具有减少的细胞摄取的因子viii变体的制作方法
【专利说明】具有减少的细胞摄取的因子VlII变体
[0001] 本申请是2011年9月14日提交的题为"具有减少的细胞摄取的因子VIII变 体"的国际申请号为PCT/EP2011/065913发明专利申请的分案申请， 原申请进入中国国家阶段获得的国家申请号为201180054958. 3。 发明领域
[0002] 本发明涉及修饰的凝血因子。本发明更具体地涉及具有减少的细胞摄取的修饰凝 血因子，其导致清除率降低/细胞摄取减少和/或免疫原性降低。本发明另外涉及这样的 分子的用途以及用于产生这样的分子的方法。
[0003] 发明背景 A型血友病是由凝血因子VIII(FVIII)活性缺乏或功能异常引起的遗传性出血性疾 病。因为通常发生初始血凝块的形成，所以临床表现不是基于初级止血。而是由于缺乏次 级凝血酶形成和初级凝块的血纤蛋白稳定化，凝块不稳定。通过静脉内注射分离自血液或 重组产生的FVIII治疗该病。FVIII给予后在大约20-40%的重度A型血友病患者中发生针 对FVIII的中和抗体（抑制剂）的形成，致使用FVIII的进一步治疗无效。对抑制剂的诱 导因此在血友病保健中提供主要难题。
[0004] 当前的治疗推荐正从传统应要求治疗转向预防。与vonWillebrand因子（vWF) 结合的内源性FVIII的循环半寿期是12-14小时，因此将进行一周数次的预防治疗以便让 患者获得实际上无症状的生活。对于许多人，尤其是儿童和少年，静脉内给药与显著不便和 /或疼痛联系在一起。
[0005] 在开发具有显著延长的循环半寿期的FVIII变体中已使用多种方法。多种这些方 法涉及FVIII与亲水聚合物例如PEG(聚乙二醇）的缀合。W003031464公开了其中PEG基 团可与多肽上存在的聚糖连接的酶促方法。
[0006] 亦有人建议，调节低密度脂蛋白受体相关蛋白（LRP)介导的FVIII清除以便获 得具有减少的细胞摄取/清除率的FVIII变体，并因此增加体内循环半寿期，但该方法受 FVIII表面上存在的潜在LRP结合位点的显著大量冗余和这些位点作用的不确定性所限 制。此外，这些位点中一些紧密靠近对FVIII:C活性关键的区域，降低的LRP结合可伴随活 性的实质性损失，其使得FVIII变体作为治疗剂是较不吸引人的。认为LRP和相关受体与 其配体的相互作用涉及配体表面上的赖氨酸残基在受体的酸性"项链（necklace) "中对接 (MolCell2006; 22: 277-283)。此外有人表明，疏水残基与赖氨酸残基一起可涉及与LRP 家族成员的相互作用（FEBSJ2006; 273: 5143-5159，JMolBiol2006; 362: 700-716)， 并可因此推测，是否除了关键赖氨酸残基或其他带正电荷残基外的这些疏水残基的修饰可 导致与LRP家族成员的相互作用减少和潜在延长和/或减少的清除。
[0007] 为了具有治疗吸引力，FVIII变体应该保留FVIII促凝血功能。由此可见，本领域 需要具有维持的FVIII活性以及显著延长的体内循环半寿期和/或降低的免疫原性的特定 FVIII变体。
[0008] 发明概述 本发明因此涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含命名为"Cl足" 和/或"C2足"的FVIIICl和/或C2结构域的2、3、4、5、6、7、8、9或10个表面可接近的带 正电荷残基的取代，其中所述表面可接近的带正电荷氨基酸残基（例如赖氨酸、精氨酸或 组氨酸残基）被但不限于丙氨酸或谷氨酰胺取代，和其中取代导致细胞摄取减少。本发明 另外涉及重组FVIII变体，其中所述FVIII变体包含K2092A取代和F2093A取代，其中所述 变体与半寿期延长部分例如PEG缀合。本发明亦涉及具有FVIII活性的重组FVIII变体， 其中所述变体包含引起额外的糖基化位点的突变，其中所述糖基化位点的聚糖赋予降低的 与KM33抗体结合的能力。
[0009] 本发明的FVIII变体具有与增加的循环半寿期相关的减少的细胞摄取。本发明的 FVIII变体可另外有具有减少的LRP结合的优势。本发明的FVIII变体与无该突变类型的 FVIII分子相比可另外有具有降低的免疫原性的优势。关于降低的免疫原性的解释可为，带 正电荷的残基在FVIII的Cl和/或C2足被取代，导致负责呈递FVIII至免疫系统的细胞 摄取减少。
[0010] 附图简述 图1:以正面和背面方向示出的FVIII(pdb登录码3cdz)的X射线晶体结构的表面模 型。标示了A1、A2、A3、C1和C2结构域的位置。赖氨酸和精氨酸残基为黑色。
[0011] 图2:突出FVIII的Cl和C2结构域的FVIII(pdb登录码3cdz)的X射线晶体结 构的表面模型。Cl和C2结构域的较低部分为白色，描绘其假定的膜结合区，分别指定为Cl 足和C2足。赖氨酸和精氨酸残基为黑色。
[0012] 图3:图1.由质谱监测的氢交换（HX)鉴定涉及4F30和KM33结合的FVIII区， (A)对应于肽片段2078-2095的质/荷谱，（[M+H]+ = 672.3818，z= 3)，鉴定为与FVIII 结合的4F30和KM33两者的表位部分。（B)对应于肽片段2148-2161的质/荷谱，（m/z= 565. 6554，Z= 3)，鉴定为与FVIII结合的4F30和KM33两者的表位部分。对于所有的谱， 较上的图（panel)显示非氘化的对照，第二的图显示在不存在配体时用D2O交换10秒后的 肽，第三和第四的图分别显示在存在4F30和KM33时用D2O交换10秒后的肽。
[0013] 图4:在4F30和KM33存在时FVIII的代表性肽的氢交换时间图。在不存在（实方 块）或存在4F30 (空三角）或KM33 (空方块）时针对对数尺度上的时间绘制FVIII肽的 氘掺入（Da)。涵盖残基氨基酸2062-2073和2163-2168的肽代表不受与4F30和KM33两者 形成复合物影响的FVIII区。涵盖残基氨基酸2078-2095和2148-2161的肽代表为4F30 和KM33两者的结合表位部分的FVIII区。
[0014] 图5:在KM33和4F30存在时FVIII的HX分析肽的序列涵盖。原始序列（使用成 熟的编号：水平图A:氨基酸2062-2100,水平图B:氨基酸2139-2168)呈现在HX分析肽（以 水平条示出）上面。在存在和不存在4F30和KM33时显示类似交换模式的肽以未填充（空 条）呈现，而在4F30和KM33结合时显示降低的氘掺入的肽以黑色填充（闭条）。
[0015] 发明详述 定义 因子VIII分子：FVIII/因子VIII是主要由肝细胞产生的大的复合糖蛋白。人FVIII由2351个氨基酸（包含信号肽）组成，并包含若干个不同的结构域，如通过同源性所 限定。有3个A-结构域、1个唯一的B-结构域和2个C-结构域。结构域顺序可列为 NH2-A1-A2-B-A3-C1-C2-C00H。FVIII在血浆中以在B-A3边缘处分开的两条链循环。通过 二价金属离子结合将链连接。A1-A2-B链命名为重链（HC)，而A3-C1-C2命名为轻链（LC)。
[0016]"C1足"和"C2足"：在本发明的h下f中，