Hcv的基因型分析的制作方法

专利名称：Hcv的基因型分析的制作方法
技术领域：
本申请涉及用于预测感染了 HCV-Ia的患者对包括干扰素的治疗方案的应答的方法。
背景技术：
丙型肝炎病毒(“HCV”)感染是令人关注的人类医学问题。HCV被认为是非甲型、非乙型肝炎的多数病例的诱因剂，估计其在全球人类中的血清阳性率是3% (A. Alberti 等人，“Natural History of Hepatitis C, "J. Hepatology,31(Suppl. 1), pp. 17-24(1999)).仅仅在美国就有接近四百万个体被感染。(M. J. Alter等人，“The Epidemiology of Viral Hepatitis in the United States,"Gastroenterol. Clin. North Am. ,23, pp. 437-455(1994) ；M. J. Alter "Hepatitis C Virus Infection in the United States, ” J. Hepatology, 31 (Suppl. 1)，pp. 88-91 (1999))。在 20 世纪 90 年代中期引入抗-HCV筛选之前，HCV占美国输血后肝炎病例的80% -90%。在患有失血病症的个体或经常暴露于血液和血液制品的慢性肾衰竭群体中也经常见到HCV的高感染率。在第一次暴露于HCV之后，仅有大约20%的受感染个体患上急性临床肝炎；而在其它人中感染似乎自发地消退。但是在几乎70%的个例中，病毒产生慢性感染，可能持续数十年(S. Iwarson, "The Natural Course of Chronic Hepatitis，，，FEMS Microbiology Reviews,14，pp.201-204 (1994) ；D. Lavanchy, "Global Surveillance and Control of Hepatitis C，” J. Viral Hepatitis, 6, pp. 35-47 (1999)) 0 延长的慢性感染可能导致复发性的和逐渐恶化的肝脏炎症，其经常引起更严重的疾病状态，例如硬化和肝细胞癌 (M. C. Kew,"Hepatitis C and Hepatocellular Carcinoma",FEMS Microbiology Reviews, 14, pp. 211-220(1994) ；I. Saito et. al. , "Hepatitis C Virus Infection is Associated with the Development of Hepatocellular Carcinoma, "Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87, pp.6547-6549(1990))。HCV是包膜病毒，其含有大约9. 5kb的正义单链RNA基因组。基于其基因组结构和病毒粒子特性，HCV被归类为黄病毒科中的单独的属，该科还包括瘟病毒(pestiviruse)和黄病毒(flaviviruse) (Alter, 1995,Semin. Liver Dis. 15 :5-14)。病毒基因组由冗长的 5， 非翻译区(UTR)、编码大约3011个氨基酸的多聚蛋白前体的长开放阅读框和短的3’UTR组成。多聚蛋白前体被宿主和病毒蛋白酶切割以产生成熟的病毒结构性和非结构性蛋白。HCV 编码两种蛋白酶由NS2-NS3区域编码的锌依赖性金属蛋白酶和由NS3/NS4区域编码的丝氨酸蛋白酶。这些蛋白酶是将前体多聚蛋白的特定区域切割为成熟肽所需要的。非结构性蛋白5B即NS5B的羧基半部分含有RNA依赖性的RNA聚合酶。其余的非结构性蛋白NS4B以及NS5A在病毒复制中的确切作用仍然是未知的。干扰素α (干扰素)是食品与药品管理局批准的慢性HCV感染的治疗。干扰素的效应是通过不同的细胞可诱导蛋白介导的，包括双链RNA激活的蛋白激酶(H(R) (Gale 等人，1997，Virology 230:217-227)。仅有8%-12%的具有HCV基因型1的患者具有对于干扰素治疗具有持续的临床病毒学应答(SVR) (Carithers等人，1997，Hepatology26 83S-88S ；Lindsay, 1997, Heptatology 26 :71S-77S) 就产生持续的生物化学和病毒学应答而言，干扰素与鸟苷类似物利巴韦林(RBV)的组合治疗显示比干扰素的单一治疗更优 (Poynard等人，1998，Lancet352 =1426-1432) 0然而，虽然持续应答率显著改善，但是仍有多达60%的具有高效价HCV基因型1的患者对聚乙二醇化的干扰素和利巴韦林治疗无应答。例如，在感染了 HCV-I的患者中应答率低于40%。也报道了来自美国的感染了原型基因型Ia的患者的相似的低应答率(Mahaney等人1994，Hepatology 20 :1405-1411)。与此相反，感染了 HCV基因型-2的患者的应答率接近80% (Fried等人，1995，Semin. Liver Dis. 15 :82-91.)。已经表明完整HCV多聚蛋白的表达抑制人U2-0S骨肉瘤细胞中的干扰素诱导的信号传导(Heim等人，1999，J. Virol. 73 :8469-8475)。尚无报道哪个HCV蛋白负责该效应。干扰素应答和HCV的非结构性5A(NS5A)序列之间的关系是有争议的。对干扰素治疗的应答在HCV亚型之间存在差异，HCV-Ib亚型对于干扰素治疗的抗性最大(Alter等人，1998，MMWR Recomm. Rep. 47 (RR-19) :1_39)。将来自感染了 HCV的患者的干扰素抗性与干扰素敏感性病毒的全长HCV核酸序列进行的比较揭示了对应于NS5A蛋白的羧基末端的错义替换(Enomoto 等人，1995，J. Clin. Invest. 96 :224-230)。NS5A 的对应的 40 个氨基酸的区域(HCV多聚蛋白的氨基酸2209-2M8)被称为干扰素敏感性决定区，或ISDR(Enomoto 等人，1995)。ISDR包含于NS5A蛋白中的区域，已经表明该区域在体外结合并抑制I3KR的功能(Gale 等人，Mol. Cell Biol.，1998，18 :5208-5218)。Enomoto 等人(1996，N. Eng. J. Med. 334 :77-81)提出了一个模型，其中对干扰素治疗有响应的患者具有的病毒在ISDR 中具有多个替换(与干扰素抗性的HCV Ib-J原型序列相比)；而干扰素治疗失败的患者具有的病毒在ISDR中鲜有替换。在公开了来自干扰素抗性和干扰素敏感性病毒的ISDR序列的研究中，有9项研究支持Enomoto模型，并且得出结论在5%的显著性水平，数据提供了足够的证据证明干扰素应答和ISDR中的替换是依赖性的(Enomoto等人，1995，1996 ；Chayama等人， 1997，Hepatology, 25 :745-749 ；Kurosaki 等人，1997，Hepatology 25 :750-753 ；Fukuda 等人，1998，J. Gastroenterol. Hepatol. 13 :412-418 ；Saiz 等人，1998，J. Infect. Dis. 177 839-847 ；Murashima 等人，1999，Scand. J. Infect. Dis. 31 :27-32 ；Sarrazin 等人 1999， J. Hepatol. 30 :1004-1013 ；Sakuma 等人，1999，J. Infect. Dis. 180 :1001-1009)。其它 16 项研究未能得出存在关联的结论(Hofgartner 等人，1997，J.Med. Virol. 53 :118-126 ；Khorsi 等人,1997，J. Hepatol. 27 :72-77 ；Squadrito 等人，1997，Gastroenterology! 13 :567-572 ； Zeuzem 等人，1997，Hepatology 25 :740-744 ；Duverlie 等人，1998，J. Gen. Virol. 79 1373-1381 ；Franguel 等人，1998，Hepatology 28 :1674-1679 ；Odeberg 等人，1998，J. Med. Virol. 56 :33-38 ；Pawlotsky 等人，1998，J. Virol. 72 :2795-2805 ；Polyak 等人，1998， J. Virol. 72 :4288-4296 ；Rispeter 等人，1998，J. Hepatol. 29 :352-361 ；Chung 等人，1999，J.Med. Virol. 58 :353-358 ；Sarrazin 等人 1999，J. Hepatol. 30 :1004-1013 ；Squadrito 等人，1999，J. Hepatol. 30 :1023-1027 ；Ibarrola 等人，1999，Am. J. Gastroenterol. 94 2487-2495 ；Mihm 等人，1999，J. Med. Virol. 58 :227-234 ；Arase 等人，1999，Intern. Med. 38 461-466)。有趣的是，支持关联性的9项研究中有7项是基于来自日本的HCV分离体；而 16项不支持关联性的研究中有15项是基于来自欧洲的分离体和北美洲的分离体。虽然在北美和欧洲的研究中一般没有发现干扰素应答与ISDR序列之间的统计学上显著的关联， 但是有证据证明的确存在一定关系。当把来自单个研究的中间体和突变体类别的ISDR序列组合时，对干扰素的应答率高于具有野生型类别的ISDR序列的患者中的应答率(Herion and Hoofnagle,1997, Hepatology 25 :769-771)。

发明内容
