胆甾－4－烯－3－酮的方法
技术领域：
本发明涉及由自主选育的短杆菌(Brevibacterium sp.)正突变菌株DGCDC-82(已保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NO.M201008)生物合成胞外型胆固醇氧化酶，胆固醇氧化酶催化胆固醇氧化产生单一的氧化产物胆甾-4-烯-3-酮的方法。并对胆甾-4-烯-3-酮的毒性及降血脂进行研究，表明其在食品和医药等方面的应用。本发明属于微生物酶工程技术领域。
胆固醇是人体内不可缺少的有机组成部分，血液中胆固醇浓度是重要的生理指标，能反映人体的健康状况。而食物中胆固醇含量过高也会对人的健康构成负面影响。正是由于在微生物细胞中发现了胆固醇氧化酶，才有了今天一系列的快速、简便以及自动化的酶法测定胆固醇浓度或含量的方法。随着研究的不断深入，还发现了胆固醇氧化酶的其他作用和功能。自从1948年Turfitt G.E.首次发现灰暗诺卡氏菌产生胆固醇氧化酶以来，已经报导了有多种微生物能产生胆固醇氧化酶。不同微生物产生的胆固醇氧化酶的情况也不一样，有若干不同的特性。经查新，关于胆固醇氧化酶生物合成的研究虽已有公开报导，但多为膜酶类型。除本发明人指导的本课题研究的已发表的文章及学位论文以外，未见有与本发明涉及的技术特点相同的公开文献报导。本发明内容在本发明人及课题组成员已发表的论文的基础上又有新的创造性进展。
本发明的目的是提供一种以短杆菌生物合成胞外型胆固醇氧化酶及其转化产物胆甾-4-烯-3-酮的方法。通过对发酵法生产胆固醇氧化酶以及胆固醇氧化酶性质的研究，为胆固醇氧化酶的开发和应用提供理论指导，以实现工业化生产胆固醇氧化酶及利用该酶转化胆固醇成为胆甾-4-烯-3-酮的新技术。
本发明的内容是1.一种胆固醇氧化酶，其特征是以短杆菌(Brevibacterium sp.)突变株DGCDC-82(已经保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号CCTCC NO.M201008)为产酶菌株，酶蛋白分子量为5万道尔顿，全酶含有辅酶FAD，酶活性中心部位有半胱氨酸残基存在。
2.一种发酵法制备胆固醇氧化酶及其分离纯化的方法。以短杆菌(Brevibacterium sp.)突变株DGCDC-82为产酶菌株，以葡萄糖与酵母膏作为最适碳源与氮源，以醋酸铵作为产酶促进剂，以胆固醇作为产酶诱导剂和菌体生长营养因子，发酵生成胆固醇氧化酶。
菌种采用从土壤中自主分离出来的野生型产胆固醇氧化酶短杆菌(Brevibacterium sp.)D6C-007为出发菌株，经紫外(UV)、亚硝基胍(NTG)、UV＋LiCl、DES(烷化剂)、60Co诱变处理获得胆固醇氧化酶高产突变株(Brevibacterium sp.)DGCDC-82为产生菌。
发酵工艺斜面培养基组成(g/100ml)牛肉浸膏0.3， NaCl0.5，蛋白胨1，琼脂2，种子培养基组成(g/100ml)牛肉浸膏0.3， NaCl0.5，蛋白胨1，液体培养基组成(g/100ml)胆固醇 0.15～0.5葡萄糖 2酵母膏 0.75 NaCl 0.1醋酸铵 0.2 K2HPO40.02MgSO40.005FeSO40.001CaCl20.01 表面活性剂 吐温-80 0.05～0.2添加剂W 0.15～0.5培养基PH7.5，1atm灭菌15min。
