Hcv基因型3复制子的制作方法
【专利摘要】本发明提供了基因型3的丙型肝炎病毒（HCV）的复制子。这些复制子包括产生HCV的体外复制能力的适应性变异。还提供了基因型3复制子的制备方法和利用这些复制子筛选抗病毒药剂的方法。
【专利说明】HCV基因型3复制子
[0001]相关申请的相互引用
[0002]根据美国法典第35篇第119 (e)节，本申请要求享有2011年7月6日提交的美国临时申请序列号61/504，853及2011年7月20日提交的序列号61/509，989的权益，其中的每一个的内容均通过引用以其整体并入本公开。
【技术领域】
[0003]本公开涉及基因型3的丙型肝炎复制子(replicon)，以及制备和使用该复制子的方法。 【背景技术】
[0004]慢性丙型肝炎病毒(HCV)感染仍然是全世界约1.6亿感染者的巨大全球健康负担。目前的护理标准是聚乙二醇干扰素加利巴韦林(ribavirin)的24-48周疗程。由于此治疗方案的局部疗效及较差的耐药性，新的抗病毒药剂的开发和研制一直在紧张的进行中。最近，这些努力以FDA审核批准两种NS3蛋白酶抑制剂(波普瑞伟和特拉匹韦)与聚乙二醇干扰素和利巴韦林联合使用以用于治疗慢性基因型1HCV感染而告终。许多其它抑制剂正处于进一步临床开发中，然而，大多数还是被研制用于治疗基因型1感染。
[0005]HCV是一种正链RNA病毒，显示极大的遗传多样性。已报道有6种主要基因型(SP基因型1-6)以及多种亚型(如基因型la、lb、lc等)。基因型1、2和3具有世界范围的分布。基因型la或lb通常主要在北美、南美、欧洲和亚洲。然而，基因型2和3在这些地区也是常见的，并且可构成20-50%的感染。基因型4a主要在中东和许多非洲国家；高达15%的埃及人口感染有HCV，并且93%的感染是基因型4。基因型5在南非很普遍，而基因型6在亚洲更常见。尽管多数大陆和国家具有一种“主要”基因型，但感染的人群几乎普遍是多种基因型的混合感染。此外，由于大规模移民和普遍的静脉用药，HCV感染的地理分布和多样性(流行病学)在不断演变。例如，基因型4a已明显传播到欧洲中部和北部。这就带来了临床挑战，因为对于直接抗病毒药物和包括当前护理标准的免疫调节疗法两者，各种基因型的响应不同，这是有据可查的。
[0006]HCV复制子是来源于HCV基因组的自复制RNA序列，并且一直是作为分子病毒学研究和药物研发的主要工具(workhorse)。迄今为止，已由两种基因型和三种亚型(基因型la、lb和2a)建立了复制子。这些复制子在药物开发和研制的多个方面都是极其重要的，包括新型抑制剂类型的识别、临床候选药物的优化和临床耐药性的表征。最近，研发对所有主要HCV基因型有效的新一代药物的兴趣正在持续增长。理想的是，对“泛基因型(pan-genotypic)”药物和治疗方案的审批将极大地简化HCV的治疗。
[0007]寻求泛基因型治疗方案的一个关键步骤将是研制使得能够研究所有主要基因型和亚型的体外工具。然而，来源于其它主要基因型(即除基因型la、lb或2a以外的那些基因型)序列的复制子至今还未产生。尤其是，尽管基因型3HCV在中东、北非和欧洲的世界范围内流行，然而基因型3复制子至今未被描述。
【发明内容】
[0008]出乎意料地发现，通过将亚基因组基因型3cDNA转录和电穿孔至HCV允许细胞系(受纳细胞系，permissive cell line)可得到稳定复制基因型3复制子的克隆细胞系。与野生型病毒对比，已从这些克隆物中识别了适应性变异(adaptive mutation)。当通过定点诱变改造(engineer)这些变异并引入到细胞系中，随之而来的是HCV基因型3的复制。一种此类适应性变异是在NS3中的N607S，另一种此类适应性变异是在NS3中的P89L。强健(稳健，robust)基因型3复制子体系的建立为促进药物开发和研制工作提供了有力工具。
[0009]因此，本发明的一个实施方式提供了能够在真核细胞中复制的基因型3丙型肝炎病毒(HCV)RNA构建体，其中RNA序列包括5’ NTR,内部核糖体进入位点(IRES)，编码NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的一种或多种的序列，以及3’ NTR。
[0010]一方面，构建体包括在NS3、NS4A、NS4B、NS5A或NS5B中的适应性变异。另一方面，变异包括在2204位置上的异亮氨酸。又一方面，在NS3中的变异包括607残基上的丝氨酸。
[0011]又一方面，在NS3中的变异包括89残基上的亮氨酸。在某些方面，变异还包括41残基上的一个或多个精氨酸、166残基上的苏氨酸、379残基上的苏氨酸、534残基上的甘氨酸、583残基上的谷氨酸、和/或1残基上的半胱氨酸。又一方面，变异还包括表7-表9中提供的更多种中的一种。