本发明基于以下发现在感染了 HCV-Ia亚型的人类受试者中，在该受试者中演化的病毒NS5A序列与他或她对于包括干扰素的治疗方案的最终应答之间存在显著相关性。在本发明的一个方面，本发明包括使用基于干扰素的治疗来治疗感染了 HCV-Ia 的患者的方法。该方法包括以下步骤a)分析该患者的部分或全部的HCV NS5A基因；和b)确定用于预测对于基于干扰素的治疗的阳性应答的可能性的标准，其中所述标准包括以下一个或多个要素i)与标准NS5A氨基酸序列相比，该患者的HCV NS5A氨基酸序列的干扰素敏感性决定区(ISDR)中的变化数目；和ii)该患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列。具体地，含有在ISDR中具有高度变异性(例如，从共有序列发生3个或更多个改变)和/或在NS5A氨基酸的位置2 处具有甲硫氨酸(M)或谷氨酸(E)的病毒的患者将具有达到对聚乙二醇化干扰素和利巴韦林治疗的迅速病毒学应答(RVR)的高可能性。例如， IFN/RBV治疗使病毒在4周的治疗内降低到目前的检测限值(10IU/ml)以下(RVR)的能力高度预示达到持续病毒学应答(SVR)。相反，感染了不具有ISDR改变或在NS5A氨基酸的位置2 处具有其它氨基酸的病毒的患者达到RVR的可能性较低。在一些实施方式中，该方法还包括基于感染了 HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为b)中的标准的所有要素分配权重参数的步
马聚ο在一些实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是A、L、V、E或M。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是A。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是L。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是E。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是M。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是V。在一些实施方式中，所述标准还包括“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列”这一要素。所述标准包括三个要素中的一个或多个。在一些实施方式中，所述方法还包括基于感染了 HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列”这一要素分配权重参数的步骤。另一方面，除了在ISDR中具有一定数目的改变和在NS5A氨基酸序列的位置2 处具有甲硫氨酸(M)或谷氨酸(E)之外，如果患者感染了在NS5A氨基酸序列的位置311处含有Q、R或A的病毒，则该患者具有达到对聚乙二醇化干扰素和利巴韦林治疗的迅速病毒学应答(RVR)的高可能性。相反，感染了在NS5A氨基酸序列的位置311处不含有Q、R或A 的病毒的患者将具有升高的可能性会对基于干扰素的治疗无病毒学应答。在一些实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是S、P、Q、R或A。在一些实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是S。在一些实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是P。在一些实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是Q。在一些实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是R。在一些实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是A。在一些实施方式中，所述标准NS5A氨基酸序列是H77。在一些实施方式中，所述方法还包括分析该患者的遗传多态性的步骤。在一个实施方式中，该患者的遗传多态性是rsl2979860。在一些实施方式中，分析患者的部分或全部HCV NS5A基因的步骤包括使用聚合酶链式反应仪器扩增部分或全部HCV NS5A基因的一部分的步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括确定该患者是否对基于干扰素的治疗有阳性应答的步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括以下步骤如果该患者被确定为对基于干扰素的治疗有应答，则向该患者给予基于干扰素的治疗。在本发明的另一个方面，本发明提供了干扰素在制备药物中的用途，所述药物用来根据用于预测对于基于干扰素的治疗的阳性应答的可能性的标准治疗感染了 HCV-Ia的患者，其中所述标准包括以下一个或多个要素a)该患者的HCV NS5A氨基酸序列的氨基酸位置226 ；和b)与标准NS5A氨基酸序列相比，该患者的NS5A氨基酸序列的干扰素敏感性决定区中的变化数目。在一个实施方式中，基于感染了 HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为所述标准中的要素分配权重参数。在一个实施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是A、L、V、M或E。在一个实施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是A。在一个实施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是L。在一个实施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是E。在一个实施方式中，NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是M。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是V。在一些实施方式中，所述标准还包括“患者的NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基”这一要素，其中所述标准包括三个要素中的一个或多个。在一些实施方式中，基于感染了 HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为所述标准中的元素分配权重参数。在一些实施方式中，患者的NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基是S、P、 Q、R或A。在一个实施方式中，位置311处的氨基酸残基是S。在一个实施方式中，位置311 处的氨基酸残基是P。在一个实施方式中，位置311处的氨基酸残基是Q。在一个实施方式中，位置311处的氨基酸残基是R。在一个实施方式中，位置311处的氨基酸残基是A。在一个实施方式中，所述药物包括一种或多种抗-HCV试剂。在一个实施方式中，所述药物包括利巴韦林、HCV蛋白酶抑制剂和HCV聚合酶抑制剂。在一个实施方式中，所述HCV蛋白酶抑制剂是BMS-790052、MK 7009、BI 201335、 SCH900518、VX-985、SCH503034、VX-950、R7227、ITMN-191、ACH-1095 或 TMC435350。在另一个实施方式中，所述HCV蛋白酶抑制剂是VX-950。在另一个实施方式中，所述HCV蛋白酶抑制剂是SCH50303。在另一个实施方式中，所述HCV蛋白酶抑制剂是VCH-916、IDX-184、 VX-222、filibuvir, ABT-033、ABT-072、GS 190、ANA598、MK-3281、BMS-650032 或 R7128。在一个实施方式中，所述药物还包括NS4A抑制剂、NS4B抑制剂、亲环蛋白抑制剂及其组合。NS4A抑制剂、NS4B抑制剂和亲环蛋白抑制剂的实例分别是ACH-806 ；克立咪唑； 和 Debio-025 及 NIM811。在一个实施方式中，基于干扰素的治疗选自Roferon -A、 Pegasys 、Illtroil 禾口 Peg-Intron。在一个实施方式中，所述标准NS5A氨基酸序列是H77。在一些实施方式中，所述标准还包括患者的遗传多态性。在一个实施方式中，患者的遗传多态性是rsl2979860。在本发明的另一个方面，本发明提供了为感染了 HCV-Ia的患者指定治疗方案和/ 或治疗持续时间的方法。该方法包括以下步骤a)分析该患者的部分或全部的HCV NS5A基因；和b)确定用于预测对于基于干扰素的治疗的阳性应答的可能性的标准，其中所述标准包括以下一个或多个要素i)与标准NS5A氨基酸序列相比，该患者的HCV NS5A氨基酸序列的干扰素敏感性决定区中的变化数目；和ii)该患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列；和c)确定该患者的治疗方案和/或治疗持续时间。在一些实施方式中，该方法还包括基于感染了 HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为b)中的标准的所有要素分配权重参数。在一些实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是A、L、V、E或M。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是A。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是L。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是E。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是M。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是V。
