专利名称：一种猪氟烷基因基因型的检测方法
技术领域：
本发明属于生物工程领域，尤其涉及一种基因检测方法，特别涉及一
种猪氟垸基因基因型的检测方法，具体来说是一种应用荧光定量PCR技术
检测猪氟垸基因不同基因型的方法。
背景技术：
猪氟烷基因又称骨骼肌钙离子释放通道基因或兰尼定受体基因，由一 对等位基因Har和Har组成，并构成HalNN (野生型)、HalNn (杂合型)和 Hal (突变型)3种基因型，是导致猪应激综合症的一个主效基因，猪应激 综合症的典型症状为猪恶性高热、肌肉强直、突然死亡，以及屠宰后肉质 变差，形成劣质肉。由于猪应激综合症产生的猪应激死亡、劣质肉已给世 界各国的养猪生产和猪肉的销售加工造成了巨大损失，因此，需要通过检 测来分辨并剔除猪群中氟烷基因的Har基因，以避免猪应激综合症的产生。 目前检测猪氟垸基因的方法主要有生理、生化和分子生物学检测。生理检 测是使幼猪吸入一定浓度的氟烷气体被麻醉后，表现出肌肉痉挛、四肢僵 直的为氟烷阳性(Ha广)，未出现任何症状、四肢松软的为氟垸阴性(HalNN) 或杂合子(HalNn)。此法简单易操作，但检测准确性不高，且只能检出氟烷 阳性。生化检测是通过检测猪血液中氟烷基因连锁的酶或血型基因来间接 选择基因型，此方法准确性较高，但猪不同品种、品系间连锁群关系有差 异，且与氟垸基因位点间有互换，使此法的应用受到很大限制；目前最为
常用的是分子生物学检测方法。文献记载的猪氟烷基因分子生物学检测方
法为普通聚合酶链式反应法(polymerase chain reaction PCR)，主要有 限制性酶切片段长度多态性分析法(restriction fragment length polymorphism PCR-RFLP)和一步PCR法。PCR-RFLP法使用一对引物进行普 通PCR扩增，然后对扩增产物进行限制性酶切，凝胶电泳，根据电泳条带 的差异来判断基因型。该方法操作步骤多，过程复杂，耗时较长，酶切的 完全与否直接影响对结果的判断，酶切的程度也较难控制，不同产物、不 同内切酶的酶切时间都不相同，因此要求实验操作者具有丰富经验。 一步 PCR法，该法使用两对引物在一个反应体系中进行普通PCR扩增，不同的基 因型可以得到不同的PCR扩增产物，然后制作凝胶，电泳PCR产物判断基 因型。相对PCR-RFLP方法，该方法不需要酶切，操作相对简单，但由于使 用两对引物扩增产物，容易对PCR扩增效率和结果的判断产生不利影响。 另外，以上两种方法都需要制作凝胶，使操作人员接触有毒有害试剂；电 泳的电流强度与时间难以控制，容易电泳失败，导致条带无法看清而影响 基因型的判定。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种猪氟烷基因基因型的检测方 法，所述的这种猪氟烷基因基因型的检测方法要解决现有技术中的检测猪 氟垸基因基因型的方法准确率低、操作步骤多、过程复杂、时间长、检测 试剂有毒的技术问题。
本发明是一种猪氟垸基因基因型的检测方法，其特征在于包括如下步
骤
a) 对猪氟垸基因进行PCR扩增，然后对扩增出的碱基片段进行碱基测 序，确定猪氟烷基因的突变位点，根据突变位点两端的碱基序列设 计两组引物，其中一组引物的上游引物3'端和野生型的基因位点匹 配，另一组引物的上游引物3'端和突变型的基因位点匹配，两组的 下游引物相同；
b) 将待检测猪的样品DNA分别与野生型引物、突变型引物在两个反应 体系中同时进行PCR扩增，扩增后每个样品与每组引物产生一个荧光 信号，即每个样品产生两个荧光信号，随着PCR反应的进行，PCR反 应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环，收 集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测产物量的变化，从 而得到一条荧光信号强度曲线图，根据两个荧光信号的增强先后次 序即可得出猪氟烷基因的基因型。
进一步的，所述的野生型的基因位点的上游引物为5' CAATGGTGTGGC CGT GT 3'，野生型基因位点的下游引物为5， GCC CAG ACC TGG TGA CAT A 3'，突变型基因位点的上游引物为5' CAA TGG TGT GGC CGT GC 3'，突变 型基因位点的下游引物为5' GCC CAG ACC TGG TGA CAT A 3'。
进一步的，在b步骤中，扩增体系为热启动Taq DNA聚合酶O. lU/ul、 dNTPO. 2raM、上下游引物各0. 2uM、样品DNA 50ng/ul以及SYBR Green I染 料(一种结合于小沟中的双链DNA结合染料)、缓冲液，加ddH20至20ul; 扩增反应条件为首先95-C预变性15min，然后94t:变性15sec、 50。C退火 20sec、 72。C复性20sec，共40个循环。