培养条件斜面培养30℃，48hr，种子液培养30℃，220r/min，12hr，发酵液培养摇瓶发酵为250ml三角瓶装液30ml，按10％接种量，30℃，220r/min旋转摇床培养36hr，酶产量高达700U/L或15L罐发酵为15L自动发酵罐装液6～7L，按5％接种量，33℃，500r/min，通风量1vvm，培养28～32hr，酶产量高达1000U/L以上。
胆固醇添加方式，胆固醇在培养基中是产酶诱导物，也是菌体生长的营养因子。将胆固醇溶于含表面活性剂吐温-80和添加剂W的异丙醇溶液加入水相培养基形成乳状液，能获得良好的分散效果。异丙醇含量过高会抑制菌体生长，以每30ml培养基中加1ml胆固醇的异丙醇溶液的比例进行添加。
发酵后期有必要控制发酵液的PH，采用流加NaOH溶液来调节。在发酵30hr时补加NaOH调节PH至7.5左右，结果证明可以使酶保持较稳定的状态。
胆固醇氧化酶的分离纯化，以表面活性剂TritonX-114进行双水相系统连续相萃取法，或以盐析、离子交换层析、羟基磷灰石层析和分子筛层析连续分离纯化发酵上清液这两种不同的方法进行胆固醇氧化酶的分离纯化。
表面活性剂TritonX-114萃取法分离胆固醇氧化酶，直接对发酵上清液进行处理，操作条件为将发酵上清液的PH值调至7.0左右，加入1％(v/v)的表面活性剂TritonX-114，搅拌均匀，在20℃下保温30min，然后在35℃下保温5min，3000rpm离心3min，去除上清液，一次萃取可使酶液体积缩小10倍，酶活回收率为70％。
以盐析、离子交换层析、羟基磷灰石层析和分子筛层析连续分离纯化发酵上清液来分离纯化胆固醇氧化酶。
盐析条件在1L发酵上清液中，按50％饱和度加入硫酸铵盐析，透析以后得透析液100ml，以此作为层析用样品。
离子交换层析条件制备2.6×20cm层析柱，加样25ml透析酶液，洗脱液流速为1ml/min，先用2倍体积的30mol/L，PH7.0的磷酸钾缓冲液洗柱，然后用线性梯度的缓冲液(NaCl 2mol/L，200ml—磷酸钾缓冲液30mmol/L，PH7.0，200ml)洗柱，酶活回收率为67％，比酶活从2.26U/mg提高到12.8U/mg。
羟基磷灰石层析条件将离子交换层析所得的酶液加入羟基磷灰石层析柱，先用1倍体积的30mmol/L，PH7.0磷酸钾缓冲液洗脱，然后用60mol/L，PH7.0的磷酸钾缓冲液洗脱，最后用500mmol/L磷酸钾缓冲液再生，比酶活提高到25.1U/mg，酶活回收率为81.4％。
分子筛层析条件将羟基磷灰石层析柱上收集到的酶液进行透析和真空冷冻干燥，于分子筛SephadexG-75层析柱分离，洗脱液为PH7.0，50mmol/L磷酸钾缓冲液(含0.3mol/L NaCl)，洗脱液流速为1ml/min，酶活回收率为90.2％，酶液的比酶活提高到30U/mg以上。
以上连续分离纯化发酵上清液，可以制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和HPLC纯度级的单一组分的纯酶液。比酶活从0.45U/mg提高到30U/mg以上，总酶活回收率为45.3％。
比较而言，层析法分离的酶液纯度高，但是处理量小，实验室内可用此法分离纯化胆固醇氧化酶，以供研究其性质；而萃取法的操作最为简单，设备要求也最低，放大规模相对容易。
用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法测定胆固醇氧化酶的酶蛋白部分的分子量为5万道尔顿左右，通过光谱扫描确定该短杆菌所产的胆固醇氧化酶含有辅酶FAD，且该酶对巯基抑制剂敏感，疏基保护剂谷光甘肽可以消除抑制剂的影响，说明该酶活性中心有半胱氨酸存在。
