"C1足"宙义为Cl结构域的区，其具有 将FVIII分子/FVIII变体非共价锚定于阴离子膜的能力，阴离子膜包含例如血小板上发 现的磷脂酰-L-丝氨酸。在图1中，以正面和背面方向示出FVIII(pdb登录码3cdz)的X 射线晶体结构的表面模型。标示了A1、A2、A3、C1和C2结构域的位置。赖氨酸和精氨酸残 基为黑色，显示其广泛的分布。Cl足在图2所示的FVIII模型中以白色显示。更具体地， 下述Cl氨基酸可能锚定于磷脂膜，与例如血小板结合有关，并因此为Cl足的一部分：2029 -2035+2043-2069+2090-2100+2130-2136+2156-2163。本发明的发明人已出乎意料地显示， 2065、2090和2092残基中每个的突变将导致具有减少的LRP结合的生物活性FVIII变体 -尤其当这些残基被但不限于谷氨酰胺或丙氨酸残基取代时，取决于该残基的表面可接 近区域。
[0017] 在本发明的上下文中，"C2足"定义为C2结构域的区，其可能具有将FVIII分子/ FVIII变体锚定于阴离子膜的能力，阴离子膜包含例如血小板上发现的磷脂酰-L-丝氨酸。 C2足在图2所示的FVIII模型中以白色显示。更具体地，下述C2氨基酸锚定于磷脂层，与 例如血小板结合有关，并因此为C2足的一部分：2195-2227+2248-2258+2287-2291+2313-2 320。本发明的发明人已显示，C2足中表面暴露的赖氨酸或精氨酸残基中一个的突变（R2215 或K2249)将导致具有减少的LRP结合的生物活性FVIII变体-尤其当这些残基被但不限 于谷氨酰胺残基或丙氨酸残基取代时，取决于该残基的表面可接近性。发明人此外显示，包 含Cl足的取代和C2足的取代两者的FVIII变体呈现减少的LRP结合以及维持的FVIII:C 活性。
[0018]FVIIICl和/或C2足的表而可接沂的带电荷残基/带lH电荷残基/赖氨酸或精 氨酸残基：可接近的表面积(ASA)是易接近溶剂的生物分子的表面积或者生物分子表面的 一部分（例如单一氨基酸侧链）。ASA通常以平方埃（分子生物学中测量的标准单位）引 用。ASA由Lee和Richards在1971年首次描述并有时被称为Lee-Richards分子表面[B. Lee和F.M.Richards,〃TheInterpretationofProteinStructures:Estimationof StaticAccessibility(蛋白质结构的阐明：静态可接近性的估计）〃J.Mol.Biol. 55， 379-400 (1971)]。使用来源于例如x射线结构的原子坐标，可用来自AccelrysInc.的计 算机程序Quanta2005计算表面可接近性。氨基酸侧链的相对表面可接近性是对单个氨基 酸测定的实际表面可接近面积除以最大可接近的表面积。从具有pdb登录码3cdz的FVIII 的X射线晶体结构计算ASA。如果相对表面可接近性小于20%，那么将该残基突变为谷氨酰 胺以便防止蛋白表面的局部坍塌。可因此选择Cl和/或C2足的带电荷表面可接近的氨基 酸残基（优选带正电荷的氨基酸残基、优选赖氨酸和/或精氨酸残基）用于氨基酸取代，以 便得到具有减少的细胞摄取和任选亦减少的LRP结合/LRP介导的清除的FVIII变体。
[0019] 本文使用的"因子VIII"或"FVIII"指，为内在凝血途径的成员并对血液凝固必需 的人血浆糖蛋白。"天然FVIII"是如在SEQIDNO: 1 (氨基酸1-2332)中所示的全长人 FVIII分子。在SEQIDNO: 1中B-结构域跨越氨基酸741-1648。
[0020] SEQIDNO:I(wt人FVIII):
【主权项】
1. 一种具有FVIII活性的重组FVIII变体，其中所述变体包含FVIIICl足和/或C2足 的2-10个表面可接近的带正电荷氨基酸残基的取代，其中所述表面可接近的带电荷氨基 酸残基被丙氨酸或谷氨酰胺取代，和其中所述取代导致所述FVIII变体的细胞摄取减少。
2. 权利要求1的FVIII变体，其中所述变体包含Cl足的至少2个表面可接近的带正电 荷氨基酸残基的取代。
3. 权利要求1或2中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含C2足的至少2个表面可 接近的带正电荷氨基酸残基的取代。
4. 权利要求1-3中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含Cl足的至少1个表面可接 近的带正电荷氨基酸残基的取代和C2足的至少1个表面可接近的带电荷氨基酸残基的取 代。
5. 权利要求1-4中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含表面可接近的带正电荷氨 基酸残基的取代对，其中所述取代对之间的距离是至少15A。
6. 权利要求1-5中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含K2092取代。
7. 权利要求6的FVIII变体，其中所述K2092取代与R2215取代组合。
8. 权利要求6的FVIII变体，其中所述K2092取代与K2249取代组合。
9. 权利要求1-8中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含R2090取代。
10. 权利要求1-9中任一项的FVIII变体，其中所述变体包含K2065取代。
11. 权利要求10的FVIII变体，其中所述K2065取代与R2215的取代组合。
12. 权利要求10的FVIII变体，其中所述K2065取代与K2249取代组合。
13. 权利要求1-12中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体具有减少的LRP结合。
14. 权利要求1-13中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体具有减少的免疫原性。
15. 权利要求1-14中任一项的重组FVIII变体，其中FVIII变体与半寿期延长部分缀 合。
16. 权利要求1-15中任一项的重组FVIII变体，其中所述变体另外包含F2093A突变。
17. -种重组FVIII变体，其中所述变体包含K2092A取代和F2093A取代，其中所述变 体与半寿期延长部分（PEG)缀合。
18. -种药物组合物，其包含权利要求1-17中任一项的FVIII变体。
19. 权利要求1-17中任一项的FVIII变体或权利要求18的药物组合物用于治疗血友 病的用途。
【专利摘要】本发明涉及修饰的凝血因子。尤其，本发明涉及具有减少的细胞摄取的修饰因子VIII分子。
【IPC分类】A61K38-37, A61P7-04, C07K14-755
【公开号】CN104788557
【申请号】CN201510070728
【发明人】H.梅姆斯, A.B.梅耶斯, K.默滕斯, O.H.奥尔森, K.兰贝尔特, P.L.内尔比, L.B.约翰森, M.克雅尔克, H.R.施滕尼克, J.J.福尔贝格, M.范登比格拉尔
【申请人】诺沃—诺迪斯克有限公司, 桑奎因血液供应基金会
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2011年9月14日
【公告号】CN103209992A, EP2616486A2, US20140057848, WO2012035050A2, WO2012035050A3