进一步的，当野生型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA
为野生型。
进一步的，当突变型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA 为突变型。
进一步的，当野生型引物和突变型引物的荧光信号同时增强时，即可 得出样品DNA为杂合型。
本发明和已有技术相比，其技术进步是显著的
1. 步骤减少，精度提高
本发明只需将DNA样品进行荧光定量PCR扩增，既可得到检测结果， 减少了酶切、电泳等步骤，避免了由于酶切不完全或电泳电流不稳定等因 素对检测的不良影响。
2. 反应快速，效率增加
本发明采用荧光定量PCR检测方法，2个小时就可得到检测结果，比 原有PCR扩增、酶切、电泳节省约6个小时。
3. 操作环保，人员安全
本发明采用荧光定量PCR检测方法，省略了凝胶电泳步骤，无需使用 丙稀酰胺、溴乙淀等致癌试剂，避免了实验过程中对环境的污染，排除了 实验操作人员的健康隐患。
-
图1是采用本发明的一种猪氟烷基因基因型的检测方法检测到的野生 型猪氟烷基因在PCR扩增过程中的荧光信号变化图。
图2是采用本发明的一种猪氟垸基因基因型的检测方法检测到的突变 型猪氟烷基因在PCR扩增过程中的荧光信号变化图。
图3是采用本发明的一种猪氟烷基因基因型的检测方法检测到的杂合 型猪氟烷基因在PCR扩增过程中的荧光信号变化图。
具体实施例方式
本发明的检测方法包括如下步骤
1. 引物设计
通过对普通PCR扩增出的猪氟垸基因碱基片段进行碱基测序(如SEQ ID NO: l所示)，确定猪氟垸基因的突变位点为第494位的胞嘧啶(C) 突变为胸腺嘧啶(T)，根据突变位点两端的碱基序列设计两组引物，其中 一组的上游引物3'端和野生型的基因位点匹配，另一组的上游引物3'端和 突变型的基因位点匹配；两组的下游引物相同。
引物序列为
野生型上游引物5'CAATGGTGTGGCCGTGT3' 野生型下游引物5' GCC CAG ACC TGGTGACAT A3' 突变型上游引物5'CAATGGTGTGGCCGTGC3' 突变型下游引物5' GCC CAG ACC TGG TGACAT A3'
2. 荧光定量PCR检测
将样品DNA分别与野生型引物、突变型引物在2个反应体系中同时 进行PCR扩增。扩增体系为热启动Taq DNA聚合酶0.1U/ul、dNTP 0.2mM、 上下游引物各0.2uM、样品DNA50ng/ul以及SYBR Green I染料、缓冲液， 加ddH2O至20ul。扩增反应条件为首先95"C预变性15min，然后94°。变 性15sec、 50。C退火20sec、 72。C复性20sec，共40个循环。扩增后每个样 品与每组引物产生一个荧光信号，即每个样品产生两个荧光信号。随着PCR 反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加。每经 过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化可以监测产物 量的变化，从而得到一条荧光信号强度曲线图。因引物3'端和模板是否匹 配直接影响模板的PCR扩增效率，完全匹配的扩增效率高，产生的荧光信 号首先增强，当样品为野生型时，与野生型引物完全区配，使用野生型引 物进行PCR扩增的效率高于使用突变型引物，使用野生型引物的荧光信号 首先增强(见图1);当样品为突变型时，与突变型引物完全区配，使用突 变型引物进行PCR扩增的效率高于使用野生型引物，使用突变型引物的荧 光信号首先增强(见图2);当样品为杂合型时，与两组引物都完全区配， 使用野生型引物与突变型引物进行PCR扩增的效率相同，荧光信号同时增 强(见图3)。根据两个荧光信号的增强先后次序可判断猪氟烷基因的基因 型。
序列表
〈110〉上海市动物疫病预防控制中心
〈120〉 一种猪氟烷基因基因型的检测方法 〈160〉 1
〈170> Patentln version 3，1
〈210〉 1 <211> 660 〈212〉 DNA 〈213〉猪氟烷基因 〈400〉 1
tccagtttgc cacaggtcct accagtcccc actgaattaa ttatttctaa ccacctcatg 60
tatggacaac atccacctgg ccccgaagat gcacgttggt gacccccgcc catccagaac 120