本胆固醇氧化酶的最适反应PH为7.5，最适反应温度为40℃。在PH6.0，含50ppm的EDTA溶液中保存50天，胆固醇氧化酶的活性基本没有损失。但保存过程中必须防止强还原剂对酶的抑制。
胆固醇氧化酶含有辅酶FAD(黄素腺嘌呤二核苷酸)作为氢受体，在酶催化过程中，胆固醇上脱下的两个氢传递给分子氧，形成过氧化氢。胆固醇氧化酶在催化氧化胆固醇反应过程中，每氧化1摩尔胆固醇，会消耗1摩尔分子氧，产生1摩尔胆甾-4-烯-3-酮和1摩尔过氧化氢，其化学反应式为 研究表明，胆固醇氧化酶催化氧化胆固醇的过程可以描述为胆固醇氧化酶首先将胆固醇催化氧化为胆甾-5-烯-3-酮，胆固醇上脱下来的两个氢原子同分子氧结合形成过氧化氢，接着胆甾-5-烯-3-酮在胆固醇氧化酶作用下异构化为胆甾-4-烯-3-酮(简称胆甾烯酮)。
3.一种用胆固醇氧化酶催化氧化胆固醇制备胆甾-4-烯-3-酮的方法。以PH7.5磷酸钾缓冲液为水相，以正辛烷为有机相，在对反应温度、反应时间、水相/有机相的比例、加酶量、通氧量以及搅拌转速等因素进行研究之后，得到了较为合适的反应条件水相/有机相的比例为3∶2，缓冲液30ml，正辛烷20ml，加酶量16U，胆固醇添加量为2g，反应时间40min，反应温度40℃，通氧量40L/hr，搅拌转速300r/min的反应条件下，胆甾-4-烯-3-酮的转化率达到92％。
通过质谱、紫外吸收光谱和核磁共振等手段鉴定，本胆固醇氧化酶对胆固醇的催化最终产物为单一的胆甾-4-烯-3-酮。
急毒性实验表明，本发明所得产品胆甾-4-烯-3-酮的毒性较低，其半致死量大于850mg/Kg，研究表明胆甾-4-烯-3-酮具有降低家兔血清中的胆固醇和甘油三脂的功能，在提高高密度脂蛋白的同时，还可以降低低密度脂蛋白，改善脂蛋白结构；可以显著降低家兔对食物中胆固醇的吸收。
还研究了以胆固醇氧化酶降解蛋黄中的胆固醇，总胆固醇中大部分转化为胆甾-4-烯-3-酮，平均转化率达到66％。
本发明的优点是在出发株野生型产胆固醇氧化酶短杆菌DGC-007经UV、NTG、UV＋LiCl、DES诱变处理的基础上，再采用60Co诱变处理，获得完全胞外型胆固醇氧化酶高产突变株DGCDC-82。该菌株遗传特性改良后的菌种已经稳定传代2年以上。该酶完全分泌到胞外，简化了提取工艺，降低了提取成本。优化发酵工艺后，摇瓶酶产量达到700U/L以上，小罐发酵可达1000U/L。
发现了胆固醇能有效促进菌体对糖的同化、提高生物量的积累，作为培养基中重要组份的胆固醇，其主要作用既能作为产酶的诱导剂，同时还是菌体生长的营养因子。确定了培养基中胆固醇的最佳用量和添加方式，将胆固醇溶于异丙醇后再加入培养基，可以获得良好的分散效果。
发现控制后期发酵液PH可使酶不失活，保持较稳定的状态。催化活性比较稳定。
提供了以表面活性剂TritonX-114双水相系统连续相萃取法，或以盐析、离子交换层析、羟基磷灰石层析和分子筛层析连续分离纯化发酵上清液的两种分离纯化胆固醇氧化酶的方法。所制备的酶蛋白分子量在5万道尔顿左右，全酶含有辅酶FAD，酶活性中心部位含有半胱氨酸残基。
用胆固醇氧化酶催化氧化胆固醇制备胆甾烯酮具有反应条件温和，产物专一等优点，采用水相/有机相两相反应的方法，可增加反应底物和酶的接触界面，提高反应速度，同时使产物迅速溶于有机相，减少产物对酶的抑制作用，提高氧化反应的转化率，胆固醇转化率达92％以上。直接用酶处理蛋黄中的胆固醇转化率可达66％。
动物实验初步表明转化产物对降低小鼠、家兔的血清胆固醇、血脂和低密度脂蛋白具有明显的效应。
本发明可应用于进一步开发医疗诊断用酶法测定血液胆固醇的试剂盒，低胆固醇且富含胆甾烯酮的保健型食品，医用胆甾烯酮制剂等新型医药产品，以填补国内空白。