在一些实施方式中，该方法包括还包括“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311 处的氨基酸残基的序列”这一要素的标准。所述标准包括三个要素中的一个或多个。在一些实施方式中，该方法还包括基于感染了 HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列”这一要素分配权重参数的步骤。在一些实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是S、P、Q、R或A。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是S。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是P。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是Q。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是R。在一个实施方式中，患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是A。在一些实施方式中，所述标准NS5A氨基酸序列是H77。在一些实施方式中，确定患者的治疗方案和/或治疗持续时间的步骤包括向患者施用HCV蛋白酶抑制剂、第二 STAT-C、干扰素、利巴韦林或其组合。在一个实施方式中，向患者给药的步骤包括向患者施用干扰素和利巴韦林，持续12周、36周或48周。在一个实施方式中，向患者给药的步骤包括向患者给药持续12周。在一个实施方式中，向患者给药的步骤包括向患者给药持续36周。在一个实施方式中，向患者给药的步骤包括向患者给药持续 48周。在一些实施方式中，所述HCV蛋白酶抑制剂是SCH503034、VX-950、R7227、 ITMN-191、ACH-1095或TMC435350。在一个实施方式中，所述HCV蛋白酶抑制剂是 SCH503034。在一个实施方式中，所述HCV蛋白酶抑制剂是VX-950。在一些实施方式中，所述第二 STAT-C是HCV聚合酶抑制剂、NS4A抑制剂、NS4B 抑制剂或亲环蛋白抑制剂。在一些实施方式中，所述第二 STAT-C是VCH-916、IDX-184、 VX-222、filibuvir, ABT-033、ABT-072、GS190、ANA598、MK-3281、BMS-650032、ACH-806、克立咪唑、Debio-025、NIM811 或 R7128。在一些实施方式中，所述方法还包括分析该患者的遗传多态性的步骤。在一个实施方式中，遗传多态性是rsl2979860。在一些实施方式中，分析患者的部分或全部HCV NS5A基因的步骤包括使用聚合酶链式反应仪器扩增部分或全部HCV NS5A基因的一部分的步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括确定患者是否对基于干扰素的治疗有阳性应答的步骤。在一些实施方式中，所述方法还包括以下步骤如果患者被确定为对基于干扰素的治疗有应答，则向该患者给予基于干扰素的治疗。


图1中的图显示了受试者的Peg-IFN和RBV应答水平。到第4周时病毒RNA载量低于检测限值(LOD)的受试者被称为迅速病毒应答者(RVR)；而到第12周时RNA载量下降至低于LOD的受试者被称为完全早期病毒应答者(cEVR)。部分早期病毒应答者(pEVR)为第12周时RNA载量至少下降2-log ；无应答者(NR)在研究过程中的RNA载量下降小于 2-log。每个患者组的趋势线显示了每个时间点的平均值士标准偏差。图2中的图显示了 NS5A的氨基酸排列排列，其被分成41个重叠的区段，每个区段为40个氨基酸。第一个窗口跨越氨基酸6-45 ；第二个是氨基酸16-55 ；第三个是沈_65， 等等。Logisitic回归用于确定IFN敏感性(即，患者结果组，顺序评分)是否是任意这些窗口内的遗传变异的函数(α = 0. 05，使用Boneferroni程序来控制I型误差)。将从 Logisitic回归得出的ρ-值(显著性水平)针对NS5A氨基酸的长度作图，将每个窗口的显著性水平对应于其中间的残基(例如，跨越残基6-45的窗口的ρ-值0. 6934对应于残基 26) 0已经被提出作为“干扰素敏感性决定区”(ISDR;AA 236-275)的40个残基的区段以灰色方框标示出来。对应于该窗口中心的点(P = 0. 0003)是唯一满足“其中的IFN敏感性是突变数目的函数”的区域，其是显著的，其Bonferroni校正的α等于0. 05。图3中的图显示了每个应答类别中的ISDR突变数目。相对于每个其它结果组，迅速病毒应答者(RVR)中的感染性病毒粒子的ISDR显著富含突变，其它结果组彼此并无显著差异，如通过6个独立的Marm-Whitney U-检验配对比较所确定(在图的顶部以‘a’和‘b’ 标出了具有显著差别的组)。虽然统计学测试中使用的是基于秩和(rank-sum)的非参数比较，但是显示了每个组的平均值菱形，以其高度显示了平均值的95%置信区间，以其宽度显示了相对样本大小。浅灰色条表示数据集的总体平均值。图4显示了饼状图，其显示了在ISDR中具有0、1、2和3个或更多个突变的病毒学结果组的组成，在图下方标注了每个图。在图上方指明了每组的样本大小，并且以每幅图的相对面积来表示。在图左侧方框中给出了图例(RVR是迅速病毒应答；cEVR是完全早期病毒应答；pEVR是部分早期病毒应答；NR是无应答)。图5显示了 H77的核酸序列(图5a)和氨基酸序列(图恥)。图6显示了对基于干扰素的治疗的不同程度应答的受试者的核酸序列。图7显示了图6的受试者的氨基酸序列。
具体实施例方式研究了全长NS5A氨基酸中的病毒序列多样性对于来自美国的基因型Ia的患者中的干扰素和RBV应答的影响。已经提出NS5A氨基酸通过诱导准种(quasispecies)而影响IFN应答(见综述 Macdonald 2004, Tan 2001, Hofmann 2004)。虽然NS5A在HCV生命周期中的确切作用是未知的，但是已经证明NS5A是催化HCV基因组复制的多蛋白复合体的关键部分(Egger 2002)。不依赖于其在HCV复制中的直接作用，NS5A还能结合多种细胞信号传导分子，这可能继而影响细胞生长的调节并抑制细胞凋亡应答(综述MaCdonald，2004)。另外，已经证明NS5A结合干扰素诱导的双链RNA (dsRNA)激活的蛋白激酶 PKR(Gale 1997)。PKR通过与dsRNA结合而被激活。已经知道，一旦被激活，PKR会使蛋白合成启动因子2的α亚基2 (eIF-2 α)磷酸化，导致病毒蛋白翻译的阻止(Macdonald 2004)。 通过结合eIF-2a，NS5A干扰PKR的二聚体化和自动磷酸化，因此抑制IFN诱导的宿主病毒应答途径(Gale 1997)。词语“NS5A基因的位置676、677和678处的核苷酸”意思是具有如图5和6所示的序列(作为用于比对的参考序列)的HCV-Ia NS5AcDNA或RNA的核苷酸位置676、677和 678处的基因座，其中图5和6中所示的序列代表HCV-Ia基因组核苷酸序列的核苷酸位置 675与核苷酸位置679之间的NS5A编码区。词语“NS5A蛋白的位置2 处的氨基酸”意思是具有如图5和6所示的序列(作为用于比对的参考序列)的HCV-Ia NS5A蛋白的位置2 处的氨基酸，其中图5和6所示的序列代表NS5A蛋白的多肽序列，其跨越HCV-Ia基因组多聚蛋白的氨基酸位置225至氨基酸位置227。词语“NS5A基因的位置931、932和933处的核苷酸”意思是具有如图5和6所示的序列(作为用于比对的参考序列)的HCV-Ia NS5AcDNA或RNA的核苷酸位置931、932和 933处的基因座，其中图5和6:1中所示的序列代表HCV-Ia基因组核苷酸序列的核苷酸位置930与核苷酸位置9；34之间的NS5A编码区。词语“NS5A蛋白的位置311处的氨基酸”意思是具有如图5和7所示的序列(作为用于比对的参考序列)的HCV-Ia NS5A蛋白的位置311处的氨基酸，其中图5和7所示的序列代表NS5A蛋白的多肽序列，其跨越HCV-Ia基因组多聚蛋白的氨基酸位置310至氨基酸位置312。词语“ISDR”意思是(1)具有如图5、6和7所示的序列(作为用于比对的参考序列)的HCV-Ia NS5A cDNA或RNA的位置705和拟6之间的核苷酸序列；和(2)具有如图5、 6和7所示的序列的HCV-laNS5A蛋白的位置235和276之间的氨基酸序列。但是，ISDR的氨基酸序列中的位置可能有微小变化。术语“核苷酸替换”和“核苷酸变异”在本文中相互替代地使用；是指特定基因的参考核苷酸序列中某位置处的核苷酸改变。术语“氨基酸突变”和“氨基酸替换”在本文中相互替代地使用；是指由于编码参考蛋白的参考核苷酸序列中的核苷酸替换或变异而导致的参考蛋白序列中某位置处的氨基酸改变。术语“基因分型”意思是确定特定基因座上的核苷酸。术语“基于干扰素的治疗”是指包括施用干扰素的HCV治疗。术语对使用干扰素的治疗的“应答”是指对于施用的药剂的想要的应答。术语对使用干扰素治疗的“持续病毒学应答”(SVR)和“完全应答”在本文中相互替代地使用；是指在治疗结束后和在治疗结束后对周，通过RT-PCR在感染的受试者的样品中没有可以检测到的HCVRNA。或者，“持续病毒应答”或“SVR”意思是在给药完成之后，病毒RNA水平保持在不可检出的水平。“SVR12”意思是给药完成之后12周，病毒RNA水平保持在不可检出的水平。“SVR24”意思是给药完成之后M周，病毒RNA水平保持在不可检出的水平。术语“完全早期病毒学应答”(cEVR)定义为在治疗的第12周，HCV载量(血液中的HCV颗粒数目)至少减少99% ( > 21ogl0)。如本文使用的术语“迅速病毒学应答”(RVR)定义为在治疗第4周之后，在血液中检测不到HCV。90%的具有RVR的患者将具有SVR，一些患者可能仅需要M周的治疗。具有“部分早期病毒学应答”(pEVR)的受试者的HCV RNA水平下降至1/100，但是继续具有可检出的HCV RNA。相对于具有cEVR的受试者，此类患者较不容易达到SVR。