[0012]此外，还提供了转录为RNA构建体的DNA、包括RNA构建体的病毒颗粒、以及含有这种DNA或RNA的细胞。
[0013]在另一个实施方式中，还提供了 HCV基因型3的NS3蛋白质，包括607残基上的丝氨酸和/或89残基上的亮氨酸。在另一个实施方式中，提供了还包括2204位置上的异亮氨酸的NS3蛋白。还提供了编码这些蛋白质的多核苷酸和特异性识别蛋白质的抗体。
[0014]在本发明的另一个实施方式中，提供了一种包括基因型3丙型肝炎病毒(HCV)RNA的分离细胞，其中基因型3丙型肝炎病毒(HCV) RNA是在细胞中复制的。一方面，在细胞中不存在编码RNA的DNA构建体。另`一方面，细胞包括至少10个拷贝的RNA，或者可替换地至少约 100、500、1000、2000、5000、10，000、lxlO5、lxlO6、lxlO7、lxlO8 或 lxlO9个拷贝的 RNA。在这些方面中的任一个中，RNA可以是亚基因组HCV序列或全长HCV序列，并且可以包括如上所述的一个或多个适应性变异。
[0015]还提供了提高基因型4HCV病毒RNA在真核细胞中的复制能力的方法，包括用丝氨酸取代NS3的607残基和/或用亮氨酸取代NS3的89残基。进一步的变异可以包括41残基上的一个或多个精氨酸、166残基上的苏氨酸、379残基上的苏氨酸、534残基上的甘氨酸、583残基上的谷氨酸、和/或1残基上的半胱氨酸或表7-表9中提供的那些。
[0016]在一个实施方式中，还提供了一种识别抑制基因型3HCV的复制或活性的药剂的方法，包括将任何以上实施方式中的细胞与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的复制减少或活性降低表明该药剂抑制HCV的复制或活性。可替换地，该方法包括将以上实施方式的任一个中的细胞裂解液与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的活性降低表明该药剂抑制HCV的活性。
【专利附图】
【附图说明】[0017]与附图一起阅读以下详细描述，可以对本发明有最好的理解。附图包括以下各图:
[0018]图1是基因型3a复制子构建体的示意图。S523a链(登录号:⑶814264)复制子编码新霉素(A)或海肾荧光素酶(Rluc)-新霉素融合报告子(reporter) (B)。合成的复制子并入以下要素，从5’至3’:S525’ UTR ;新霉素磷酸转移酶II基因(neo)或Rluc-Neo基因；脑心肌炎病毒(EMCY) IRES ；S52的NS3-NS5B多聚蛋白区，包括NS5A适应性变异(S2204I);和S52的3’UTR ;实心方框表示HCV核心序列。圆点阴影方框表示HCV多聚蛋白序列。“ + ”表示S2204I适应性变异。5，和3，非翻译区(NTR)和EMCV IRES也有表示。
[0019]图2示出了在暴露于NS3蛋白酶抑制剂化合物C时GT3a复制子NS3蛋白酶活性对其响应的数据。将lxlO5个GT3a复制子细胞分离，并使其于室温下在2.4ml用150mM的NaCl增补的lx Promega荧光素酶裂解缓冲液中裂解15分钟。然后，将细胞裂解液分布于每孔体积为80 μ 1的96孔板上。抗病毒药物稀释液是在DMS0中配制的，浓度为最终所需浓度(5ηΜ或50ηΜ)的10倍。然后，在每孔细胞裂解液中加入部分(10 μ 1)稀释的化合物C，并且将板放在平板振荡器(摇床，shaker)上，在室温下温育10分钟。之后，将10 μ 1的
1μ Μ用铕标记的NS3底物(substrate)加入每个孔中。收集蛋白酶活性数据，数据表示为相对于DMS0对照组的抑制百分数。
[0020]图3示出了在基因型3a复制子细胞系中的强健NS5A表达。将各自0.5xl06个稳定的GT3a、GTla、GTlb和GT2a复制子细胞和1C细胞分离，并在100 μ 1的SDS加载缓冲液(loading buffer)中完全裂解。取12微升的裂解液，进行SDS-PAGE和蛋白印迹(Westernblot)分析。印迹用一级抗-NS5A抗体(Apath ；1:3000稀释液)和二级抗-小鼠抗体染色(来自 L1-C0R 的 IRDye800CW 山羊抗-小鼠 IgG (H+L)，1:10000 稀释液)。然后，用 Odyssey成像系统(L1-C0R, Lincoln,Nebraska)分析染色。印迹还需用抗-BiP抗体(Abeam, 1:1000稀释液)和二级抗-兔抗体(来自`L1-C0R的IRDye800CW Goat抗-兔子IgG(H+L)，1:10000稀释液)共同染色，作为加载对照组。包括的1C细胞作为阴性对照组。在基因型3a复制子细胞克隆中检测到NS5A的强表达，证实这些细胞稳定且强健地复制该复制子。
