专利名称：基因型的判断方法
技术领域：
本发明涉及从包含与乙醇敏感度相关的基因(乙醇敏感度相关基因)的固体待测样品中，判断所述固体待测样品中包含的基因的基因型的方法。
背景技术：
乙醇脱氢酶ADH(Alcohc)I Dehydrogenase)是与在体内将乙醇分解为乙醛相关的酶，已知有多种种类。其中，基因ADHlB(原名ADH2)中，有乙醇代谢速度慢被称为低活性型的基因型ADHB1*1/*1，具有该基因型的人在饮酒后表现出面色潮红、心悸等所谓的上头 (flushing)症状，由于乙醇分解速度慢，因而乙醇易残留于体内，被称为易于成为酒精依赖症的体质。此外，乙醛脱氢酶ALDH(Aldehyde Dehydrogenase)是与在体内将乙醛分解为乙酸相关的酶之一，已知有多种种类。其中，在血液中乙醛浓度低的情况下发挥作用的ALDH2基因中，已知也有被称为无活性型的基因型ALDH2*l/*2、ALDH2M/*2，具有该基因型的人，由于乙醛分解速度慢，被认为是一饮酒就变红易于发生宿醉的体质。已知基因型ADHB1*1/*1占日本人的5 %左右，基因型ALDH2*lA2占日本人的约 40%左右。乙醇、乙醛具有致癌性，具有上述基因型ADHB1*1/*1、基因型ALDH2*l/*2的人， 具有由于饮酒量的增加，而易于发生口腔癌、咽喉癌、喉头癌、食道癌、肝癌、乳腺癌、直肠结肠癌等癌症的倾向，特别是同时具有基因型ADHB1*1/*1和基因型ALDH2*l/*2的人，被认为该风险力口倍(例如，参见 Akira Yokoyama 等人，“Genetic polymorphisms of alcohol and aldehyde dehydrogenases and glutathione S-transferase Ml and drinking, smoking, and diet in Japanese men with esophageal squamous cell carcinoma", Carcinogenesis,第 23 卷，第 11 期(2002)，第 1851-1859 页(非专利文献 1) ；Akira Yokoyama 等人，“Alcohol and aldehyde dehydrogenase gene polymorphisms and oropharyngolaryngeal, esophageal and stomach cancers in Japanese alcoholics", Carcinogenesis，第 22 卷，第 3 期(2001)，第 433-439 页(非专利文献幻；Akira Yokoyama ^Α "Macrocytosis, a new predictor for esophageal squamous cell carcinoma in Japanese alcoholic men，，，Carcinogenesis,第 24 卷，第 11 其月(2003),第 1773-1778 页 (非专利文献 3) ；Takahiro Asakage 等人，"Genetic polymorphisms of alcohol and aldehyde dehydrogenases,and drinking,smoking and diet in Japanese men with oral and pharyngeal squamous cell carcinoma", Carcinogenesis,28 ^,M 4 M (2007), 第865-874页(非专利文献4)等)。此外，已知细胞色素CYP2E1 (Cytochrome P4502E1)与被称为第2乙醇代谢路径的肝微粒体氧化体系中的乙醇代谢相关，已知存在具有不同的乙醇敏感度的两个基因型CYP2El*cl、CYP2El*c2(例如，参见野村文夫“第2 ^rn ^ 一义代謝経路Microsomal Ethanol-Oxidizing System(MEOS) i f 卜夕口一 A P4502E1 (CYP2E1) ”，千葉医学， 78 000 ，第69-73页(非专利文献幻；山田裕一“日本人^ 7 > 二一 >代謝酵素c^遺伝的多形^飲酒行動杉太&飲酒d石健康障害們関係”，金医大誌，30 (2005)，第448-455页(非专利文献 6) ；Yan-Mel Guo 等人,“Genetic polymorphisms in cytochrome P4502E1,alcohol and aldehyde dehydrogenases and the risk of esophageal squamous cellcarcinoma in Gansu Chinese males", World J Gastroenterol,14(9), (2008), 第1444-1449页(非专利文献7)等)。因此，可认为判断上述乙醇脱氢酶ADH的基因、乙醛脱氢酶ALDH的基因和细胞色素CYP2E1的基因等乙醇敏感度相关基因的基因型，尤其对于规避与日本人的饮酒相关的疾病或致癌的风险，以及对于个人健康管理方面，具有重要的意义。已开展了利用传统PCR(聚合酶链式反应)法等解析基因的各种研究来检测生物个体间具有与野生型不同的碱基序列的基因多态性(SNP 单核苷酸多态性)，该基因多态性会引起如上所述的个体的基础代谢、性质、疾病等差异。