术语对使用干扰素的治疗的“病毒学无应答”和“无应答”(NR)在本文中相互替换地使用；是指在整个治疗过程中和治疗结束时通过RT-PCR和其它已知的常规方法在感染的受试者的样品中存在可检出的HCV RNA。或者，如本文使用的“无应答”包括对于标准的 peg-IFN与RBV治疗未达到或维持持续病毒学应答(SVR)(在治疗完成后M周检测不到HCV RNA)的患者，以及缺乏应答的患者。缺乏应答定义为由于未达到检测不到的HCV病毒水平， 或者由于中止治疗后的复发，从HCV RNA的基线水平下降<2-logl0。如上文所定义，检测不到的HCV RNA意思是HCV RNA以低于10IU/mL存在，如通过目前商业上可获得的测定法所测，例如，如通过Roche COBAS TaqMan HCV/HPS测定法所测。例如，“无应答”包括对标准的peg-IFN与RBV治疗的“第4周零应答者”、“第12周零应答者”、“第M周零应答者”、 “第沈至第48周零应答者”、“部分应答者”、“病毒反跳应答者”和“复发应答者”。“第4周零应答者”定义为在标准的peg-IFN与RBV治疗的第4周，HCV RNA的下降< I-IoglO (没有彡I-IoglO的从HCV RNA基线的下降)。“第12周零应答者”定义为在标准的peg-IFN与 RBV治疗的第12周，HCV RNA的下降< 2_logl0 (在第12周，未达到早期病毒应答(EVR)， 没有彡2-loglO的从HCVRNA基线的下降)。“第M周零应答者”定义为在标准的peg-IFN 与RBV治疗的第M周，具有可检测的HCV RNA的受试者。“第沈至第48周零应答者”定义为在标准的peg-IFN与RBV治疗的第沈至48周，具有可检测的HCV RNA的受试者。“部分应答者”定义为，在标准的peg-IFN与RBV治疗的第12周时> 2-loglO的下降，但是在治疗的第M周时具有可检测的HCV RNA。“病毒反跳应答者”定义为在peg-IFN与RBV治疗过程中，达到检测不到的HCV-RNA之后出现的可检测的HCV-RNA。病毒反跳定义为i)与治疗时记录的最低值相比，HCV RNA的增加> I-IoglO ；或ii)在之前的时间点具有检测不到的 HCV RNA的患者中，HCV RNA水平> 100IU/mL。病毒反跳应答者的具体实例包括在第4周至第M周之间发生病毒反跳的患者。“复发应答者”是在完成peg-IFN与RBV(之前的治疗) 之后(一般是最后一次给药后6周或6周内)具有检测不到的HCV RNA、但是在回访时复发的患者(例如在M周后的回访)。复发应答者可能在peg-IFN与RBV治疗48周之后复发。典型的peg-IFN与RBV治疗方案包括12周、24周、36周和48周的治疗。商业上可以获得多种类型的peg-IFN，例如，装在小瓶中的配制的预先测定的溶液；或作为冻干(冷冻干燥)的粉末，与单独的稀释剂(混合液体)。聚乙二醇化的干扰素 α-2b (Peg-Intron )和α-2a (Pegasys )是典型的实例。可用于本发明的多种类型的干扰素是商业上可获得的，包括多种剂型和制剂类型(参见，例如，以上描述的干扰素的具体实例)。例如，商业上可以获得多种类型的干扰素装在小瓶中的配制的预先测定的溶液；或作为冻干(冷冻干燥)的粉末，与单独的稀释剂(混合液体)。聚乙二醇化的干扰素a-2b(Peg-Intron )和α-h(Pegasys )与其它干扰素的区别在于它们具有与其结合的聚乙二醇(PEG)分子。PEG被认为会使干扰素在体内保持更长的时间，因此延长了干扰素的效应以及其有效性。聚乙二醇化的干扰素一般是通过皮肤下(皮下)注射施用。 Pegasys 是装在预注入的注射器或装在小瓶中的可注射的溶液。Pegasys 的通常剂量是180 μ g，一周施用一次。PEG-Intron —般是预注入的笔，其包含粉末和无菌水； 通过推下笔使其混合在一起。PEG-Intron 的剂量一般取决于体重一1. 5μ g/kg(总共是大约50至大约150 μ g的范围内)，一周施用一次。在一些实施方式中，本发明中使用聚
14乙二醇化的干扰素，例如聚乙二醇化干扰素α- 或聚乙二醇化干扰素-a 2b。通常而言， 可以根据其商售产品标签中描述的剂量方案施用干扰素。利巴韦林通常口服给药，目前商业上可获得药片形式的利巴韦林。利巴韦林药片的一般的标准的日剂量(例如大约200mg的药片)是大约SOOmg至大约1200mg (根据其商售产品标签中描述的剂量方案)。术语“STAT-C”是针对丙肝的特别靶向抗病毒治疗的缩写。这种治疗模式包括靶向丙肝复制所需的两种酶即丝氨酸蛋白酶和聚合酶的药物，其被称作丙肝蛋白酶和聚合酶抑制剂。术语“样品，，或“生物样品，，是指从个体中分离的组织或液体样品，包括但不限于， 例如，活组织检查样品、血浆、血清、全血、脊髓液、淋巴液、皮肤的外面的部分、呼吸道、肠道和泌尿生殖道、眼泪、唾液、乳液、血细胞、肿瘤、器官。还包括体外细胞培养物成分的样品 (包括但不限于，从细胞在培养基中的生长获得的条件化培养基、推断的被病毒感染的细胞、重组细胞和细胞成分)。本文所称的干扰素包括但不限于，α-干扰素、β-干扰素、Y-干扰素和聚乙二醇化的衍生的干扰素-α化合物。在一些实施方式中，术语“干扰素”和“干扰素-α ”在本文中相互替换地使用；是指高度同源的物种特异性的蛋白家族，其抑制病毒复制和细胞增殖并调节免疫应答。典型的适宜的干扰素包括但不限于，重组干扰素α-2b，例如可以从 Schering Corporation, Kenilworth, N. J.Intron TM AzFiftS ；StIzFiftS α -2a, 例如可以从Hoffmann-La Roche, Nut ley, N.J.获得的Roferon TM_A干扰素；重组干扰素 α-2C,例如可以从Boehringer Ingelheim Pharmaceutical, Inc. ,Ridgefield,Conn.获得的Berofor TMα 2干扰素；干扰素α-η1，其为纯化的天然α干扰素的共混物，例如可以从 Sumitomo, Japan 获得的 Sumiferon TM 或者可以从 Glaxo-Wellcome Ltd. , London, Great Britain获得的flfellferon TM干扰素α-nl (INS)；或者共有的α干扰素，例如在美国专利号4，897，471和4，695，623 (尤其是其中的实施例7、8或9)中描述的那些；以及可以从 Amgen, Inc.，Newbury Park, Calif.获得的特定产品，或者是干扰素α-n3，其为hterferon Sciences Izfe的胃以/人 Purdue Frederick Co. , Norwalk, Conn.(Alferon) 的天然α干扰素的混合物。优选使用干扰素α-加或α-2b。如本文使用的术语“聚乙二醇化的干扰素α ”意思是干扰素α优选干扰素α _2a 和α-2b的聚乙二醇修饰的缀合物。典型的适宜的聚乙二醇化的干扰素α包括但不限于， Pegasys TM 禾口 Peg-Intron TM0如本文使用的术语“核酸”、“核苷酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”是指引物、探针、待检测的寡聚体片段、寡聚体对照物和未经标记的封闭构建体，对于聚脱氧核糖核苷酸 (包含2-脱氧-D-核糖)、对于聚核糖核苷酸(包含D-核糖)、以及对于任何其它类型的多核苷酸(其为嘌呤或嘧啶碱基或修饰的嘌呤或嘧啶碱基的N-糖苷)是一般性的。术语“干扰素敏感性决定区中的改变”是指，与野生型NS5A相比，NS5R基因的氨基酸序列中的改变，其构成编码NS5A的基因的替代形式。所述改变可以包括插入、添加、删除或替换。核苷酸序列的表示方法是从5’至3’方向。术语“标准NS5A氨基酸序列”是指来自被选择用于在细胞培养系统中进行最佳复制的良好表征的HCV序列的代表性氨基酸序列。标准NS5A氨基酸序列的实例是Η77。
核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包含磷酸二酯键或修饰的键，例如磷酸三酯、氨基磷酸酯、硅氧烷、碳酸酯、羧甲基酯、氨基乙酸酯、氨基甲酸、硫醚、桥式氨基磷酸酯、 桥式亚甲基膦酸酯、硫代磷酸酯、膦酸甲酯、二硫代磷酸酯、桥式硫代磷酸酯或砜键合，以及这些键的组合。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包含5种生物中存在的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和尿嘧啶)和/或除了这5种生物中存在的碱基之外的碱基。例如， 本发明的多核苷酸可以包含至少一个修饰的碱基部分，其选自下列但不限于这些5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-氯尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、4-乙酰基胞嘧啶、5-(羧基羟基甲基)尿嘧啶、5-羧基甲基氨基甲基-2-硫代尿苷、5-羧基甲基氨基甲基尿嘧啶、二氢尿嘧啶、β-D-galactosylqueosine、肌苷、N6-异戊烯基腺嘌呤、1-甲基鸟嘌呤、甲基肌苷、2，2-二甲基鸟嘌呤、2-甲基腺嘌呤、2-甲基鸟嘌呤、3-甲基胞嘧啶、5-甲基胞嘧啶、 N6-甲基腺嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、5-甲基氨基甲基尿嘧啶、5-甲氧基氨基甲基-2-硫代尿嘧啶、β-D甘露糖Q核苷、5'-甲氧基羧基甲基尿嘧啶、5-甲氧基尿嘧啶、2-甲基硫代-Ν6-异戊烯基腺嘌呤、尿嘧啶-5-氧化乙酸(ν)、wybutoxosine、假尿嘧啶、Q核苷(queosine)、 2-硫代胞嘧啶、5-甲基-2-硫代尿嘧啶、2-硫代尿嘧啶、4-硫代尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、尿嘧啶-5-氧化乙酸甲基酯、3-(3-氨基-3-N-2-羧基丙基)尿嘧啶、(acp3)W、2，6-二氨基嘌呤和5-丙炔基嘧啶。此外，核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以包含一个或多个修饰的糖部分，例如阿拉伯糖、2-氟阿拉伯糖、木酮糖和己糖。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸的来源不是意在限制本发明。核酸、核苷酸、 多核苷酸或寡核苷酸可以来自人类或非人类哺乳动物，或任何其它生物，或源自任何重组来源，或在体外合成或通过化学合成。核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸可以是DNA、RNA、 cDNA、DNA-RNA、锁核酸(LNA)、肽核酸(PNA)、杂交体或这些的任意混合物，并且可以以双链、单链或部分双链的形式存在。本发明的核酸包括纯化的或未纯化的形式的核酸及其片段，包括基因、染色体、质粒、生物材料的基因组，例如微生物，例如细菌、酵母、病毒、类病毒、霉菌、真菌、植物、动物、人类，等等。术语核酸、核苷酸、多核苷酸或寡核苷酸之间没有有意的长度上的区别，这些术语将可以相互替换地使用。这些术语包括双链和单链的DNA，以及双链和单链的RNA。“相应的”意思是与指定的序列相同或互补。由于可以使单核苷酸反应以产生寡核苷酸，其方式为一个单核苷酸戊糖环的5’ 磷酸酯与一个方向上的其邻居的3’氧通过磷酸二酯键连接，因此，如果寡核苷酸的5’磷酸酯不与单核苷酸戊糖环的3’氧连接，则该寡核苷酸的末端被称作“5’末端”;如果其3’氧不与下一个单核苷酸戊糖环的5’磷酸酯连接，则该寡核苷酸的末端被称作“3’末端”。