一种快速检测工业巴氏酵母芳香醇代谢基因的方法与流程

本发明属于生物工程
技术领域：
，尤其涉及一种快速检测工业巴氏酵母芳香醇代谢基因的方法。
背景技术：
：啤酒是一种深受人们喜爱的低酒精含量且营养丰富的饮料。当今全球啤酒市场超过90％是lager类型的啤酒，因此用于酿制lager啤酒的下面啤酒酵母(俗称“lager酵母”)已被最广泛地应用在啤酒工业中。lager酵母(saccharomycespastorianus)并不同于1996年已作为模式生物进行全基因组测序的酿酒酵母(s.cerevisiae)，而是一种具有高度染色体倍性、染色体结构组成复杂的异源多倍体菌种，除携带一部分酿酒酵母基因外，还携带贝氏酵母(s.bayanus)的遗传信息。因此对于lager酵母中的大部分基因都存在sc-(s.cerevisiae)和sb-(s.bayanus)两个同源基因。啤酒中至少有45种不同的醇类，最主要的有脂肪醇和芳香醇两类。其中脂肪醇中异戊醇含量最丰富，大约有25-120mg/l；而芳香醇中的苯乙醇的含量也较高，大约在5-100mg/l。β-苯乙醇是一种具有玫瑰花香的芳香醇，啤酒酵母具有从头合成和生物转化l-苯丙氨酸生成β-苯乙醇(即艾氏途径)的能力。在酵母细胞中，β-苯乙醇合成走哪一条途径取决于培养基中的氮源。谷氨酸、铵盐等一般作为优质的、较易利用的氮源使用，而氨基酸、尿素等只作为次级氮源使用。但是，只有当l-苯丙氨酸作为唯一氮源时，艾氏途径才占优势。如果环境中有其他更容易利用的氮源存在，即使在较高的l-苯丙氨酸浓度条件下，l-苯丙氨酸仍有一部分通过其它途径被代谢。除此之外，同为芳香醇的酪醇和色醇对于啤酒风味的影响，目前尚未见比较肯定的意见。色醇对上面发酵啤酒比较重要，而在下面发酵啤酒中含量很低，这是酵母对色氨酸的代谢差异造成的。目前，荧光定量pcr方法是现在最为常用的定量mrna的方法。但由于该方法通量不高的局限性，因此需要一种快速、准确的技术对lager酵母多个芳香醇代谢相关基因表达同时进行检测。技术实现要素：本发明提供了一种快速检测工业巴氏酵母芳香醇代谢基因的方法，尤其是采用gexp多重基因表达定量分析技术检测工业巴氏酵母芳香醇代谢相关基因(adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc和aro80-sb)表达的方法，有利于在不同生产条件下，控制发酵过程中芳香醇代谢及含量，提高啤酒的风味稳定性及一致性；并可以通过快速调整啤酒中芳香醇风味，节省研发成本，加速新产品的开发。为了达到上述目的，本发明提供了一种快速检测工业巴氏酵母芳香醇，尤其是β-苯乙醇代谢基因的方法，包括总rna的提取、逆转录反应制备cdna模板、多重pcr反应、毛细血管电泳、产物片段分析，针对工业巴氏酵母芳香醇代谢相关基因adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc和aro80-sb，逆转录反应制备cdna模板应用引物为seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6、seqidno.8、seqidno.10、seqidno.12、seqidno.14、seqidno.16、seqidno.18、seqidno.20、seqidno.22、seqidno.24、seqidno.26、seqidno.28、seqidno.30，多重pcr反应中应用引物seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.11、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.17、seqidno.19、seqidno.21、seqidno.23、seqidno.25、seqidno.27、seqidno.29。作为优选技术方案，还包括作为内参照基因的工业巴氏酵母β-actin基因act1-sc、act1-sb，逆转录反应制备cdna模板应用引物为seqidno.32、seqidno.34；多重pcr反应中应用引物seqidno.31、seqidno.33。