专利名称：一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法
技术领域：
本发明涉及一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法，用于检测ATP结合盒转运 体Al基因ABCA1、脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因ADIPOQ和脂蛋白脂酶基因LPL的 变异，属于分子生物学技术领域。
背景技术：
脂类物质具有重要的生物功能，脂肪是体内的一种主要能量来源，但脂肪摄入过 量而运动量又过少将产生肥胖，并导致一些慢性病的发生；膳食脂肪总量增加，还会增大某 些癌症的发生几率。因此有意识地控制脂肪摄入和积极从事体力或体育活动，以消耗摄入 多余的热量，避免过多的脂肪在体内积存。ABCAl 为 ATP-binding cassette transporterAl，abcal (三磷酸腺苷结合盒转运 体Al)蛋白编码基因，它以ATP为能源，促进细胞内游离胆固醇和磷脂的流出，在胆固醇逆 转运(RCT)和HDL生成的起始步骤中起重要作用，被称作RCT守门人。核受体PPARs、LXRs 和FXR对abcal蛋白的表达具有调控作用。ABCAl功能障碍将导致巨噬细胞内大量的胆固 醇沉积而成为泡沫细胞，继而浸润血管壁，促进冠心病的发生发展。
ABCAl在机体中最重要的作用是对高密度脂蛋白的转运。高密度脂蛋白是机体重 要的抵抗心脑血管疾病的大分子，它可以将机体多余的胆固醇从外周细胞转运入肝脏内， 同时也可以保护低密度脂蛋白不受氧化损伤的影响，抑制血管内皮细胞上粘性大分子的表 达，组织单核分子进入血管壁。而ABCAl对于肝脏内和外周细胞内的胆固醇水平可以进行 调节，主要通过将多余的胆固醇从外周细胞泵出，与乏脂蛋白apoA-I结合形成初始状态的 高密度脂蛋白，而初始状态的高密度脂蛋白通过胆固醇磷酸酰化成为胆淄醇酸脂的脂化反 应转化为成熟的α高密度脂蛋白。决定血清内α高密度脂蛋白含量的几个因素包括肝脏 内ABCAl转运酶和apoA-I的含量以及乏脂蛋白apoA-I的含量。ADIPOQ 为 adiponectin，ClQ and collagen domain containing(脂联蛋白的 ClQ 和胶原结构域)编码基因，它编码一种在结构上与胶原X和VIII以及补体Clq类似的蛋白 质。这种基因主要在脂肪组织中表达，所编码的蛋白质在血液中循环，并且和代谢以及激素 产生过程有关。它的突变或异常表达等都会引起胰岛素等代谢综合症。LPL基因编码脂蛋白脂酶，该酶在心脏、肌肉和脂肪组织中进行表达。LPL以同型 二聚体蛋白的形式行使功能，其分子生物学的作用包括两部分，一部分为甘油三脂的水解 酶作用，另一部分则是受体介导的脂蛋白内吞作用的桥梁。LPL蛋白上的位点突变在严重的 情况下可以导致I型高脂蛋白血症，而较轻程度上则引起体内脂蛋白代谢的紊乱。大样本量中国人群研究证实，ATP结合盒转运体Al基因ABCAl、脂联蛋白的ClQ和 胶原结构域编码基因ADIPOQ和脂蛋白脂酶基因LPL的变异在中国人群众普遍存在。以往 的检测方法在对ATP结合盒转运体Al基因ABCA1、脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因 ADIPOQ和脂蛋白脂酶(LPL)基因进行检测时出现的假阳性现象无法很好的排查和解释。
发明内容
本发明的目的是提供一种准确率高的脂质代谢相关基因的基因型检测方法。为了达到上述目的，本发明的技术方案是提供一种脂质代谢相关基因的基因型检 测方法，其特征在于，具体步骤为第一步、检测的样品类型与采样方法用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；第二步、基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为 2-2. 5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；第三步、荧光定量PCR反应 将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即ATP结合盒转运 体Al基因rs2230806、脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因rs2241766和脂蛋白脂酶基 因rs320和rs285，并增设2个不含DNA模板的NTC空白对照孔；在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，所述PCR反应体系的总体积为 10 μ 1，由2 μ 1浓度为20ng/ μ 1的被测者口腔上皮细胞的基因组DNA模板溶液、1μ 1 IOX 荧光定量PCR反应缓冲液、0. 1 μ 1浓度分别为25mM的合成DNA的四种脱氧核苷酸底物d NTP混合液、0. 5 μ 1浓度为25mM的氯化镁溶液、0. 02 μ 1浓度为5units/ μ 1的Taq DNA聚 合酶溶液、5. 43 μ 1去离子水、0. 225 μ 1浓度为20 μ M的正向引物溶液、0. 225 μ 1浓度为 20 μ M的反向引物溶液、0. 25 μ 1浓度为10 μ M的VIC荧光探针溶液和0. 25 μ 1浓度为10 μ M 的FAM荧光探针溶液组成，其中，4个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光探针以及带 FAM荧光探针序列如下(1)、ATP 结合盒转运体 Al 基因 SEQ ID NOl :rs2230806 带VIC 荧光 A 型探针ACCAAAGGAGAAACTG ；带FAM 荧光 G 型探针ACCAAGGGAGAAACTG ；正向引物CATTGGACTGTTGCAATGGA；