如本文使用的“核酸序列”(即使是在较大寡核苷酸的内部)也可以被称作具有5’和3’末端。当两个不同的、不重叠的寡核苷酸与同一线性互补性核酸序列的不同区域退火， 并且一个寡核苷酸的3’末端朝向另一个的5’末端时，前者可以被称作“上游”寡核苷酸; 后者可以被称作“下游”寡核苷酸。术语“引物”可以指不止一个引物或者引物的混合物，并且是指寡核苷酸，可以是天然存在的，在纯化的限制性消化物中的，或者合成产生的，当被置于催化互补于核酸链的引物延伸产物的合成的条件下时，其能够沿着互补链作为多核苷酸合成的起始点。所述条件通常包括存在4种不同的脱氧核糖核苷三磷酸酯和诱导聚合的试剂例如DNA聚合酶或逆转录酶，它们存在于合适的缓冲液中(“缓冲液”包括是辅因子或影响PH、离子强度等的取代物)，并在适当的温度下。引物优选为单链的，以实现扩增的最大效率。rsl2979860是染色体19上的多态性，其被报道与HCV患者群中的SVR相关。多态性位于编码IFN-λ -3的IL28B基因上游31Λ处。在一些实施方式中，本发明的用于预测感染了 HCV-Ia的患者对基于干扰素的治疗的应答的方法可以基于分析下列项该患者的部分或全部的HCV NS5A基因；和该患者的染色体19上的多态性。如本文使用的核酸序列的互补物是指这样的寡核苷酸当它与核酸序列排列时， 即一个序列的5’末端与另一个的3’末端配对，是处于“反平行结合”。本发明的核酸中可以包括一些天然核酸中不常见的碱基，包括例如，肌苷、7-脱氮杂鸟嘌呤和上文讨论的那些。 互补性无需是完美的；稳定的双链可以包含错配的碱基对或非匹配的碱基。核酸技术领域的技术人员可以根据经验通过考虑多个变量来确定双链的稳定性，所述变量包括例如，寡核苷酸的长度、碱基组成和寡核苷酸的序列，离子强度和错配的碱基对的发生率。如本文使用的术语“探针”是指，由于该探针中至少一个序列与核酸区域中的序列之间的互补性而能与该核酸的区域形成双链结构、并且可以被检出的寡核苷酸。优选地，探针不含与5’核酸酶反应中的引物的序列互补的序列。如下文所讨论，探针可以被标记或不经标记。探针的3’末端可以被“封闭”以阻止探针被掺入到引物延伸产物中。可以通过使用非互补性碱基或通过向最后一个核苷酸的3’羟基添加化学部分例如生物素或磷酸酯基团来实现“封闭”，取决于所选的部分，这可以一举两得还可以作为后续的检测的标记物， 或捕获与标记物结合的核酸。还可以通过除掉3’ -OH或通过使用不含3’ -OH的核苷酸例如双脱氧核苷酸来实现封闭。如本文使用的术语“标记物”是指这样的任意原子或分子其可用于提供可检测的 (任选可定量的)信号，并且可与核酸或蛋白结合。标记物可以提供可由荧光、放射活性、比色、重量测定、X-射线衍射或吸收、磁学、酶活性等来检测的信号。用于本发明的方便的标记物包括那些促进寡核苷酸片段的大小的检测的标记物。在本发明的一些实施方式中，“标记物”是荧光染料。荧光标记物可以包括带负电荷的染料，例如荧光素家族的染料；或电荷上为中性的染料，例如若丹明家族的染料；或者带正电荷的染料，例如花菁家族的染料。荧光素家族的染料包括，例如FAM、HEX、ΤΕΤ、JOE、 NAN 和 ZOE。若丹明家族的染料包括 iTexas Red、ROX、R110、R6G 和 TAMRA。FAM、HEX、ΤΕΤ、 J0E、NAN、Z0E、R0X、R110、R6G* TAMRA 由 Perkin-Elmer (Foster City,Calif.)在市场上销售，Texas Red由Molecular Probes, Inc. (Eugene、0R)在市场上销售。花菁家族的染料包括 Cy2> Cy3> Cy5 禾口 CyrJ，由 Amersham(Amersham Place、Little Chalfont, Buckinghamshire, England)在市场上销售。如本文使用的术语“猝灭剂”是指吸收从荧光染料中发射的能量的化学部分，例如，当猝灭剂与荧光染料二者与普通的多核苷酸连接时。猝灭剂可以通过特异于该猝灭剂的信号重新发射从荧光染料中吸收的能量，因此，猝灭剂也可以是“标记物”。该现象一般被称作荧光共振能量转移或FRET。或者，猝灭剂可以以热量的方式分散掉从荧光染料吸收的能量。通常用于FRET的分子包括例如，荧光素、FAM、JOE、若丹明、R6G、TAMRA, ROX、DABCYL 和EDANS。一种荧光染料是标记物还是猝灭剂是由其激发和发射光谱以及与其配对的荧光染料决定的。例如，FAM的最有效激发光的波长是488nm，其发射具有500-650nm光谱的光， 最大发射为525nm。FAM是用于例如以TAMRA(其在514nm处具有最大激发)为猝灭剂的合适的供体标记物。示例性的非荧光的猝灭剂(其分散掉从荧光染料吸收的能量)包括由 Biosearch Technologies, Inc. (Novato, Calif.)在市场上销售的 Black Hole Quenchers TM。如本文所定义，“5’至3’核酸酶活性”是指模板特异性的核酸聚合酶的活性，其包括一些DNA聚合酶通常具有的5’至3’核酸外切酶活性，即以连续方式从寡核苷酸的5’ 末端除掉核苷酸(例如大肠杆菌DNA聚合酶I具有该活性，而Klenow片段则不具有该活性)；或者，5’至3’核酸内切酶活性，其中切割发生在从5’末端开始的不止一个磷酸二酯键(核苷酸)；或者这两种活性。虽然不希望被任何特定操作理论所限，但是对于探针-模板杂交复合物的5’至3’核酸内切酶活性依赖性的切割的优选底物是移位的单链核酸，其为叉样结构，在连接移位区域与链的碱基配对部分的磷酸二酯键上发生水解，如Holland 等人，1991，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 :7276-80中所讨论，通过引用方式将其全部内容并入本文。如本文使用的术语“邻近”是指就探针在它的模板核酸的互补链上而言的引物的位置。引物和探针可以间隔20个核苷酸以上，间隔1至大约20个核苷酸，更优选大约1至 10个核苷酸，或者可以彼此直接毗邻，这可能是使用聚合非依赖性方法进行的检测所需要的。或者，在用于聚合依赖性的方法中，如本方法用于如本文教导的PCR扩增和检测方法时，“邻近”可以是被扩增的序列内的任意位置，引物下游的任意位置，从而引物延伸将决定聚合酶的位置，从而发生探针的切割。如本文使用的术语“热稳定性核酸聚合酶”是指，当与例如来自大肠杆菌的核苷酸聚合酶相比较时，对于热是相对稳定的酶，并且其催化三磷酸核苷的聚合。一般而言，酶将在与靶序列退火的引物的3’末端启动合成，将使新链朝着模板的5’末端持续合成(并且，如果具有5’至3’核酸酶活性，水解插入的退火的探针以释放标记的和未标记的探针片段)，直至合成终止或探针片段将靶序列熔融。代表性的分离自水生栖热菌(Thermus aquaticus, Taq)的热稳定酶描述于美国专利号4，889，818，其在常规PCR中的使用方法描述于 Saiki 等人，1988，Science 239 :487-91 Taq DNA聚合酶具有DNA合成依赖性的链置换5’ _3’核酸外切酶活性。参见 Gelfand, “ Taq DNA Polymerase“,见 PCR Technology Principles and Applications for DNA Amplification，Erlich 编，Stockton Press, N. Y. (1989)，第 2 章。在溶液中极少有探针的降解(微乎其微)。术语核酸、引物和探针的“5’核酸反应”是指，当引物被具有5’至3’核酸酶活性的核酸聚合酶延伸时，与核酸杂交的探针的降解，如下文详细描述。此类反应是基于美国专利号6，214，979,5, 804，375,5, 487，972和5，210，015中描述的那些，通过引用将这些文献全文并入本文。术语“靶核酸”是指可以按5’核酸酶反应的方向与引物和探针杂交并且包含一个或多个核苷酸变异位点的核酸。
如本文使用的术语“严格”或“严格条件”是指如本领域所熟知的低离子强度和高温度的杂交条件。参见，例如 Sambrook 等人，2001，Molecular Cloning :A Laboratory Manual，Third Edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York ；Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel 等人编，J. Wiley &Sons Inc., New York，1988) ；Tijssen，1993，" Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid assays“ in Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology :Hybridization with nucleic acid probes (Elsevier)，每篇文献皆通过引用并入本文。一般而言，将严格条件选择为在确定的离子强度和PH时，比指定序列的热熔解点(Tm)低大约5-30°C。或者，将严格条件选择为在确定的离子强度和PH时， 比指定序列的Tm低大约5-15°C。Tm是指这样的温度(在确定的离子强度、pH和核酸浓度下)在平衡时，50%的互补于靶标的探针与靶序列杂交(由于靶序列的过量存在，所以在 Tm时，在平衡时50%的探针被占据)。例如，严格杂交条件可以是盐浓度低于大约1. OM的钠(或其它盐)离子，通常是大约0.01至大约IM的钠离子浓度，pH是7.0至大约pH 8.3， 对于短探针而言(例如10至50个核苷酸的探针)，温度是至少大约25°C;对于长探针而言 (例如大于50个核苷酸的探针)，温度是至少大约55°C。可以通过加入杂交去稳定剂例如甲酰胺来改变严格条件。对于长探针而言(例如大于50个核苷酸的探针)，示例性的非严格或低度严格条件是20mM Tris的缓冲液，pH 8. 5,50mM KCl, 2mM MgCl2,以及反应温度是 25 °C。除非另有指明，否则本发明的实施将采用分子生物学、微生物学和重组DNA技术中的常规技术，其在本领域的技能之内。此类技术在文献中有完善的解释。