实施例1胆固醇氧化酶的摇瓶发酵以本说明书的上述培养基，采用DGCDC-82为生产菌，斜面培养，30℃，48hr。种子液培养取斜面菌种到装有30ml种子培养基的250ml三角瓶中，30℃，220r/min，培养12hr后作为种子液。
发酵液培养在装有30ml发酵培养基的250ml三角瓶中接入3ml的种子液，30℃，220r/min，培养36hr后胆固醇氧化酶的产量高达700U/L。
实施例2胆固醇氧化酶的15L罐发酵发酵培养基条件同上，种子液培养基条件同上，5％接种量，培养温度33℃，500r/min，通风量1vvm，装液量6～7L，在15L自动发酵罐培养28～32hr，发酵液酶活达1000U/L以上。
实施例3两相体系利用胆固醇氧化酶转化游离胆固醇，制备胆甾烯酮以30ml PH7.5磷酸钾缓冲液为水相，20ml正辛烷为有机相，加入2g胆固醇、16U胆固醇氧化酶，在250ml三颈烧瓶中反应。反应条件为通氧量40L/hr，温度40℃，搅拌转速300r/min。经40分钟后，胆固醇转化率达92％以上。
实施例4胆固醇氧化酶法转化蛋黄胆固醇为胆甾烯酮14g蛋黄加入20U的酶液，以PH7.5，0.05M磷酸钾缓冲液稀释到50ml，装入250ml三角瓶。35℃，220r/min，旋转式摇床反应12hr，转化率可达66％以上。
权利要求
1.一种胆固醇氧化酶，其特征为以短杆菌(Brevibacterium sp.)突变株DGCDC-82(已保藏在武汉中国典型培养物保藏中心，编号为CCTCC NO.M201008)为产酶菌株，酶蛋白分子量为5万道尔顿，全酶含有辅酶FAD，酶活性中心部位有半胱氨酸残基存在。
2.一种发酵法制备胆固醇氧化酶及其分离纯化的方法，其特征为以短杆菌(Brevibacterium sp.)突变株DGCDC-82为产酶菌株，以葡萄糖与酵母膏作为最适碳源与氮源，以醋酸铵作为产酶促进剂，以胆固醇作为产酶诱导剂和菌体生长营养因子，发酵生成胆固醇氧化酶，(1)菌种采用从土壤中分离出来的野生型产胆固醇氧化酶短杆菌(Brevibacterium sp.)DGC-007为出发菌株，经紫外(UV)、亚硝基胍(NTG)、UV＋LiCl、DES(烷化剂)、60Co诱变处理获得完全胞外型胆固醇氧化酶高产突变株DGCDC-82为产生菌，(2)发酵工艺斜面培养基组成(g/100ml)牛肉浸膏0.3，NaCl0.5，蛋白胨1，琼脂2，种子培养基组成(g/100ml)牛肉浸膏0.3，NaCl0.5，蛋白胨1，液体培养基组成(g/100ml)胆固醇 0.15～0.5葡萄糖 2酵母膏 0.75 NaCl 0.1醋酸铵 0.2 K2HPO40.02MgSO40.005FeSO40.001CaCl20.01 表面活性剂 吐温-80 0.05～0.2添加剂W 0.15～0.5培养基PH7.5，1atm灭菌15min，培养条件斜面培养 30℃，48hr，种子液培养30℃，220r/min，12hr，发酵液培养摇瓶发酵为250ml三角瓶装液30ml，按10％接种量，30℃，220r/min旋转摇床培养36hr，酶产量高达700U/L，或15L罐发酵为15L自动发酵罐装液6～7L，按5％接种量，33℃，500r/min，通风量1vvm，培养28～32hr，酶产量高达1000U/L以上，(3)胆固醇添加方式，将胆固醇溶于含表面活性剂和添加剂W的异丙醇溶液，加入水相培养基形成乳状液，可以获得良好的分散效果，以每30ml培养基加1ml胆固醇的异丙醇溶液的比例进行添加，(4)发酵后期控制发酵液的pH，采用流加NaOH溶液来调节，在发酵30hr时补加NaOH调节pH至7.5左右，(5)胆固醇氧化酶的分离纯化，表面活性剂TritonX-114双水相系统连续相萃取法，或以盐析、离子交换层析、羟基磷灰石层析和分子筛层析连续分离纯化发酵上清液的两种不同方法进行胆固醇氧化酶的分离纯化，纯化后，比酶活达到30U/mg以上。
