猫ω干扰素突变体及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及猫《干扰素，尤其涉及猫《干扰素突变体，本发明还涉及所述猫《 干扰素突变体的制备方法及其在制备预防或治疗猫病毒性疾病的药物或试剂中的用途，属 于猫U干扰素的制备及应用领域。
【背景技术】
[0002] 干扰素（Interferon，IFN)是在特定的诱生剂的作用下，由细胞产生的一种具有 高度生物活性的糖蛋白，在本动物细胞中具有广谱抗病毒活性。目前已知干扰素并非直接 杀伤病毒，而是通过诱导宿主本身的细胞产生多种酶来干扰病毒的基因转录或者病毒蛋白 组分的翻译。干扰素根据产生的细胞来源不同、理化性质和生物学活性差异等方面可以分 为I型和II型IFN;I型IFN主要包括IFN-a、0、《、S、K、e、G和T等，II型IFN只 有IFN-y-种（CannAJ.PrinciplesofMolecularVirology.Beijing：SciencePress， 2006:177-178)〇
[0003]目前已知的具有《干扰素的物种有人、猫、马、羊、牛、猪、兔等。猫作为一种传统 宠物在中国的养殖量非常大，其传染病尤其是猫瘟、猫传染性鼻气管炎和猫杯状病毒感染 等病毒性疾病的发生越来越严重。目前还没有一种治疗病毒性疾病的特效药，迫切需要优 质、廉价的猫干扰素产品上市，但目前猫干扰素的表达量不高，抗病毒活性不强。
【发明内容】
[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种猫w2干扰素突变体和猫《 11干扰素突 变体，所述猫《干扰素突变体具有高抗病毒活性；
[0005] 本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种利用家蚕杆状病毒表达系统制备 所述猫《2干扰素突变体或猫《 11干扰素突变体的方法；
[0006] 本发明所要解决的第三个技术问题是提供所述猫《2干扰素突变体或猫《 11干 扰素突变体在制备预防或治疗猫病毒性疾病的药物或试剂中的用途。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0008] 本发明首先公开了一种猫《2干扰素突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO. 2或SEQ IDNO. 10所示。编码所述猫《2干扰素突变体的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO. 4、SEQ IDNO. 5、SEQIDNO. 11 或SEQIDNO. 12 所示。
[0009] 本发明还公开了一种猫《 11干扰素突变体，其氨基酸序列为SEQIDNO. 7所示。 编码所述猫《11干扰素突变体的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO. 8或SEQIDNO. 9所示。 [0010] 猫《2干扰素突变前氨基酸序列为SEQIDNO. 1所示，其基因序列为SEQIDNO. 3 所示；猫《 11干扰素突变前氨基酸序列为SEQIDNO. 6所示。
[0011] 本发明经过对比猫《干扰素13个亚型的基因序列及氨基酸序列，发现各个亚型 的氨基酸组成有极小的突变，如氨基酸由P变为L，G变为A，A变为V等；猫《干扰素2型 和4型具有较高的抗病毒活性，比对氨基酸序列，发现这两个类型的《干扰素的氨基酸序 列在134-140的位置多出7个氨基酸（RATGEGE)，说明这7个氨基酸对猫《干扰素的抗病 毒表达有一定的促进作用；11型和8型具有较低的抗病毒活性，比对氨基酸序列，发现两个 类型在125位的氨基酸由L突变为V，说明V有可能影响猫《干扰素的抗病毒活性。基于 上述比对结果，为了提高猫w干扰素的抗病毒活性，本发明将型氨基酸序列中与《11 相同的变化位点进行人工修正，并借鉴《3的突变位点引入4个氨基酸的定点突变：R82Q、 P105L、V148A、G201A，得到的203个氨基酸的突变序列如SEQIDNO. 2所示；将氨基酸的突 变序列经DNAWorks逆翻译成核苷酸序列，其核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示。