例如，日本特开2005-245273号公报(专利文献1)公开了检测乙醛脱氢酶基因多态性的方法、日本特开2005-245272号公报(专利文献2)和日本特开2006-75134号公报(专利文献3)中分别公开了检测乙醇脱氢酶基因多态性的方法。但是，就这些专利文献1-3中公开任何方法而言，由于用于PCR法的DNA纯化等手续繁杂，因此需开发更简单的方法。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2005-245273号公报专利文献2 日本特开2005-245272号公报专利文献3 日本特开2006-75134号公报非专利文献非专禾丨J 文献 1 :Akira Yokoyama 等人，"Genetic polymorphisms of alcoholand aldehyde dehydrogenases and glutathione S-transferase Ml and drinking,smoking, and diet in Japanese men with esophageal squamous cell carcinoma",Carcinogenesis，第 23 卷，第 11 期(2002)，第 1851-1859 页非专利文献 2 :Akira Yokoyama 等人，"Alcohol and aldehyde dehydrogenasegene polymorphisms and oropharyngolaryngeal, esophageal and stomach cancers inJapanese alcoholics”，Carcinogenesis，第 22 卷，第 3 期(2001)，第 433-439 页非专禾丨J 文献 3 :Akira Yokoyama 等人，“Macrocytosis，a new predictor foresophageal squamous cell carcinoma in Japanese alcoholic men", Carcinogenesis,第对卷，第11期(2003)，第1773-1778页非专禾丨J文献 4 :Takahiro Asakage 等人，"Genetic polymorphisms of alcoholand aldehyde dehydrogenases,and drinking,smoking and diet in Japanese men withoral and pharyngeal squamous cell carcinoma", Carcinogenesis, M 28 .4 (2007)，第 865-874 页非专利文献5 :野村文夫“第2 O 7 - 一义代謝経路MicrosomalEthanol-Oxidizing System(MEOS) i f 卜夕 α — Λ Ρ4502Ε 1 (CYP2E1) ”，千葉医学，78(2002)，第 69-73 页非专利文献6 山田裕一“日本人O 7 > 二一 >代謝酵素 遺伝的多形^飲酒行動杉^ &飲酒d石健康障害們関係”，金医大誌，30 (2005)，第448-455页非专利文献 7 :Yan_Mel Guo 等人，"Genetic polymorphisms in cytochromeP4502E1,alcohol and aldehyde dehydrogenases and the risk of esophageal squamouscell carcinoma in Gansu Chinese males，，，World J Gastroenterol, 14(9), (2008),第1444-1449 页非专利文献8 :Michael P.和 Andrew L. , Nucleic Acids Reserch，19，1151，(1991)非专利文献9 =Henke W.，Herdel K.，Jung K.，Schnorr D.和 Loening Α. S.，Nucleic Acids Reserch,25,3957, (1997)非专利文献10 :Waleed Α. Α.和 Peter R.，J. clin. Microbiol.，39，485-493，(2001)
发明内容
发明要解决的课题本发明是为了能够解决上述课题而进行的发明，其目的在于提供安全、快速且廉价的判断与乙醇敏感度相关的基因的基因型的方法。解决课题的手段本发明是判断乙醇敏感度相关基因的基因型的方法，其特征在于，该方法包括使含有上述基因的固体待测样品与含有缓冲液和DNA聚合酶的溶液，以及用于扩增上述基因的引物DNA直接接触，实施选自聚合酶链式反应、LAMP法、链置换扩增、逆转录酶链置换扩增、逆转录酶聚合酶链式反应、逆转录LAMP法、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增和滚环扩增法的方法，扩增上述基因的步骤，和根据上述扩增的基因，判断所述基因的基因型的步骤。本发明中的乙醇敏感度相关基因优选是乙醇脱氢酶ADHlB基因、乙醛脱氢酶ALDH2基因和细胞色素CYP2E1基因中的至少一个基因。本发明中的固体待测样品理想的是血液的干燥物、毛根或唾液的干燥物。本发明的基因型判断方法优选同时扩增选自乙醇脱氢酶ADHlB基因、乙醛脱氢酶ALDH2基因和细胞色素CYP2E1基因中的至少2个，同时判断基因型。发明的效果通过本发明，提供了安全、快速且廉价的判断与乙醇敏感度相关的基因的基因型的方法。