[0021]图4A-C示出了实施例3中的基因型3a复制子构建体的示意图。基因型3a S52链复制子编码新霉素磷酸转移酶II基因(neo) (A)、海肾荧光素酶(Rluc)-ne0融合报告子(B)或Pi海肾荧光素酶(PiRluc)融合报告子(C)。合成的复制子并入以下要素，从5’至3，:S525/ UTR ；Neo, Rluc-neo 或 P1-Rluc 报告基因；EMCV IRES ；S52 的 NS3-NS5B 多聚蛋白区，包括NS5A适应性变异(S2210I)和S52的3' UTR。表示HCV S52核心序列(coresequence)。Ο表示HCV多聚蛋白序列。“ + ?表示S2210I适应性变异。5'和3'非翻译区(NTR)和EMCV IRES也有表示。
[0022]图5A-B示出了在选定的基因型3a复制子细胞中的NS5A表达。(A)在选定的复制子细胞中的NS5A表达。将两种稳定的基因型3a复制子克隆以及基因型lb复制子细胞分离，并在SDS加载缓冲液中完全裂解。然后将裂解液进行SDS-PAGE和蛋白印迹分析。印迹用一级抗-NS5A抗体(Apath ； 1:3000稀释液)和二级抗-小鼠抗体染色(来自L1-C0R的IRDye800CW山羊抗-小鼠IgG (H+L)，1:10000稀释液)。印迹还需用抗-BiP抗体(Abcam，1:1000稀释液)和二级抗-兔子抗体(来自L1-C0R的IRDye800CW山羊抗-兔IgG (H+L),1:10，000稀释液)共同染色，作为加载对照组。用Odyssey成像系统(L1-C0R)分析染色。(B)选定的复制子细胞的NS5A免疫染色。用抗-NS5A抗体(红色)和Hoechst33342 (蓝色，指示核)对基因型3a复制子克隆#1染色。将1C细胞染色作为阴性对照组。
[0023]图6示出了选定的基因型3a复制子克隆获得的适应性变异。从基因型3a复制子细胞克隆#1中提取全部细胞的RNA，然后按指定量电穿孔到Huh7-Lunet细胞中。转染的细胞再次悬浮于DMEM培养基中，铺板在直径为100毫米的盘(皿，dish)中，并用0.5mg/ml的G418 (也被称作Geneiiun见，一种氨基糖苷类抗生素)培养。三周以后，菌落盘用4%的甲醛固定，并用0.05%的结晶紫染色。平行转染体外转录的GT3a复制子RNA，用作对照组。
[0024]图7示出了稳定且强健GT3a Rluc-Neo复制子细胞系的建立。通过定点诱变，将NS3中的P89L变异引入到GT3a S52Rluc_Neo构建体中。将GT3a-P89L-Rluc_Neo变异复制子RNA和亲本GT3a-Rluc-Neo复制子RNA (各10微克)转染到1C或Huh7_Lunet细胞中。分别对每次选择的存活菌落数量进行计数。[0025]图8A-B表示在基因型3a荧光素酶细胞克隆中的荧光素酶表达。(A)来源于1C细胞的选定基因型3a复制子细胞克隆。(B)来源于Huh7-Lunet细胞的选定基因型3a复制子细胞克隆。基因型la和基因型lb的稳定复制子细胞也包括在内，用作参考。未转染的1C或Huh7-Lunet细胞也包括在内，用作阴性对照组。60，000个细胞用于海肾荧光素酶的活性检测。
[0026]图9示出了 NS3中的P89L和NS5A中的S232I (S2210I)的组合变异增强基因型3a复制子的复制。通过定点诱变，分别将NS3中的P89L变异、以及NS3中的P89L和NS5A中的S232I (S2210I)的双重变异引入到基因型3a S52PiRluc构建体中。单独地将所有复制子RNA转染到1C细胞中，并且将IX 104个转染细胞铺板于96-孔板的孔中。在转染后的4小时和第1天到第7天，分析细胞的海肾荧光素酶活性。
[0027]图10A-B中示出的曲线表示基因型3a治愈细胞系(cured cell line)对基因型3a 的复制是高度允许的。将 P1-Rluc-GT3a-P89L (A)、P1-Rluc_GTla 和 P1-Rluc-GTlb (B)复制子RNA转染至1C细胞或基因型3a治愈细胞中。转染后的四天内，每天测定荧光素酶活性。两种治愈复制子细胞系，3a_C2和3a_C3，显示了对基因型3a复制的最高允许度。