反向引物ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG ；(2)、脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因SEQ ID NOl :rs2241766 带VIC 荧光 G 型探针CGGGCATGACCAGG ；带FAM 荧光 T 型探针CGGTCATGACCAGG ；正向引物GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA；反向引物TGTGATGAAAGAGGCCAGAA；(3)、脂蛋白脂酶基因 SEQ ID NOl :rs320 带VIC 荧光 G 型探针AAGCGTTTATACT ；带FAM 荧光 T 型探针AAGCTTTTATACT ；正向引物ATAAGCCCTGAATCGCTCAC；
反向引物TTCCATCCCCAAGATCTTTTT ；(4)、脂蛋白脂酶基因 SEQ ID NOl :rs285 带VIC 荧光 C 型探针TTAGCAGCTGTGG ；带FAM 荧光 T 型探针TTAGTAGCTGTGG ；
正向引物AAGAGAGGACTGTGGGACCAT；反向引物TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA；将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50°C、2分钟， 95°C、10分钟，然后再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟，反应结束，取出后再放入 荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到ATP结合盒转运体Al基因rs2230806、脂联蛋白的 ClQ和胶原结构域编码基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285四张图；第四步、SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和NTC空白对照进行比 较，每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧 光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、ATP 结合盒转运体 Al 基因 rs2230806
在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因 型、坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；(2)、脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因rs2241766 在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因 型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；(3)、脂蛋白脂酶基因rs320 在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因 型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；(4)、脂蛋白脂酶基因rs285 在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为CC基因 型、坐标轴右上区域点为CT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型。本发明所需检测的DNA可以利用口腔粘膜上皮细胞进行抽提获得。采用口腔粘膜 上皮细胞采样方法和器材进行样本采集。样本的DNA抽提利用硅胶吸附法进行口腔上皮细 胞的DNA抽提并进行DNA浓度和纯度的测定。本发明4个位点的基因分型分别采用PCR技 术及TaqMan^MGB技术进行分型。经重复实验验证，基因分型的准确率达到了 99%以上，重 复性达到了 100%。本发明增加了一对内参因物的设计避免了假阳性现象，同时适用于大样 本量的基因分型检测。本发明的优点是检测准确率高，可重复性强。
图1为ATP结合盒转运体Al基因SEQ ID NOl :rs2230806基因分型图；图2为脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因SEQ ID NOl :rs2241766基因分型图。图3为脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs320基因分型图；图4为脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs285基因分型图。
具体实施例方式以下结合附图和实施例对本发明作进一步说明。