ctcgtcttgg tctccgtgct ctcgcactga cccggccttt tctgctgatg cccgatccca 180
tcccccacag ccccctgctg cctttcctcc tctgctgatg cccgatccca tcccccacag 240
ccccctgcgt ctcaccagac ctttctcttt gaccttgatc tccctgtgtc atccctgacc 300
ttcccgcttt caccacctct tctcagtcac atccccacct cccaccctgg gacatcatcc 360
ttctggcttc ccaccctggg tcttccatgg accacaccct ccccgcaagt gccctcacac 420
cttgacctct gaccttgacc cctaggtgct ggatgtcctg tgttccctgt gtgtgtgcaa 480
tggtgtggcc gtgcgctcca accaagatct cattactgag aacttgctcc ctggccgcga MO
gcttctgctg cagacaaacc tcatcaacta tgtcaccagg tctggccccc caacctttga 600
ccccagagct tagaaccctc caccaccccg ccccgactca gagactccac tccggtgaat 660
权利要求
1.一种猪氟烷基因基因型的检测方法，其特征在于包括如下步骤a)对猪氟烷基因进行PCR扩增，然后对扩增出的碱基片段进行碱基测序，确定猪氟烷基因的突变位点，根据突变位点两端的碱基序列设计两组引物，其中一组引物的上游引物3’端和野生型的基因位点匹配，另一组引物的上游引物3’端和突变型的基因位点匹配，两组的下游引物相同；b)将待检测猪的样品DNA分别与野生型引物、突变型引物在两个反应体系中同时进行PCR扩增，扩增后每个样品与每组引物产生一个荧光信号，即每个样品产生两个荧光信号，随着PCR反应的进行，PCR反应产物不断累计，荧光信号强度也等比例增加，每经过一个循环，收集一次荧光信号，通过荧光信号的强度变化监测产物量的变化，从而得到一条荧光信号强度曲线图，根据两个荧光信号的增强先后次序即可得出猪氟烷基因的基因型。
2. 如权利要求1所述的一种猪氟烷基因基因型的检测方法，其特征在于 所述的野生型的基因位点的上游引物为5' CAA TGG TGT GGC CGT GT 3'， 野生型基因位点的下游引物为5' GCC CAG ACC TGG TGA CAT A 3'，突 变型基因位点的上游引物为5' CM TGG TGT GGC CGT GC 3'，突变型基 因位点的下游引物为5' GCC CAG ACC TGG TGA CAT A 3'。
3. 如权利要求1所述的一种猪氟垸基因基因型的检测方法，其特征在于 在b步骤中，扩增体系为热启动T叫DNA聚合酶O. lU/ul、三磷酸脱氧核糖核苷酸0.2mM、上下游引物各0.2uM、样品DNA 50ng/ul以及SYBR Green I染料、缓冲液，加ddH20至20ul;扩增反应条件为首先95。C变 性15min,然后94。C变性15sec、 50。C退火20sec、 72。C复性20sec，共 40个循环。
4. 如权利要求1所述的一种猪氟烷基因基因型的检测方法，其特征在于 当野生型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为野生型。
5. 如权利要求1所述的一种猪氟烷基因基因型的检测方法，其特征在于 当突变型引物的荧光信号首先增强时，即可得出样品DNA为突变型。
6. 如权利要求1所述的一种猪氟垸基因基因型的检测方法，其特征在于 当野生型引物和突变型引物的荧光信号同时增强时，即可得出样品DNA 为杂合型。
全文摘要
本发明提供了一种猪氟烷基因基因型的检测方法，根据猪氟烷基因突变位点两端的碱基序列设计两组不同的引物，将样品DNA分别与两组引物同时进行PCR扩增，通过PCR扩增产物的荧光信号强度变化监测产物量的变化，从而判断其基因型。本发明要解决现有技术中的检测猪氟烷基因基因型的方法准确率低、操作步骤多、过程复杂、时间长、检测试剂有毒的技术问题，提高了检测准确性，简化了操作程序，避免了有毒有害试剂的使用。
文档编号G01N21/64GK101358245SQ20081020015
公开日2009年2月4日 申请日期2008年9月19日 优先权日2008年9月19日
发明者炜 刘, 吴昊旻, 李建颖, 马芳芳, 黄国庆 申请人:上海市动物疫病预防控制中心