参见，例如 Sambrook ^Α 2001, Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Third Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York ；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait H,1984) ；Nucleic Acid Hybridization (B. D. Hames & S. J. Higgins, eds. ,1984) ；A Practical Guide to Molecular Cloning(B. Perbal,1984)； 以及一个系列:Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.)。在图5和7中提供了完整的HCV-Ia基因组的氨基酸序列。在一个实施方式中，本发明提供了能够检测NS5A基因的位置676、677或678处的核苷酸替换的测定法。在另一个实施方式中，本发明提供了能够检测NS5A基因的位置931、932或933处的核苷酸替换的测定法。用于检测核苷酸或氨基酸变异的多种技术是本领域已知的，并且都可用于实施本发明的方法。用于鉴定序列变异的具体方法不是本发明的关键方面。虽然关于性能、成本和方便性的考虑将使某些特定方法比其它方法更加优选，但是需要的是任何可以确定ISDR 中的变异数目并鉴定图5和6中的位置676、677、678、931、932和933处的核苷酸或图5或 7中的位置2 和/或311处的氨基酸的方法都提供实施本发明所需的信息。技术可以是基于多核苷酸的或者基于蛋白质的。在任一情况下，所使用的技术必须是足够灵敏的，从而精确检测单一核苷酸或氨基酸变异。技术的实例可以包括但不限于以下这些 基于多核苷酸的检测方法(即参见美国专利号5，310，625 ；5, 322, 770 ； 5，561，058 ;5，641，864 ；和 5，693，517 ；另见 Myers and Sigua, Myers and Sigua,Amplification of RNA :High_temperature reverse transcription and DNA amplification with Thermus thermophiIus DNA polymerase. In :M.A. Innis, D. H. Gelfand and J. J. Sninsky, Editors, PCR Strategies, Academic Press, San Diego (1995)，pp. 58-68))，DNA 测序方法(即 PE Biosystems (Foster City, CA)的 DNA 测序方法；参见 Sanger 等人，1977，Proc. Natl. Acad. Sci. 74 :5463-5467)； 基于扩增的基因分型方法(即美国专利号4，683，195 ；4, 683，202 ；和 4，965，188 ；另见 PCR Applications, 1999，(Innis 等人编，Academic Press, San Diego)， PCR Strategies, 1995, (Innis 等人编，Academic Press, San Diego) ；PCR Protocols, 1990，Gnnis 等人编，Academic Press, San Diego)；和 PCR Technology，1989，(Erlich 编， Stockton Press, New York)； 连接酶链式反应(即 Wu and Wallace 1988, Genomics4 :560-569)；链置换测定法(Walker 等人，1992，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :392-396, Walker 等人 1992，Nucleic Acids Res. 20 :1691-1696,和美国专利号5,455，166)；以及数个基于转录的扩增系统，包括描述于美国专利号5，437，990 ；5, 409，818 ；和5，399，491中的那些；转录扩增系统(TAS) (Kwoh 等人，1989，Proc. Natl. AcacUci. USA86 :1173-1177)；以及自主维持序列扩增(3SR) (Guatelli 等人，1990，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 :1874-1878 和 WO 92/08800)；·序列特异性扩增或引物延伸方法(即美国专利号5，137，806 ；5, 595，890 ； 5，639，611 ；和美国专利号 4，851，331)； 动力学 PCR 方法(S卩 Higuchi 等人，1992，Bio/TechnologylO :413-417 ； Higuchi 等人，1993，Bio/technology 11 :1026-1030 ；Higuchi and Watson，见上文的 PCR Applications，第16章；美国专利号5，994，056 ；和欧洲专利公开号487，218和512，334)； 基于探针的方法，其依赖于在探针与核苷酸变体(其互补性程度不同)之间形成的杂交双链的不稳定性差异(即Conner等人，1983，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80 278-282，和美国专利号 5，468，613 ；5，604，099 ；5，310，893 ；5，451，512 ；5，468，613 ；和 5, 604, 099)； 质谱法(即 MALDI-MS ；美国专利号 6，258，539)； 基于蛋白的检测技术(即蛋白测序、免疫亲和测定、酶联免疫吸附测定 (ELISA)；放射免疫测定(RIA)；免疫放射分析(IRMA)和免疫酶学测定(IEMA)；参见例如美国专利号 4，376，110 和 4，486，530)。在基于多核苷酸的检测方法中，通过鉴定存在于替换位点即图5和6中的核苷酸位置931、932或933处的核苷酸来完成基因分型。任意类型的来自HCV-Ia感染的个体的包含HCV-Ia多核苷酸的生物样品都可用于确定基因型。可以通过使用本领域熟知的标准的RNA提取方法分离HCV RNA来进行基因分型。RNA的扩增可以这样进行首先使用例如病毒逆转录酶将靶RNA逆转录，然后扩增得到的cDNA，或者使用组合的高温逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来进行，如美国专利号 5，310，652 ；5, 322，770 ；5, 561，058 ；5, 641，864 ； 和5，693，517中所描述；每篇皆通过引用并入本文(另见Myers and Sigua，1995，PCR Strategies,见上文，第5章)。本领域已知有多种用于鉴定存在于单一核苷酸位置上的核苷酸的方法。本发明还涉及试剂盒、容器单元，其包含用于实施本方法的有用组分。有用的试剂
20盒可以包含用于检测NS5A基因中的位置676、677、678、931、932和933处的核苷酸替换的寡核苷酸。在一些情况下，检测探针可以固定于合适的支持物膜上。试剂盒还可以包含用于扩增包含替换位点的NS5A基因座的区域的扩增引物，此类引物用于本发明的优选实施方式中。或者，有用的试剂盒可以包含一组引物，所述引物包括用于特异性扩增NS5A基因的序列特异性引物。试剂盒的其它可选组分包括用于如本文描述的基因分型方法中的另外的试剂。例如，试剂盒还可以包含用于催化引物延伸产物的合成的试剂、底物三磷酸核苷、 用于标记和/或检测核酸的工具(例如，亲和素-酶缀合物和酶底物和色原(如果标记物是生物素))、用于扩增或杂交反应的合适缓冲液，以及用于执行本方法的说明书。如本文公开的方法衍生自逐步多变量的最初的logistic回归分析。以下提供的本发明的实施例仅仅为了解释目的，不是为了限制本发明的范围。实施例之后的权利要求的范围内的本发明的多个实施方式对于阅读了以上的文本和以下的实施例的本领域普通技术人员而言是显而易见的。实施例对来自参与临床试验的对照分支的美国患者的全长NS5A蛋白进行分析以确定可能赋予阳性Peg-IFN和RBV应答的区域。80位以前未接受过治疗的患者接受48周的 Peg-IFN和RBV。通过群体测序分析基线病毒基因型。55位患者感染基因型为Ia的HCV。 按照对治疗的最初应答对患者进行分组，即迅速病毒学应答(RVR)、完全早期病毒应答 (cEVR)、部分早期病毒应答。实施例1受试者群体研究中包括了 250位以前未接受过治疗的受试者，他们具有慢性的基因型为1的 HCV感染。所有的受试者年龄介于18至65岁，具有可检测的基线血浆HCV RNA水平，并且是HBsAg和HIV抗体阴性的。使用Roche COBAS TaqMan HCV/HPS测定法(Roche Molecular Systems Inc. ,Branchburg,NJ,USA)测定血浆 HCV RNA 水平。该 HCV RNA 测定法的定量下限值为30IU/mL，检测限值(LOD)为10IU/mL。受试者随机接受TVR 750mg q8h、聚乙二醇化干扰素-α -2a (Peg-IFN) 180 μ g/周和利巴韦林(RBV) 1000-1200mg/天，持续12周；然后接受0、12或36周的Peg-IFN和RBV， 或12周的TVR/Peg-IFN(无RBV)。对照组接受48周的安慰剂/Peg-IFN和RBV。最初的治疗结果是基于在治疗的首次给药后的特定间隔定量的血浆HCV RNA水平。在第4周时在血浆中检测不到的HCV RNA水平(< 10IU/mL)归类为迅速病毒应答者(RVR)。完全早期病毒应答者(cEVR)的HCV RNA在第12周时低于检测限值(< 10IU/mL)。部分早期病毒应答者 (pEVR)在第12周时的HCV RNA具有21og的下降；无应答者(NR)在第12周时的HCV RNA 具有 0 或 Ilog 的下降(Hoefs 2007，Pealman 2007)(图 1)。实施例2来自受试者血浆的HCV的扩增和测序在给药前(第1天)在250位以前未接受过治疗的具有基因型为1的HCV的受试者中进行全长NS5A的群体序列分析。通过对前臂静脉进行静脉穿刺从受试者中采集 4mL的血液样品，装入含有EDTAO^)抗凝剂的管中。通过10分钟的离心分离血浆、分成等份并储存于-80°C。通过巢式逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)扩增大约91AHCV RNA片段(该片段跨越HCV多聚蛋白编码区)，以进行HCV的序列分析。