专利名称：脂质超声微泡介导的腺相关病毒基因转染制剂及制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明专利涉及一种基于腺相关病毒由脂质超声微泡介导的显著增强对具致密结构细胞的基因转导效率的新型制剂，属于生物医药技术领域。背景技术：
目前，在基因治疗的研究中，安全有效的基因传递系统是人们关注的焦点。通常，根据载体的不同，可将基因传递系统分为病毒载体系统和非病毒载体系统。非病毒载体如脂质体、纳米粒、微囊、微球等具有使用方便，可大规模生产以及无免疫原性等优点，但其缺点是体内应用时转染效率较低。病毒载体中，使用得较为广泛的是腺相关病毒载体。研究者发现，腺相关病毒(Adeno-associated virus, AAV)对各种理化处理稳定,易于分离纯化；宿主范围广，可感染非分裂细胞；无致病性，并且在宿主体内不会引发免疫反应；可将外源基因定点整合到人类19号染色体长臂，基因表达稳定。腺相关病毒载体已被应用于临床治疗囊性纤维化病。但是，以病毒做为载体，虽然基因转染效率相对较高，但其安全性和免疫原 性是需要人们考虑的问题。由此可见，病毒载体和非病毒载体各有其优点和缺点，如果能通过一定的方式将两者整合在一起，将有望促使各自扬长避短，各施其能，各尽所长。近年来，随着具有定向选择作用的靶向声学造影剂的问世，启迪人们借助于超声的无创性及其协同微泡的定向传输来建立一种新型的治疗性基因靶向传输系统。研究表明，用微泡造影剂作载体来携带基因一方面可保持这些治疗性物质的活性，避免它们从血循环中被清楚，尤其是在基因转运时，由于内源性核酸内切酶和电荷相关的肝脏清楚系统，使裸DNA和其他载体在血管内的稳定性差，很快被代谢；另一方面，对于形成致密结构(紧密连接)的细胞和组织如呼吸道上皮细胞，腺相关病毒无力提供理想的转导效率，我们借助于超声的无创性和利用超声携同微泡的定向传输建立了一种新型的腺相关病毒基因传输系统，即超声微泡基因传递系统。其中，在超声波作用下，超声微泡产生的“空化效应”作用于细胞膜，产生“外溢孔”，使细胞膜通透性增加，使微泡破坏后释放的基因能够进入血管壁甚至组织间隙从而促进基因跨膜转染。三、发明目的
本发明的目的在于充分利用腺相关病毒载体高效率转导基因的优点，避免其免疫原性和毒性的产生，制备一种利用脂质超声微泡介导的通过超声微泡产生的“空化效应”作用于致密细胞的细胞膜的腺相关病毒转染制剂，从而显著增强对具致密结构细胞的基因转染效率。四
发明内容
本发明涉及一种基于腺相关病毒，由脂质超声微泡介导的显著增强对具致密结构细胞的基因转导效率的新型制剂。该新型制剂结构组成如图I所示，包括三个部分腺相关病毒，全氟丙烷，脂质双层。本发明利用腺相关病毒载体的高效转导基因的优势，在超声波作用下，通过超声微泡产生的“空化效应”作用于具致密结构细胞的细胞膜，产生“外溢孔”，细胞膜通透性增加，使微泡破坏后释放的腺相关病毒能够进入血管壁甚至组织间隙从而促进基因跨膜转染。
具体实施方式
如下
实施例I:载腺相关病毒脂质超声微泡的制备
精密量取一定比例的AAV，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，胆固醇衍生物胆留醇半琥珀酸酯(CHEMS)和甘油溶于PBS，在20°C水中混合10 min，冲入全氟丙烷气体，在室温水浴中用100W超声波清洗器超声，每超声20s间隔10s，共10个循环，即制得载AAV的脂质超声微泡。实施例2 :载药脂质微泡的形态观察、粒径分布检测