具体检测步骤如下：(1)使用下述多重引物进行工业巴氏酵母芳香醇代谢关键基因的检测：设计符合gexp多重pcr反应特点的、且能够检测工业巴氏酵母芳香醇代谢相关基因表达的特异性上下游引物，以及作为内参照基因的特异性上下游引物(见表1)：表1工业巴氏酵母芳香醇代谢相关基因以及内参照基因的特异性上下游引物其中每条引物分别配制成100μm的储存液，下游引物工作液为500nm，上游引物工作液为200nm；(2)总rna提取与纯化：采用通用的rna提取方法和纯化方法，从酵母细胞中提取得到纯化的酵母总rna；(3)逆转录反应制备cdna模板：以酵母总rna为模板合成cdna第一链，上述(1)中的多重引物的下游引物为特异性引物，反应体系为20μl；其中，ntc和rt-为阴性对照，具体反应条件见表2、表3。表2逆转录反应制备cdna模板的反应条件每管成分ntcrt-标准反应无dna酶/rna酶水8μl4μl3μl5×反转录缓冲液4μl4μl4μlkanrrna(1:50稀释)5μl5μl5μl反转录酶1μl01μl下游引物(500nm)2μl2μl2μlrna模板(5-20ng/μl)05μl5μl表3各基因的下游引物浓度基因产物大小下游引物浓度(nm)adh1-sb18762.5adh1-sc244125adh3-sb1657.8125adh3-sc169500adh4-sb4067.8125adh4-sc142500adh5-sb200500adh5-sc146125aro8-sc251500aro9-sb240500aro9-sc38962.5aro10-sb316500aro10-sc219500aro80-sb331500aro80-sc2641500act1-sb2840.5act1-sc362500逆转录反应制备cdna模板反应参数设置如下：48℃1分钟；42℃60分钟；95℃5分钟。(4)多重pcr：以上述合成的逆转录反应制备cdna模板为模板，上述(1)中的多重引物的上游引物为特异性引物，进行多重pcr扩增反应，每个样品设3个平行管，采用beckmancoulte公司的dna聚合酶以及genomelabtmgexp启动试剂盒进行，具体反应条件见表4。表4多重pcr的反应条件成分体积(μl)25mmmgcl24.0μl5×pcr缓冲液4.0μldna聚合酶0.7μl上游引物(200nm)2μlcdna第一链9.3μlrt-pcr扩增参数设置如下：95℃10分钟；94℃30秒；56℃30秒；71℃1分钟(35个循环)。(5)多重pcr产物毛细管电泳：取1μlpcr多重产物加到分装有39μl的sls+dss混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石蜡油。另外，在缓冲液板每孔中加入250μl的分离缓冲液。全部准备完后，上机进行毛细管电泳。分离胶、分离缓冲液购自beckmancoulter。(6)产物片段分析：利用gexp系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果。与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：(1)采用本发明检测方法能够灵敏、特异、准确地检测adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc和aro80-sb基因表达的水平。芳香醇代谢关键基因表达量的变化，反应了酵母芳香醇的生成情况，因此可以用于研究工业巴氏酵母芳香醇代谢调控机理。(2)本发明采用的gexp多重基因表达定量分析技术与常规的基因表达定量分析技术(荧光定量pcr)相比具有更强的特异性和灵敏性、自动化程度高等特点，保证了结果的可靠性和可重复性。另外，由于gexp多重基因表达定量分析技术可以同时检测多达30个基因的表达丰度，大大缩短了实验时间。(3)本发明有利于在不同生产条件下，控制发酵过程中芳香醇代谢及含量，提高啤酒的风味典型性及一致性；并可以通过快速调整啤酒中芳香醇风味，突出产品特色及进行新产品的开发。附图说明图1为本发明实施例所提供的利用gexp系统参数对毛细管电泳结果进行分析的示意图；图2为本发明实施例所提供的a、b两种工业巴氏酵母芳香醇代谢关键基因的表达量的示意图。具体实施方式下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。