使用QIAquick 96PCR 纯化试剂盒Oliagen)纯化来自该PCR的DNA，并在琼脂糖凝胶上分析。通过EnVision Multilabel Reader (PerkinElmer ffaltham,MA)测定经纯化的PCR产物的质量和数量。由 Agencourt Biosciences (Beverly，ΜΑ)使用针对跨越整个NS5A区域设计的引物进行经纯化的PCR产物的测序。在含有> 1000IU/mL HCV RNA的样品中的测序测定是成功的。 将受试者的核酸序列(代表对基于干扰素的治疗的应答程度，显示于图6A-6E)翻译成氨基酸序列，显示于图7A-7E。使用软件 Mutational Surveyor (SoftGenetics, State College, PA)比对并分析序列。实施例3序列非依赖性分析使用ClustalX的缺省参数(Gormet Matrix,出现空格罚分=10，空格延伸罚分= 0. 2 [Thompson等人，1997])，将序列与丙肝参照基因组H77 (Genbank号NC_0041(^)比对。 该序列在鉴定每位患者的氨基酸序列中的可变基因座中用作参照，使用方式为与Enomoto 在1996年的研究中使用的参照HCV基因组D90208相当的方式。每个患者序列重新编码进入二元矩阵，可变位置由‘1’标示，与参照具有相同残基的位置被分配为数值‘O’。为了确定突变的分布是否在结果组(即RVR、EVR、pEVR和NR)中正态分布，在NS5A蛋白的每个残基处应用卡方检验。此外，对于每个结果组，计算每个残基的突变频率。将该突变频率针对无应答患者(NR)的突变频率进行校正，以确定每个结果组中那些富含突变或贫乏突变的残基。对数据进行分析以确定以下项是否可用于预测HCV对聚乙二醇化干扰素的响应性人口统计学因素(性别、种族)、最初病毒载量或NS5A内的具有声称的功能上的重要意义的多个结构域中的突变数目，包括(i)负责细胞停滞(cytoretention)的区域，(ii)超磷酸化结构域，(iii)干扰素敏感性决定区(ISDR)，(iv)H(R-结合结构域，(ν)细胞核定位信号；和(vi)V3区域。这些变量中的每一个用作单变量分析中的独立变量，其中使用卡方检验或logistic回归，视独立变量的类型而定。另外也将所有独立变量组合并用作逐步多元序数回归混合(正向和反向)模型中的预测因子(predictor)。进入基于单变量统计的模型所需的α水平被设定为0.15。对于所有的logistic回归，按照以下量级将每位患者的应答重新编码进入序数等级=NR (n = 9)，pEVR(n = 11), EVR (η = 26)，RVR (η = 9)。还对结果组进行了比较，以测定它们之间在如上定义的功能结构域内的突变数目方面的显著差异。当满足参数测试的假设时，此后使用Tukey比较进行变量的分析，其中加以修改以允许进行不相等样本大小的比较(Kramer，1956)。当不符合参数统计学的假设时， 使用秩和检验(Kruskal-Wallis) 0所有的统计学分析皆使用SAS (v. 9. 1，Sas Institute, Cary, NC, USA)或 JMP (ν· 7. 0，Sas Institute)进行。实施例4序列依赖性分析为了确定NS5A内的患者结构域序列是否基于他们对Peg-IFN和RBV的响应性而聚集，使用Genedoc (Nichols and Nichols, 1997)将NS5A氨基酸排列分成之前定义的结构域。使用Kimura置换矩阵(Kimura，1980)，使用protdist程序(其为Phylip程序包的一部分，V.3.67[i^lsenstein，2007])的缺省参数，为每个结构域排列产生距离矩阵。使用最接近的邻接算法(Saitou and Nei, 1987)产生序列簇。评估星系统发生(star phylogenies) 以确定序列是否基于结构域上的序列相似性而聚集。另外，为了确定ISDR内的特定残基的突变是否负责产生HCV对Peg-IFN和RBV的更大的敏感性，我们在多变量逐步序数logistic回归中将每个残基处的字符针对病毒应答进行回归分析。在分析中包括了种族这个变量，因为已经表明该变量在“序列非依赖性” 多变量模型中显著影响病毒应答(见结果)。该分析使用正向逐步回归模型；进入基于单变量统计的模型所需的显著性水平被设定为0. 15 ；而保留在多变量模型中所需的显著性水平设定为0. 10。本研究中的55位基因型为Ia的患者的最初治疗应答包括7位患者达到RVR，24 位达到cEVR，14位达到pEVR，10位是NR。数据集包括这些55个NS5A序列的446个残基的比对，总共24695个氨基酸位置。这些残基中的大多数( 94.6% )与H77相同，其中275 个比对位置( 61% )在比对中是不变的。在我们的数据集中观察到的1338个突变分布于其余的174个比对位置中。在NS5A之中，在结果组之间存在显著性差异(Krukal-Wallis非参数单因素变量分析；ρ = 0. 0306)，RVR患者(每位患者的NS5A突变的中位数=31)具有比cEVR(中位数 =24)、pEVR(中位数=21)和NR患者(中位数=26. 5)更多的突变。Logistic回归用于测试病毒对Peg-IFN和RBV敏感性是否为NS5A蛋白的任何区域内的突变数的函数。在41 个重叠的区段(每个区段40个氨基酸残基)上独立进行回归分析。发现Peg-IFN和RBV 敏感性是ISDR内的病毒异质性的函数(Logisitc回归；X2 = 13. 02，ρ = 0. 0003)，但是与任何其它NS5A区域内的异质性无显著相关性(图2)。在ISDR内，RVR结果组(每位患者的ISDR突变的中位数=3)比cEVR(中位数= 1 ；Mann-Whitney U-检验，ρ = 0. 0018)、pEVR(中位数=0. 5 ；Mann-Whitney U-检验，ρ = 0. 0009)和NR(中位数=1 ；Mann-Whitney U-检验，ρ = 0. 0031)组具有显著更多的突变。 在任何其它结果组之间都未检测到显著性差异(图3)。仅有1位在ISDR内具有少于3个突变的患者达到了 RVR，所有其它RVR患者ISDR内都具有至少3个突变(图4)。在ISDR 中具有3个或更多个突变的所有患者(n = 10)都达到了 cEVR或RVR。为了鉴定影响病毒对使用Peg-IFN和RBV的治疗的敏感性的其它参数，我们开发了一种多变量模型，其使用患者的人口统计学数据(性别、种族)、最初病毒载量(范围 1.4X105,3. lX107IU/ml)和NS5A蛋白内的每个残基的氨基酸组成。另外，包括了 ISDR内的突变数目作为预测因子(鉴于Peg-IFN和RBV敏感性对该变量的单变量依赖性)。混合的多变量序数logistic回归使用正向和反向选择，用于进入的显著性水平设定为0. 15 ；变量保留在模型中所需的显著性水平阈值设定为0. 10。结果表明性别和最初病毒载量不影响我们的数据集内的I3R敏感性。有趣的是，除了 ISDR内的突变数目之外，发现NS5A中的 446个NS5A氨基酸位置中的2个中的改变与IFN敏感性相关-M22&和AA311 (编号是基于 HCV参照物H77)。在AA226的情况下，甲硫氨酸和谷氨酸与HCV的Peg-IFN和RBV-敏感性表型相关；而丙氨酸和亮氨酸与Peg-IFN和RBV-抗性表型相关，缬氨酸代表中间水平的表型。在位置311处，谷氨酰胺、精氨酸和丙氨酸与IFN-敏感性相关；而丝氨酸和脯氨酸与 Peg-IFN和RBV-抗性相关(表1)。
表 权利要求
1.使用基于干扰素的治疗来治疗感染了HCV-Ia的患者的方法，所述方法包括a)分析该患者的部分或全部的HCVNS5A基因；和b)确定用于预测对于基于干扰素的治疗的阳性应答的可能性的标准，其中所述标准包括以下一个或多个要素i)与标准NS5A氨基酸序列相比，该患者的NS5A氨基酸序列的干扰素敏感性决定区 (ISDR)中的变化数目；和 )该患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列。
2.权利要求1的方法，还包括基于感染了HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为b)中的标准的所有要素分配权重参数。
3.权利要求1的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是A、L、V、E或M。
4.权利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是M。
5.权利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是E。
6.权利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是A。
7.权利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是L。
8.权利要求3的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是V。
9.权利要求1-8任一项的方法，其中所述标准还包括“患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列”这一要素，其中所述标准包括所述三个要素中的一个或多个。
10.权利要求9的方法，还包括基于感染了HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们对于基于干扰素的治疗的应答而为“患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列”这一要素分配权重参数。
11.权利要求9的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是S、P、Q、R或A。
12.权利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是S。
13.权利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是P。
14.权利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是Q。
15.权利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是R。