实施例一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法第一步、检测的样品类型与采样方法用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；第二步、基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2小 时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；第三步、荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即ATP结合盒转运 体Al基因( ABCAl) rs2230806、脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因(ADIPOQ) rs2241766 和脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320和rs285，并增设2个不含DNA模版的NTC空白对照孔；在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，其总体积为10μ 1，即2μ 1浓度为 20ng/ μ 1的被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA溶液、1 μ 1 IOX荧光定量PCR反应缓冲 液(ABI Master Mix)、0. 1 μ 1浓度分别为25mM的合成DNA的四种脱氧核苷酸底物d NTP 混合液、0. 5 μ 1浓度为25mM的氯化镁溶液、0. 02 μ 1浓度为5units/ μ 1的Taq DNA聚合酶 (ΤIANGEN Taq DNA Polymerase)、5. 43 μ 1 去离子水、0. 225 μ 1 浓度为 20 μ M 的正向引物、 0. 225 μ 1浓度为20 μ M的反向引物、0. 25 μ 1浓度为10 μ M的VIC荧光探针和0. 25 μ 1浓 度为 ομ M的FAM荧光探针，其中，4个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光探针以及带 FAM荧光探针如下ATP 结合盒转运体 Al 基因(ABCAl)SEQ ID NOl :rs2230806 带VIC 荧光 A 型探针ACCAAaGGAGAAACTG带FAM 荧光 G 型探针ACCAAgGGAGAAACTG正向引物CATTGGACTGTTGCAATGGA反向引物ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因(ADIPOQ)SEQ ID NOl :rs2241766 带VIC 荧光 G 型探针CGGgCATGACCAGG
带 FAM 荧光 T 型探针CGGtCATGACCAGG正向引物GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA反向引物TGTGATGAAAGAGGCCAGAA脂蛋白脂酶基因(LPL)SEQ ID NOl :rs320 带VIC 荧光 G 型探针AAGCgTTTATACT带FAM 荧光 T 型探针AAGCtTTTATACT正向引物ATAAGCCCTGAATCGCTCAC反向引物TTCCATCCCCAAGATCTTTTT脂蛋白脂酶基因(LPL)SEQ ID NOl :rs285 带VIC 荧光 C 型探针TTAGcAGCTGTGG
带 FAM 荧光 T 型探针TTAGtAGCTGTGG正向引物AAGAGAGGACTGTGGGACCAT反向引物TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA
将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50°C、2分钟， 95°C、10分钟，然后再进行60个循环的95°C、30秒，60°C、1分钟，反应结束，取出后再放入 荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到ATP结合盒转运体Al基因(ABCAl) rs2230806、脂 联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因(ADIPOQ)rs2241766和脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320 和rs285四张图；第四步、SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和一个NTC空白对照进行 比较，每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM 荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、ATP 结合盒转运体 Al 基因(ABCAl) rs2230806如图1所示，为ATP结合盒转运体Al基因SEQ ID NOl :rs2230806基因分型图，坐 标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AG基因 型、坐标轴右下区域点为GG基因型；图中每个点代表一个受检样本，根据点所处的区域和 位置和颜色可以进行基因型判断。
(2)、脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因(ADIPOQ)rs2241766如图2所示，为脂联蛋白的ClQ和胶原结构域编码基因SEQ ID NOl :rs2241766基 因分型图，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区 域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；图中每个点代表一个受检样本，根据点 所处的区域和位置和颜色可以进行基因型判断。(3)、脂蛋白脂酶基因(LPL)rs320 如图3所示，为脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs320基因分型图，坐标轴左下区域 点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右 下区域点为GG基因型；图中每个点代表一个受检样本，根据点所处的区域和位置和颜色可 以进行基因型判断。(4)、脂蛋白脂酶基因(LPL)rs285 如图4所示，为脂蛋白脂酶基因SEQ ID NOl :rs285基因分型图，坐标轴左下区域 点为空白对照、坐标轴左上区域点为CC基因型、坐标轴右上区域点为CT基因型、坐标轴右 下区域点为TT基因型。图中每个点代表一个受检样本，根据点所处的区域和位置和颜色可 以进行基因型判断。