将新制备的脂质超声微泡密封置于4°C冰箱保存，分别于lh，24h，48h和2个月时间点取出，以PBS作适当稀释后置于倒置光学显微镜下观察其外观形态。为考察脂质超声微泡的浓度，将稀释液取I滴置于血球计数板上，计数8个大格的微泡数目然后取平均值(至少测3次)。并利用Malvern Sizer Nano ZS90粒度仪按照操作说明分析微泡粒径及分布。倒置光学显微镜观察显示，本实验制备的脂质超声微泡呈圆球形，大小均匀。放置lh，24h和48h后的脂质微泡镜下观察结果一致(图2);放置2月后的脂质微泡大量聚集成团(图 3)，由此说明本实验制备的脂质体超声微泡至少在48h内稳定，但不能长期存放。以血球记数仪检测微泡浓度为I. 89±O. 5X IO9个/ml。Marlven粒度仪检测结果显示(图4)，本实验制备的脂质超声微泡平均粒径为2. 46±1. 2 Mffl，粒径分布呈正态分布，其结果与光学显微镜观察的结果一致。实施例3 :细胞培养
人支气管上皮细胞16HBE140-生长于含10%胎牛血清，100u/ml青霉素、IOOyg/ml链霉素的DMEM/F12(1:1)培养基中，在37°C、5%C02、饱和湿度条件下培养。冻存的16HBE14o-细胞复苏后于150mm无菌细胞培养皿中正常培养。将单个包装的Transwell小室(透明聚酯膜，O. 4Mm)置于12-孔无菌细胞培养板。取处于对数生长期生长状态良好的16HBE140-细胞，用O. 25%胰蛋白酶消化单层培养细胞2 min，用含10%胎牛血清的DMEM/F12(1:1)培养基配成单个细胞悬液，以每孔O. 5ml,3. 5X IO6个细胞接种于Transwell内室，外室加I. 5 ml完全培养基。将培养板移入CO2培养箱中，在37°C、5% CO2及饱和湿度条件下培养，使细胞贴壁生长，并隔天换液。实施例4 :细胞跨膜电阻(TEER)的测定
细胞贴壁后即可进行跨膜电阻的检测。首先调节跨膜电阻测定系统，以70%乙醇浸泡电极15 min,再浸入无血清培养基平衡15 min。弃去Transwell外室的原有培养基,预热DMEM/F12(1:1)培养基至 37°C，Transwell 的内室加 O. 5 ml 外室加 I. 5 ml 并平衡 30 min,插入电极，测定跨膜电阻；三次读数，取平均值，减去没有细胞的空白培养孔读数，即为被测细胞的跨膜电阻。结果显示跨膜电阻在前I周增加比较缓慢，说明这时细胞分裂且尚未达到融合；细胞开始融合后，在第7天电阻开始急速增加；到第12天达到225 Ω ^m2,而后缓慢增加；随后两天基本上维持在一个定值130 Ω ^m2左右，说明此时细胞已达到良好的融合状态，可用于后续实验。各组细胞按照设计分组给药处理空白组(A)，AAV单独组(B)，AAV携同超声处理组(C)，AAV微泡组(D)，AAV微泡携同超声处理组(E);然后，再次检测细胞跨膜电阻。结果显示，A、B和D三组的细胞平均跨膜电阻没有变化；C组细胞平均跨膜电阻在给药处理后降低50 Ω Xcm2出组的平均跨膜电阻降低120 Ω Xcm2。由此说明超声处理可在一定程度降低细胞的致密程度(如C组)，但单一的超声对细胞的影响程度远远不及AAV微泡携同超声处理产生“空化效应”所导致的影响大。
实施例5 :细胞体外转导研究
细胞接种两周，将Transwell小室中的细胞分成五组(n=5)，去除原液，以PBS洗涤细胞3次，按照实验设计，分别对细胞施予以下处置(I)空白；(2) AAV ; (3) AAV+超声；(4) AAV微泡；(5) AAV微泡+超声。对于需要施予超声的培养孔，将相应的Transwell小室单个依次移入另一无菌12-孔无菌培养板，超声仪探头伸入液面O. 4-0. 6cm, 50w超声10s，间隔10s，两个循环。然后继续培养8h，去除液体，换成DMEM/F12(1:1)完全培养基；48h后，停止培养。将各组细胞，置于倒置荧光显微镜下观察荧光表达并采集图片。将给药处理后56h的各组细胞置于倒置荧光显微镜下定性观察，结果显示(图5):空白组(A)没有荧光显示，AAV单独组⑶与AAV微泡组⑶显示较弱的荧光，AAV携同超声处理组(C)显示一定程度增强了的荧光，AAV微泡携同超声处理组(E)显示明显增强的荧光。为进一步定量检测转染效率，以2.0%胰蛋白酶溶液消化各组细胞，PBS洗涤并重悬细胞制成16HBE140-单个细胞悬液，立即以流式细胞仪检测各组荧光强度。流式细胞仪的定量检测结果(图6)显示，与空白组A比较，其余各组包括B组(*p〈0.05)，C组 (**ρ<0.01), 1 (VO. 05)和E组(***P<0. 001)都具有显著性差异，这与上述荧光定性观察结果一致。根据各组细胞平均跨膜电阻在给药处理前后的变化，结合各组细胞转导效率，说明细胞致密程度的差异直接影响其转导效率。本实验采用的载AAV脂质微泡携同超声处理的转导方式可显著增强AAV介导的对致密结构细胞的转导效率。五、有益效果