16.权利要求11的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是A。
17.权利要求1-16任一项的方法，其中所述的标准NS5A氨基酸序列是H77。
18.权利要求1的方法，还包括分析该患者的遗传多态性的步骤。
19.权利要求18的方法，其中患者的遗传多态性是rsl2979860。
20.权利要求1-19任一项的方法，其中分析患者的部分或全部HCVNS5A基因的步骤包括使用聚合酶链式反应仪器扩增部分或全部HCV NS5A基因的一部分的步骤。
21.权利要求1-19任一项的方法，还包括确定该患者是否对基于干扰素的治疗有阳性应答的步骤。
22.权利要求20的方法，还包括以下步骤如果该患者被确定为对基于干扰素的治疗有应答，则向该患者给予基于干扰素的治疗。
23.干扰素在制备药物中的用途，所述药物用来根据用于预测对于基于干扰素的治疗的阳性应答的可能性的标准治疗感染了 HCV-Ia的患者，其中所述标准包括以下一个或多个要素a)该患者的HCVNS5A氨基酸序列的氨基酸位置226 ；和b)与标准NS5A氨基酸序列相比，该患者的NS5A氨基酸序列的干扰素敏感性决定区中的变化数目。
24.权利要求23的用途，其中，基于感染了HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为所述标准中的要素分配权重参数。
25.权利要求23的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是A、L、V、M或E。
26.权利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是A。
27.权利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是L。
28.权利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是E。
29.权利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是M。
30.权利要求25的用途，其中NS5A氨基酸序列的氨基酸位置2 是V。
31.权利要求25-30任一项的用途，其中所述标准还包括“患者的NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基”这一要素，其中所述标准包括所述三个要素中的一个或多个。
32.权利要求31的用途，其中患者的NS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基是 S、P、Q、I^A。
33.权利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311处的氨基酸残基是So
34.权利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311处的氨基酸残基是P。
35.权利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311处的氨基酸残基 是Q。
36.权利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311处的氨基酸残基是Ro
37.权利要求32的用途，其中在患者的NS5A氨基酸序列中，位置311处的氨基酸残基是A。
38.权利要求M-37任一项的用途，其中所述药物包括一种或多种抗-病毒药物。
39.权利要求38的用途，其中所述一种或多种抗病毒药物包括利巴韦林、HCV蛋白酶抑制剂或HCV聚合酶抑制剂。
40.权利要求39的用途，其中所述HCV蛋白酶抑制剂是BMS-790052、MK7009、BI 201335、SCH900518、VX-985、SCH503034、VX-950、VX-500、R7227、ITMN-191、ACH-1095 或 TMC435350。
41.权利要求39的用途，其中所述HCV蛋白酶抑制剂是VX-950。
42.权利要求39的用途，其中所述HCV蛋白酶抑制剂是SCH50303。
43.权利要求39的用途，其中所述HCV聚合酶抑制剂是VCH-916、IDX-184、VX-222、 filibuvir, ABT-033、ABT-072、GS190、ANA598、MK-3281、BMS-650032 或 R7128。
44.权利要求39-43任一项的用途，其中所述药物还包括NS4A抑制剂、NS4B抑制剂、亲环蛋白抑制剂及其组合。
45.权利要求38-44任一项的用途，其中所述药物还包括ACH-806、克立咪唑、 Debio-025 或 NIM811。
46.权利要求23-45任一项的用途，其中所述标准NS5A氨基酸序列是H77。
47.权利要求23的用途，其中所述标准还包括患者的遗传多态性。权利要求47的方法，其中患者的遗传多态性是rsl2979860。
48.为感染了HCV-Ia的患者指定治疗方案和/或治疗持续时间的方法，包括a)分析该患者的部分或全部的HCVNS5A基因；和b)确定用于预测对于干扰素治疗的阳性应答的可能性的标准，其中所述标准包括以下一个或多个要素i)与标准NS5A氨基酸序列相比，该患者的HCV NS5A氨基酸序列的干扰素敏感性决定区中的变化数目；和 )该患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列；和c)确定该患者的治疗方案和/或治疗持续时间。
49.权利要求49的方法，还包括基于感染了HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为b)中的标准的所有要素分配权重参数。
50.权利要求49或50的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是A、L、V、E或M。
51.权利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是A。
52.权利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是L。
53.权利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是M。
54.权利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是E。
55.权利要求51的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置2 处的氨基酸残基的序列是V。
56.权利要求49-56任一项的方法，其中所述标准还包括“患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列”这一要素，其中所述标准包括所述三个要素中的一个或多个。
57.权利要求48-56任一项的方法，还包括基于感染了HCV-Ia的患者群体的序列分析以及他们各自对于基于干扰素的治疗的应答而为“患者的HCV NS5A氨基酸序列的位置311 处的氨基酸残基的序列”这一要素分配权重参数。
58.权利要求58的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是S、P、Q、R或A。
59.权利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是S。
60.权利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是P。
61.权利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是Q。
62.权利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是R。
63.权利要求59的方法，其中患者的HCVNS5A氨基酸序列的位置311处的氨基酸残基的序列是A。
64.权利要求49-64任一项的方法，其中所述标准NS5A氨基酸序列是H77。
65.权利要求49-65任一项的方法，其中患者的治疗方案和/或治疗持续时间的确定包括向患者施用HCV蛋白酶抑制剂、第二 STAT-C、干扰素、利巴韦林或其组合。
66.权利要求66的方法，其中向患者的施用包括施用12周、36周或48周的持续时间。
67.权利要求66的方法，其中向患者的施用包括施用12周的持续时间。
68.权利要求66的方法，其中向患者的施用包括施用36周的持续时间。
69.权利要求66的方法，其中向患者的施用包括施用48周的持续时间。
70.权利要求66-70任一项的方法，其中所述HCV蛋白酶抑制剂是SCH503034、VX_950、 VX-500、R7227、ITMN-191、ACH-1095 或 TMC435350。
71.权利要求71任一项的方法，其中所述HCV蛋白酶抑制剂是SCH503034。
72.权利要求71任一项的方法，其中所述HCV蛋白酶抑制剂是VX-950。
73.权利要求66的方法，其中所述第STAT-C是HCV聚合酶抑制剂、NS4A抑制剂、NS4B 抑制剂或亲环蛋白抑制剂。
74.权利要求74 的方法，其中所述第 STAT-C 是 VCH-916、IDX-184、VX-222、filibuvir、 ABT-033、ABT-072、GS190、ANA598、MK-3281、BMS-650032、ACH-806、克立咪唑、Debio-025、 NIM811 或 R7128。
75.权利要求49的方法，还包括分析该患者的遗传多态性的步骤。
76.权利要求76的方法，其中该患者的遗传多态性是rsl2979860。
77.权利要求49-77任一项的方法，其中分析患者的部分或全部HCVNS5A基因的步骤包括使用聚合酶链式反应仪器扩增部分或全部HCV NS5A基因的一部分的步骤。
78.权利要求49-78任一项的方法，还包括给予该患者基于干扰素的治疗的步骤。
全文摘要
用于预测感染了HCV-Ia的患者对干扰素治疗的应答的方法。
文档编号G01N33/50GK102307589SQ200980137534
公开日2012年1月4日 申请日期2009年8月28日 优先权日2008年8月28日
发明者A·夸昂, D·巴特尔斯, T·基弗 申请人:沃泰克斯药物股份有限公司