[0012] 本发明进一步利用OptimumGene?技术对猫《 2型干扰素突变基因进行优化，根据 生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，对影响基因转录效率、翻译效率和 蛋白折叠的GC含量、CpG二核苷酸含量、密码子偏好性、mRNA的二级结构、mRNA自由能稳定 性、RNA不稳定性基序、重复序列等多种相关参数进行优化设计，有利于提高所优化基因在 家蚕中的转效率录与翻译效率，并保持最终翻译成的蛋白序列不变。为了提高在家蚕杆状 病毒真核表达体系中的翻译起始效率，在基因如面加了Kozak序列AAC，为了提尚翻译终止 效率，终止密码子改为TAA。此外，还去除了基因序列内部的BamHI、EcoRI、SmaI等限 制性酶切位点，在基因上游加上了BamHI，在基因下游加上了XbaI限制性酶切位点，获得 的猫《2干扰素突变优化基因序列为SEQIDNO. 5所示。
[0013] 本发明还将原始猫《2型干扰素进行多位点突变，将《2型氨基酸序列中与《11 相同的变化位点进行人工修正，并借鉴《3、《4和《13的突变位点引入10个氨基酸的定 点突变 412￥、？271、？621、六781\1?820、？1031、？1051、？1421、￥148六、620认，得到的 203 个氨 基酸的多位点突变序列如SEQIDNO. 10所示；将氨基酸的多位点突变序列经DNAWorks逆 翻译成核苷酸序列，如SEQIDNO. 11所示。利用OptimumGene?技术对猫《2型干扰素多 突变基因进行优化，根据生物反应器家蚕的密码子偏好性对基因序列进行改造，多位点突 变和优化后的核苷酸序列如SEQIDNO. 12所示。
[0014] 本发明对猫w11型干扰素按照《2干扰素突变体一样的方法进行突变，对其引入 4个氨基酸的定点突变：R82Q、P105L、V141A、G194A，突变后猫《 11干扰素氨基酸序列如SEQ IDNO. 7所示，核苷酸序列如SEQIDNO. 8所示。本发明进一步应用在线软件分析出成熟猫 ? 11干扰素突变基因中的稀有密码子，然后通过杆状病毒偏好密码子表，将成熟猫《 11干 扰素基因中的稀有密码子全部同义替换为杆状病毒偏好性密码子，按照相同的方法在其5' 端加入BamHI酶切位点和Kozak序列，3'端加入XbaI酶切位点，优化突变基因序列如SEQ IDNO. 9 所示。
[0015] 本发明进一步公开了一种制备所述猫《 2干扰素突变体或猫《 11干扰素突变体 的方法，包括以下步骤：
[0016] (1)分别将编码所述猫《2干扰素突变体的基因或编码所述猫《11干扰素突变体 的基因克隆到杆状病毒转移载体中，构建得到重组转移载体；
[0017] (2)将重组转移载体与杆状病毒DNA共转染昆虫细胞，获得重组杆状病毒；
[0018] (3)将重组杆状病毒感染昆虫细胞或昆虫宿主，培养被感染的昆虫细胞或昆虫宿 主表达相应的蛋白，纯化，即得。
[0019] 其中，所述的杆状病毒转移载体选自AcRP23-lacZ、AcRP6-SC、AcUWl-lacZ、 BacPAK6、BactoPac、Bacmid、BlucBacII(pETL)、p2Bac、p2Blue、p89B310、pAc360、pAc373、 pAcAB3、pAcAB4、PAcAS3、pAcC129、pAcC4、DZI、pAcGP67、pAcIEI、pAcJPI、pAcMLF2、pAcMLF 7、pAcMLF8、pAcMPl、pAcMP2、pAcRP23、pAcRP25、pAcRW4、pAcsMAG、pAcUWl、pAcUW21、pAcUW2A、pAcUW2B、pAcUW3、pAcUW31、pAcUW41、pAcUW42、pAcUW43、pAcUW51、pAcVC2、pAcVC 3、pAcYMl、pAcJcC5、pBacl、pBac2、pBlueBacIII、pBlueBacHis、pEV55、mXIV、pIEINeo、pJVETL、pJVNhel、pJVPIO、pJVrsMAG、pMBac、pPIO、pPAKl、pPBac、pSHONEXI. 1、pSYNXIV VI+、pSYNVI+wp、pSYNXIVVI-、pVL1391、pVL1392、pVL1393、pVL941、pVL945、pVL985、 pVTBac、pBM030 或pUAC-5 ;优选为pVL1393 ;
[0020] 所述杆状病毒选自家蚕杆状病毒亲本株BmBacmicUBmNPV、AcMNPV、ApNPV、HaNPV、 HzNPV、LdMNPV、MbMNPV、OpMNPV、S1MNPV、SeMNPV或SpltNPV;优选为家蚕杆状病毒亲本株 BmBacmid；