实施例1(1)本实施例提供了一种快速检测工业巴氏酵母芳香醇代谢基因的方法，包括总rna的提取、逆转录反应制备cdna模板、多重pcr反应、毛细血管电泳、产物片段分析，针对工业巴氏酵母芳香醇代谢相关基因adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc和aro80-sb，逆转录反应制备cdna模板应用引物为seqidno.2、seqidno.4、seqidno.6、seqidno.8、seqidno.10、seqidno.12、seqidno.14、seqidno.16、seqidno.18、seqidno.20、seqidno.22、seqidno.24、seqidno.26、seqidno.28、seqidno.30，多重pcr反应中应用引物seqidno.1、seqidno.3、seqidno.5、seqidno.7、seqidno.9、seqidno.11、seqidno.13、seqidno.15、seqidno.17、seqidno.19、seqidno.21、seqidno.23、seqidno.25、seqidno.27、seqidno.29。在上述基础上，还包括作为内参照基因的工业巴氏酵母β-actin基因act1-sc、act1-sb，逆转录反应制备cdna模板应用引物为seqidno.32、seqidno.34；多重pcr反应中应用引物seqidno.31、seqidno.33。根据adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc，aro80-sb基因以及内参基因act1-sc、act1-sb的全长序列，使用primerpremier5软件设计符合gexp多重pcr反应特点的、且能够检测工业巴氏酵母芳香醇代谢相关基因表达的特异性上下游引物，以及作为内参照基因的特异性上下游引物，引物序列见下表5：表5工业巴氏酵母芳香醇代谢相关基因以及内参照基因的特异性上下游引物单一引物毛细管电泳结果显示扩增后的产物长度与预计产物长度一致，说明设计的引物具有很强的特异性，适合用于gexp检测。(2)取发酵条件一致的a、b两种酵母菌株发酵罐中的满罐酵母细胞样，迅速提取rna(3)总rna的提取与纯化(ribopuretm-yeastkit，ambion，产品编号am1926)：1)取750μl氧化锆珠于1.5ml离心管(带螺旋盖)，约2.5cm高处；2)酵母收集管中按顺序加入裂解液(480μllysisbuffer+48μl10％sds+480μlphenol：cloroform：iaa)，重悬。涡旋振荡10-15s；3)将混合液转移到准备好的750μl氧化锆小珠离心管中，盖紧；4)将离心管置于涡旋振荡器震荡10min(最大转速)，裂解细胞；5)16000g室温离心5min，将上层水相转移到10ml离心管中；6)加入1.9mlbindingbuffer，混匀；7)加入1.25ml100％乙醇，混匀；8)取700μl混合液到filtercartridge+collectiontube中，12000g离心1min，弃收集液；重复该步骤，至上述混合液全部转移；9)在filtercartridge上加入700μlwashsolution1，12000g离心1min，弃收集液；10)加入500μlwashsolution2/3，12000g离心1min，弃收集液。重复该步骤；11)12000g离心1min，彻底去除膜上液体，将filtercartridge转移到新的collectiontube中；12)加入95-100℃预热的elutionsolution25-50μl到膜中央，12000g离心1min。再加25-50μlelutionsolution到膜中央，12000g离心1min，即获得rna收集液；13)dnasei处理50-100μlrna样本+1/10thvol10×dnaseibuffer+4μldnasei，37℃反应30min。加入1/10thvoldnaseinactivationreagent(使用前先涡旋)，涡旋震荡后混匀，室温放置5min后，12000g离心2-3min，使dnaseinactivationreagent沉淀，将rna上清液转移至新管中保存，即可得到纯化的总rna。(4)逆转录反应制备cdna模板：以上述所述纯化的酵母细胞rna为模板，使用beckmancoulter公司的genomelabtmgexp启动试剂盒，上述表5中的多重引物的下游引物为特异性引物，以酵母细胞的总rna为模板合成cdna第一链，反应体系为20μl。genomelabtmgexp启动试剂盒(产品编号：pna85017)，含有反转录反应缓冲液、反转录酶、pcr反应缓冲液、kanrrna、无dna酶/rna酶的水、dnamarker(dss-400)、矿物油、gexp上样缓冲液；dna聚合酶(产品编号：pna85022)；分离胶(产品编号：pna608010)；分离缓冲液(产品编号：pna608012)，均购自beckmancoulter。