3.按权利要求2所述胆固醇氧化酶分离纯化的方法，其特征为表面活性剂Triton X-114萃取法分离胆固醇氧化酶，操作条件为将发酵上清液的pH值调至7.0左右，加入1％(v/v)的表面活性剂Triton X-114，搅拌均匀，在20℃下保温30min，然后在35℃下保温5min，3000r/min离心3min，去除上清液，一次萃取可使酶液体积缩小10倍，酶活回收率为70％。
4.按权利要求2所述胆固醇氧化酶分离纯化的方法，其特征为以盐析、离子交换层析、羟基磷灰石层析和分子筛层析连续分离纯化发酵上清液来分离纯化胆固醇氧化酶，盐析条件在1L发酵上清液中，按50％饱和度加入硫酸铵盐析，透析以后得透析液100ml，以此作为层析用样品，离子交换层析条件制备2.6×20cm层析柱，加样25ml透析酶液，洗脱液流速为1ml/min，先用2倍体积的30mmol/L，pH7.0的磷酸钾缓冲液洗柱，然后用线性梯度的缓冲液(NaCl2mol/L，200ml-磷酸钾缓冲液30mmol/L，pH7.0，200ml)洗柱，酶活回收率为67％，比酶活从2.26U/mg提高到12.8U/mg，羟基磷灰石层析条件将离子交换层析所得的酶液加入羟基磷灰石层析柱，先用1倍体积的30mol/L，pH7.0磷酸钾缓冲液洗脱，然后用60mmol/L，pH7.0的磷酸钾缓冲液洗脱，最后用500mmol/L磷酸钾缓冲液再生，比酶活提高到25.1U/mg，酶活回收率为81.4％，分子筛层析条件将羟基磷灰石层析柱上收集到的酶液进行透析和真空冷冻干燥，于分子筛SephadexG-75层析柱分离，洗脱液为pH7.0，50mmol/L磷酸钾缓冲液(含0.3mol/L NaCl)，洗脱液流速为1ml/min，酶活回收率为90.2％，酶液的比酶活提高到30U/mg以上。
5.一种用胆固醇氧化酶催化氧化胆固醇制备胆甾-4-烯-3-酮的方法，其特征为以pH7.5磷酸钾缓冲液为水相，以正辛烷为有机相，较为合适的反应条件水相/有机相的比例为3∶2，缓冲液30ml，正辛烷20ml，加酶量16U，胆固醇添加量为2g，反应时间40min，反应温度40℃，通氧量40L/hr，搅拌转速300r/min的反应条件下，胆甾-4-烯-3-酮的转化率达到92％。
全文摘要
一种以短杆菌生物合成胞外型胆固醇氧化酶及其转化产物胆甾－4－烯－3－酮的方法,属微生物酶工程技术领域。以高产菌DGCDC－82在优化条件下发酵,产酶可达700－1000U/L,纯化后比酶活达30U/mg以上。所得酶蛋白分子量为5万道尔顿,全酶含有辅酶FAD,酶活性中心有半胱氨酸存在。在水相/有机相双相体系中该酶可将胆固醇专一地氧化为胆甾－4－烯－3－酮,转化率达92%,转化反应条件温和,快速。试验表明胆甾烯酮对降低小鼠、家兔的胆固醇、血脂和低密度脂蛋白有明显效果,可应用于开发医用酶法测血液胆固醇的试剂盒,低胆固醇且富含胆甾－4－烯－3－酮的保健型食品,医用胆甾烯酮制剂等产品,以填补国内空白。
文档编号C12P33/00GK1328133SQ0111367
公开日2001年12月26日 申请日期2001年6月5日 优先权日2001年6月5日
发明者王武, 季文明, 陈毅力, 吕陈峰, 陈亮, 韩振芳 申请人:江南大学