权利要求
一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为第一步、检测的样品类型与采样方法用采样拭刮被测者口腔中左右两腮各20次，以采集口腔粘膜上皮细胞样本；第二步、基因组DNA的抽提方法采用硅胶吸附法抽提每一个被测者口腔上皮细胞样本的基因组DNA，时间为2-2.5小时，经电泳检测后，肉眼可见清晰白色条带即进入下一步检测；第三步、荧光定量PCR反应将每一个被测者样本分别放入4个反应孔，同时检测4个位点，即ATP结合盒转运体A1基因rs2230806、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285，并增设2个不含DNA模板的NTC空白对照孔；在每一个反应孔中加入荧光定量PCR反应体系，所述PCR反应体系的总体积为10μl，由2μl浓度为20ng/μl的被测者口腔上皮细胞的基因组DNA模板溶液、1μl 10X荧光定量PCR反应缓冲液、0.1μl浓度分别为25mM的用于合成DNA的四种脱氧核苷酸底物d NTP混合液、0.5μl浓度为25mM的氯化镁溶液、0.02μl浓度为5units/μl的Taq DNA聚合酶溶液、5.43μl去离子水、0.225μl浓度为20μM的正向引物溶液、0.225μl浓度为20μM的反向引物溶液、0.25μl浓度为10μM的VIC荧光探针溶液和0.25μl浓度为10μM的FAM荧光探针溶液组成，其中，4个位点的正向引物、反向引物、带VIC荧光探针以及带FAM荧光探针序列如下(1)、ATP结合盒转运体A1基因SEQ ID NO1rs2230806带VIC荧光A型探针ACCAAAGGAGAAACTG；带FAM荧光G型探针ACCAAGGGAGAAACTG；正向引物CATTGGACTGTTGCAATGGA；反向引物ACAAAGTCATGCTGTCCAAGG；(2)、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因SEQ ID NO1rs2241766带VIC荧光G型探针CGGGCATGACCAGG；带FAM荧光T型探针CGGTCATGACCAGG；正向引物GTATTACAGATTTCAGGGCAGAAAGA；反向引物TGTGATGAAAGAGGCCAGAA；(3)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1rs320带VIC荧光G型探针AAGCGTTTATACT；带FAM荧光T型探针AAGCTTTTATACT；正向引物ATAAGCCCTGAATCGCTCAC；反向引物TTCCATCCCCAAGATCTTTTT；(4)、脂蛋白脂酶基因SEQ ID NO1rs285带VIC荧光C型探针TTAGCAGCTGTGG；带FAM荧光T型探针TTAGTAGCTGTGG；正向引物AAGAGAGGACTGTGGGACCAT；反向引物TGCTGCTTTAGACTCTTGTCCA；将反应孔和空白对照孔在PCR扩增仪上进行反应，先进行预热50℃、2分钟，95℃、10分钟，然后再进行60个循环的95℃、30秒，60℃、1分钟，反应结束，取出后再放入荧光定量PCR仪上读取样品荧光量，得到ATP结合盒转运体A1基因rs2230806、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因rs2241766和脂蛋白脂酶基因rs320和rs285四张图；第四步、SNP基因型分析将荧光定量PCR仪上显示的最终样本荧光信号的4个图和一个NTC空白对照进行比较，每个位点存在三种不同的信号，纯VIC荧光信号、VIC和FAM杂合荧光信号以及纯FAM荧光信号，分别代表该位点三种不同的基因型；(1)、ATP结合盒转运体A1基因rs2230806在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为AA基因型、坐标轴右上区域点为AG基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；(2)、脂联蛋白的C1Q和胶原结构域编码基因rs2241766在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；(3)、脂蛋白脂酶基因rs320在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为TT基因型、坐标轴右上区域点为GT基因型、坐标轴右下区域点为GG基因型；(4)、脂蛋白脂酶基因rs285在检测结果图中，坐标轴左下区域点为空白对照、坐标轴左上区域点为CC基因型、坐标轴右上区域点为CT基因型、坐标轴右下区域点为TT基因型。
全文摘要
本发明提供了一种脂质代谢相关基因的基因型检测方法，其特征在于，具体步骤为检测的样品类型与采样方法基因组DNA的抽提方法；荧光定量PCR反应；以及SNP基因型分析。本发明的优点是检测准确率高，可重复性强。
文档编号C12Q1/68GK101845510SQ20101020500
公开日2010年9月29日 申请日期2010年6月18日 优先权日2010年6月18日
发明者傅咏南, 毛丹丹, 王校 申请人:上海中优医药高科技有限公司