cdna第一链合成反应体系设置见表6和表7，其中ntc和rt-为阴性对照：表6逆转录反应制备cdna模板的反应条件每管成分ntcrt-标准反应无dna酶/rna酶水8μl4μl3μl5×反转录缓冲液4μl4μl4μlkanrrna(1:50稀释)5μl5μl5μl反转录酶1μl01μl下游引物(500nm)2μl2μl2μlrna模板(5-20ng/μl)05μl5μl表7各基因的下游引物浓度逆转录反应制备cdna模板反应参数设置如下：48℃1分钟；42℃60分钟；95℃5分钟。(5)rt-pcr：采用beckmancoulter公司的dna聚合酶及genomelabtmgexp启动试剂盒进行。以上述表2中合成的逆转录反应制备cdna模板为模板，上述表5中的多重引物的上游引物为特异性引物，进行rt-pcr扩增反应，每个样品设3个平行管，具体反应条件见表8。表8rt-pcr的反应条件成分体积(μl)25mmmgcl24.0μl5×pcr缓冲液4.0μldna聚合酶0.7μl上游引物(200nm)2μlcdna第一链9.3μlrt-pcr扩增参数设置如下：95℃10分钟；94℃30秒；56℃30秒；71℃1分钟(35个循环)。(6)多重pcr产物毛细管电泳：取1μlpcr多重产物加到分装有39μl的sls+dss混合液的上样板的孔中，用移液枪混匀后覆盖一滴石蜡油。另外，在缓冲液板每孔中加入250μl的分离缓冲液。全部准备完后，上机进行毛细管电泳。分离胶、分离缓冲液购自beckmancoulter。(7)产物片段分析：利用gexp系统参数对毛细管电泳结果进行分析，记录结果，如图1所示，每个不同大小的峰均对应其相应的基因，且每个峰的高度对应着基因的表达量。图2为a、b两种工业巴氏酵母芳香醇代谢关键基因在发酵过程中的表达量。从图2中看出两株酵母菌株在芳香醇代谢性能上存在差异。具体的，菌株b的芳香醇代谢关键基因的表达量均高于菌株a，且在aro8-sc和aro80-sc基因的表达量上存在显著差异。根据本发明提供的方法，可以快速同时检测工业巴氏酵母芳香醇代谢关键基因(adh1-sc，adh1-sb，adh3-sc，adh3-sb，adh4-sc，adh4-sb，adh5-sc，adh5-sb，aro8-sc，aro9-sc，aro9-sb，aro10-sc，aro10-sb，aro80-sc，aro80-sb)表达水平，用于研究lager酵母芳香醇代谢调控机理。本发明有利于在不同生产条件下，控制发酵过程中芳香醇代谢及含量，提高啤酒的风味稳定性及一致性；并可以通过快速调整啤酒中芳香醇风味，突出产品特色及进行新产品的开发。序列表<110>青岛啤酒股份有限公司<120>一种快速检测工业巴氏酵母芳香醇代谢基因的方法<160>34<170>patentinversion3.3<210>1<211>38<212>引物<213>adh1-sc<400>1aggtgacactatagaatactgaatgtgctccagtcttg38<210>2<211>40<212>引物<213>adh1-sc<400>2gtacgactcactatagggacaccaatggatctgaataatt40<210>3<211>37<212>引物<213>adh1-sb<400>3aggtgacactatagaatatgttcaatatgctaaggcg37<210>4<211>38<212>引物<213>adh1-sb<400>4gtacgactcactatagggattggtagccttaacgactg38<210>5<211>36<212>引物<213>adh3-sc<400>5aggtgacactatagaatacaacattgttcaccaggc36<210>6<211>37<212>引物<213>adh3-sc<400>6gtacgactcactatagggatgtaatgcagcttcccct37<210>7<211>42<212>引物<213>adh3-sb<400>7aggtgacactatagaataagtctacttgctagaaatatcctc42<210>8<211>37<212>引物<213>adh3-sb<400>8gtacgactcactatagggatttggttctgggactgga37<210>9<211>36<212>引物<213>adh4-sc<400>9aggtgacactatagaatagggatcacgtatgccgtt36<210>10<211>37<212>引物<213>adh4-sc<400>10gtacgactcactatagggactgcccttttttcctgtt37<210>11<211>35<212>引物<213>adh4-sb<400>11aggtgacactatagaatagcttacaacgacggctct35<210>12<211>38<212>引物<213>adh4-sb<400>12gtacgactcactatagggagttctcagccaagataccg38<210>13<211>36<212>引物<213>adh5-sc<400>13aggtgacactatagaatagccttcgcaagtcattcc36<210>14<211>40<212>引物<213>adh5-sc<400>14gtacgactcactatagggaaatttcgttaggcttaggttc40<210>15<211>35<212>引物<213>adh5-sb<400>15aggtgacactatagaatatcttctcaacccatcccg35<210>16<211>36<212>引物<213>adh5-sb<400>16gtacgactcactatagggacgtgccatgcgtgtaaat36<210>17<211>37<212>引物<213>aro8-sc<400>17aggtgacactatagaatagatgaaaccaatgctcgta37<210>18<211>38<212>引物<213>aro8-sc<400>18gtacgactcactatagggaaatctttgttgacggtgta38<210>19<211>37<212>引物<213>aro9-sc<400>19aggtgacactatagaatacccctgttgattacacttc37<210>20<211>39<212>引物<213>aro9-sc<400>20gtacgactcactatagggacgattaattctggacacaaa39<210>21<211>34<212>引物<213>aro9-sb<400>21aggtgacactatagaatagcgtcatcgagctggc34<210>22<211>37<212>引物<213>aro9-sb<400>22gtacgactcactatagggacggtggcagacctctagt37<210>23<211>37<212>引物<213>aro10-sc<400>23aggtgacactatagaataaatcaagaagaacgacacc37<210>24<211>36<212>引物<213>aro10-sc<400>24gtacgactcactatagggaacccatcttaggccagc36<210>25<211>34<212>引物<213>aro10-sb<400>25aggtgacactatagaataaatgctgcctatgccg34<210>26<211>40<212>引物<213>aro10-sb<400>26gtacgactcactatagggagttatcctgaaccatgtcatg40<210>27<211>35<212>引物<213>aro80-sc<400>27aggtgacactatagaatactacggacgaggggttg35<210>28<211>39<212>引物<213>aro80-sc<400>28gtacgactcactatagggactctatgagttcaatcgcct39<210>29<211>36<212>引物<213>aro80-sb<400>29aggtgacactatagaatatatcgcccagcatgatta36<210>30<211>42<212>引物<213>aro80-sb<400>30gtacgactcactatagggaatgagtgcaaagagtttacatat42<210>31<211>35<212>引物<213>act1-sc<400>31aggtgacactatagaataacgctcctcgtgctgtc35<210>32<211>37<212>引物<213>act1-sc<400>32gtacgactcactatagggatagaaggctggaacgttaa37<210>33<211>35<212>引物<213>act1-sb<400>33aggtgacactatagaataggcatcacaccttttaca35<210>34<211>35<212>引物<213>act1-sb<400>34gtacgactcactatagggaccggcgtagattggga35当前第1页12