本发明利用腺相关病毒载体的高效转导基因的优势，在超声波作用下，通过超声微泡产生的“空化效应”作用于具致密结构的细胞的细胞膜，产生“外溢孔”，细胞膜通透性增加，使微泡破坏后释放的腺相关病毒能够进入血管壁甚至组织间隙从而促进基因跨膜转染，该发明将为致密结构组织的基因治疗提供有效途径。对附图的说明
图I目标新型制剂结构组成图
图2脂质超声微泡的外观形态(4°C存放48小时，bar = 5Mm)
图3脂质超声微泡的外观形态(4°C存放2个月，bar = 5Mm)
图4 Malvern激光粒度仪检测脂质超声微泡的粒径及分布
图5荧光倒置显微镜定性观察各组细胞转导效率(200X)。共分五组空白组(A:Blank) ;AAV单独组(B: AAV alone) ;AAV+超声(C: AAV+Ultrasonic exposure) ;AAV微泡(D: AAV/Microbubble) ；AAV 微泡+ 超声(E: AAV/MicrobubbIe+Ultrasonic exposure)
图6流式细胞仪定量检测各组细胞转导效率。共五组空白组(A: Blank);AAV单独组(B: AAV alone) ;AAV+超声(C: AAV+Ultrasonic exposure) ;AAV 微泡(D: AAV/Microbubble) ; AAV 微泡+ 超声(E: AAV/Mi crobubb I e+Ultrasonic exposure)。
权利要求
1.一种基于腺相关病毒，由脂质超声微泡介导的显著增强对具致密结构细胞的基因转导效率的新型制剂，其结构组成包括三个部分腺相关病毒，全氟丙烷，脂质双层。
2.根据权利要求I所述的新型制剂的制备方法，其特征是精密量取一定比例的腺相关病毒，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，胆固醇衍生物胆留醇半琥珀酸酯(CHEMS)和甘油溶于PBS，在20°C水中混合10 min，冲入全氟丙烷气体，在室温水浴中用100W超声波清洗器超声，每超声20s间隔10s，共10个循环，即制得载腺相关病毒的脂质超声微泡。
3.根据权利要求I所述的新型制剂的组成要素中，脂质成分是磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，胆固醇衍生物胆留醇半琥珀酸酯(CHEMS)中的一种或几种。
4.根据权利要求2所述的新型制剂的制备方法，其特征是所述的腺相关病毒的比例为 1:1 1:1000。
全文摘要
本发明涉及一种基于腺相关病毒，由脂质超声微泡介导的显著增强对具致密结构细胞的基因转导效率的新型制剂。该新型制剂结构组成如
图1所示，包括三个部分腺相关病毒，全氟丙烷，脂质双层。本发明利用腺相关病毒载体的高效转导基因的优势，在超声波作用下，通过超声微泡产生的“空化效应”作用于具致密结构细胞的细胞膜，产生“外溢孔”，细胞膜通透性增加，使微泡破坏后释放的腺相关病毒能够进入血管壁甚至组织间隙从而促进基因跨膜转染。本发明所涉及的新型制剂制备简单，使用方便，不需要特殊的生产条件。
文档编号A61K47/28GK102813942SQ20121029025
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月15日 优先权日2012年8月15日
发明者钟志容, 刘中兵, 柯发敏, 王述蓉, 李劲薇 申请人:钟志容