[0028]图11A-B示出了 NS3或NS4A中的次级变异增强基因型3a复制子的复制。通过定点诱变，在 GT3a-P89L PiRluc 构建体中引入 NS3 中的 Q41R、A166T、A379T、S534G、K583E 次级变异，或者NS4A中的S1C次级变异。单独将复制子RNA (以P1-Rluc-GTlb为对照)转染到1C (A)或3a-C3 (B)治愈细胞中，且将1 X 104个转染细胞铺板于96-孔板中的每个孔中。在转染后的4小时及7天中的每天，分析细胞的海肾荧光素酶活性。图中显示的数据是来自至少两次独立实验的典型实验。
【具体实施方式】
[0029]在更详细地描述本发明之前，将首先定义以下术语。
[0030]应当理解，本发明并不限于所描述的特定实施方式，当然，可以有所变化。还应理解，在本文中使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而非意图限制，因为本公开内容的范围将仅由所附的权利要求来限定。
[0031]需注意，除非在上下文中另有明确规定，在本文中及在所附权利要求中使用的单数形式“一”、“一种”和“该”包括复数对象。因此，举例来说，提及“该丝线”包括多个丝线。[0032]1、定义
[0033]除非另有规定，在本文中使用的所有技术或科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。在本文中使用的以下术语具有以下含义。
[0034]在本文使用的术语“包括”或“包含”意在表示组分和方法包括所列举的要素，但不排除其它。当“基本由…组成”用于限定组分和方法时，应表示排除对于为了所述目的而引用的组合具有任何实质意义的其它要素。因此，基本由在本文中限定的要素组成的组合物不排除其它对所要求保护的公开的基本或新特征不具有实质影响的材料或步骤。“由…组成”表示排出超过微量要素的其它成分和基本方法步骤。由所有这些过渡术语中的每一个限定的实施方式在本公开的范围之内。
[0035]当术语“约”用在数值标号，例如，温度、时间、数量和浓度(包括范围)之前时，是指可以相差(+ )或(_) 10%、5%或1%的近似值。
[0036]术语“蛋白质”和“多肽”可交换使用，且其最广泛的含义是指两个或更多个亚单元氨基酸、氨基酸类似物或拟肽的化合物。亚单元可由肽键连接。在另一个实施方式中，亚基可以由其它键连接，例如酯、醚等。蛋白质或肽必须包括至少两个氨基酸，且不限制氨基酸的最大数量，可以包括蛋白质或肽的序列。在本文使用的术语“氨基酸”是指天然和/或非天然或合成氨基酸，包括甘氨酸和其D及L光学异构体，氨基酸类似物或拟肽。下面列出了天然产生的氨基酸的一个字母及三个字母的缩写。如果肽链较短，则三个或更多个氨基酸的肽通常被称作寡肽。如果肽链较长，肽通常被称作多肽或蛋白质。
[0037]
【权利要求】
1.一种能够在真核细胞中复制的基因型3丙型肝炎病毒(HCV)RNA构建体，其中，所述RNA的序列包括5’NTR，内部核糖体进入位点(IRES)，编码NS3、NS4A、NS4B、NS5A、或NS5B中的一种或多种的序列，以及3’ NTR。
2.根据权利要求1所述的RNA构建体，其中，与野生型相比，所述构建体包括在NS3、NS4A、NS4B、NS5A、*NS5B中的适应性变异。
3.根据权利要求2所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在NS3中的残基607上的丝氨酸。
4.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在NS3中的残基89上的亮氨酸。
5.根据权利要求4所述的RNA构建体，其中，所述变异还包括在残基41上的精氨酸、在残基166上的苏氨酸、在残基379上的苏氨酸、在残基534上的甘氨酸、在残基583上的谷氨酸、和/或在残基1上的半胱氨酸。
6.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述变异包括在2204位上的异亮氨酸。
7.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述基因型3HCV是基因型3aHCV。
8.根据前述权利要求中任 一项所述的RNA构建体，还包括用于选择的标记基因。
9.根据权利要求8所述的RNA构建体，其中，所述标记基因是新霉素磷酸转移酶基因。
10.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，还包括报告基因。
11.根据权利要求8所述的RNA构建体，其中，所述报告基因是荧光素酶。
12.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，其中，所述构建体包括，从5’到3’:所述 5’ NTR,所述 IRES,编码 NS3、NS4A、NS4B、NS5A、和 NS5B 的序列，以及所述 3’ NTR。
13.根据前述权利要求中任一项所述的RNA构建体，还包括编码C、E1、或E2中的一种或多种的序列。
14.一种单链或双链DNA，可以转录为权利要求1至13中任一项所述的RNA构建体。
15.一种病毒颗粒，包含权利要求1至13中任一项所述的RNA构建体。
16.—种分离细胞,包含权利要求1至13中任一项所述的RNA构建体或权利要求14所述的DNA。
17.一种HCV基因型3的NS3蛋白，包括在残基607上的丝氨酸。
18.根据权利要求17所述的NS3蛋白，还包括在2204位上的异亮氨酸。
19.一种HCV基因型3的NS3蛋白，包括在残基89上的亮氨酸。
20.根据权利要求19所述的NS3蛋白，还包括在残基41上的精氨酸、在残基166上的苏氨酸、在残基379上的苏氨酸、在残基534上的甘氨酸、在残基583上的谷氨酸、和/或在残基1上的半胱氨酸。
21.—种多核苷酸,编码权利要求17至20中任一项所述的蛋白。
22.根据权利要求21所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸是RNA或DNA。
23.—种RNA或DNA构建体，包括权利要求17至20中任一项所述的多核苷酸。
24.一种细胞，包含权利要求21或22所述的多核苷酸或者权利要求23所述的RNA或DNA构建体。
25.一种抗体，特异性地识别权利要求17至20中任一项所述的蛋白。
26.一种分离细胞，包含在所述细胞中复制的基因型3丙型肝炎病毒(HCV) RNA。
27.根据权利要求26所述的细胞，其中，在所述细胞中不存在编码所述RNA的DNA构建体。
28.根据权利要求26或27所述的细胞，其中，所述细胞包含至少10个拷贝的所述RNA。
29.根据权利要求26至28中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括亚基因组HCV序列。
30.根据权利要求29所述的细胞，其中，所述RNA包括5’NTR，内部核糖体进入位点(11?3)，编码吧3、吧4六、吧48、吧5六、和NS5B的序列，以及3’NTR。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括全基因组HCV序列。
32.根据权利要求26至31中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括在2204位上的异亮氨酸。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括编码NS3的序列，所述NS3包括在残基607上的丝氨酸。
34.根据权利要求26至32中任一项所述的细胞，其中，所述RNA包括编码NS3的序列，所述NS3包括在残基89上的亮氨酸。
35.根据权利要求26至34中任一项所述的细胞，其中，所述细胞是哺乳动物细胞。
36.根据权利要求35所述的细胞，其中，所述细胞是肝瘤细胞。
37.根据权利要求36所述的细胞，其中，所述细胞是Huh71C细胞。
38.一种提高基因型3HCV病毒RNA在真核细胞中的复制能力的方法，包括用丝氨酸取代NS3的残基607。
39.一种提高基因型3HCV病毒RNA在真核细胞中的复制能力的方法，包括用亮氨酸取代NS3的残基89。
40.一种识别抑制基因型3HCV的复制或活性的药剂的方法，包括使权利要求1至13中任一项所述的细胞与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的复制减少或活性降低表明所述药剂抑制所述HCV的复制或活性。
41.根据权利要求40所述的方法，其中， 所述蛋白质是蛋白酶。
42.根据权利要求40或41所述的方法，还包括测定所述RNA的复制或由所述RNA编码的所述蛋白质的活性。
43.一种识别抑制基因型3HCV的活性的药剂的方法，包括使权利要求1至13中任一项所述的细胞的裂解液与候选药剂接触，其中，由RNA编码的蛋白质的活性降低表明所述药剂抑制所述HCV的活性。
44.根据权利要求43所述的方法，其中，所述蛋白质是蛋白酶。
45.根据权利要求43或44所述的方法，还包括测定所述RNA的复制或由所述RNA编码的所述蛋白质的活性。
【文档编号】G01N33/569GK103687869SQ201280033320
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2012年7月5日 优先权日:2011年7月6日
【发明者】威廉四世·E·德拉尼, 程国锋, 于梅, 莫红梅, 徐思民, 阿莫尔纳·科尔萨 申请人:吉利德科学股份有限公司