图1 模式化的示意本发明的一个优选实例的图。图2 模式化的示意乙醇在体内被分解直到排泄到体外的图。图3 显示实施例1的结果的电泳照片。图4 显示实施例2的结果的电泳照片。图5 显示实施例3的结果的电泳照片。图6 显示实施例4的结果的电泳照片。
图7 显示实施例5的结果的电泳照片。图 8 显示了实施例 6 中的通过使用 Taqman Genotyping Master Mix (AppliedBiosystems公司生产)的TaqMan方法，判断ADHlB的结果的图。图 9 显示了实施例 6 中的通过使用 Taqman Genotyping Master Mix (AppliedBiosystems公司生产)的TaqMan方法，判断ALDH2的结果的图。图10 显示了实施例6中的通过使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0(株)生产)的TaqMan方法，判断ADHlB的结果的图(使用干燥滤纸唾液)。图11 显示了实施例6中的通过使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0(株)生产)的TaqMan方法，判断ALDH2的结果的图(使用干燥滤纸唾液)。图12 显示了实施例6中的通过使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0(株)生产)的TaqMan方法，判断ADHlB的结果的图(使用干燥滤纸血液)。图13 显示了实施例6中的通过使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0(株)生产)的TaqMan方法，判断ALDH2的结果的图(使用干燥滤纸血液)。图14 显示了实施例6中的通过使用RNA-direct RT-PCR MasterMiX(T0Y0B0 (株)生产)的TaqMan方法，判断ADHlB的结果的图(使用干燥滤纸唾液)。图15:显示了实施例6中的通过使用RNA-direct RT-PCR MasterMiX(T0Y0B0 (株)生产)的TaqMan方法，判断ALDH2的结果的图(使用干燥滤纸唾液)。图16 显示了实施例6中的通过使用RNA-direct RT-PCR MasterMiX(T0Y0B0 (株)生产)的TaqMan方法，判断ADHlB的结果的图(使用干燥滤纸血液)。图17:显示了实施例6中的通过使用RNA-direct RT-PCR MasterMiX(T0Y0B0 (株)生产)的TaqMan方法，判断ALDH2的结果的图(使用干燥滤纸血液)。
具体实施例方式图1是模式化的示意本发明的一个优选实例的图。本发明是判断乙醇敏感度相关基因的基因型的方法，其包括使含有上述基因的固体待测样品与含有缓冲液和DNA聚合酶的溶液，以及用于扩增上述基因的引物DNA直接接触，实施选自聚合酶链式反应、LAMP (环介导等温扩增(Loop-Mediated Isothermal Amplification))法、链置换扩增、逆转录酶链置换扩增、逆转录酶聚合酶链式反应、逆转录LAMP法、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增和滚环扩增法的方法，扩增上述基因的步骤，和根据上述扩增的基因，判断所述基因的基因型的步骤。下文参考图1详细地说明本发明的方法。在图1中显示的实例中，首先，通过直接采集固体待测样品或干燥液体物质，从检测对象采集含乙醇敏感度相关基因的固体待测样品。在直接采集固体待测样品的情况下，以选自检测对象的毛根、口腔粘膜和细胞组织的固体作为固体待测样品，直接提供给到后续步骤。需要说明的是，毛根只要是包括头发、眉毛、鼻毛、胡须、阴毛、腋毛在内的全部体毛来源的毛根即可，没有特殊的限制。由于毛根是从根部拔出毛发而获得的，因此能够相对不伴随疼痛而采集，而口腔粘膜是用棉签等在口中轻轻拭取皮肤而采集，可以无痛采集。此外，口腔粘膜也可以在采集后使其直接置于室温干燥而成为固体状态。优选将细胞组织干燥到直接使用的程度，特别优选水含量在O%以上且低于50%。此外，优选细胞组织被细微粉碎。
此外，在通过干燥液体物质来采集固体待测样品的情况下，将使选自检测对象的鼻涕、鼻拭子、眼结膜拭子、咽拭子、喀痰、粪便、血液、血浆、脊髓液、唾液(一般包括口腔粘膜)、尿、汗、精液和细胞组织中的液体物质干燥从而获得的固体物质供给到后续步骤。在本文中，含在液体物质中的细胞组织表示含水量在50%以上的物质。需要说明的是，所述口腔粘膜也可以在适当干燥后使用。在本文中，干燥液体物质的方法可以选自如下的公知的干燥方法将液体物质浸透到滤纸中、蒸发水分的方法，自然干燥或冷冻干燥等。但是，为了获得粪便来源的固体待测样品，优选将粪便涂抹在植物纤维物体上，在将植物纤维物体自然干燥后，与硅胶一起密封并保存1小时以上。植物纤维物体是指纸、棉等植物性的纤维物体。通过干燥液体物质并作为固体待测样品，可以抑制原来包含在液体物质中的蛋白酶、淀粉酶和核酸酶等的酶活性，可以不完全杀死生物体组织细胞、微生物和病毒而使其生命活动休止。因而，固体待测样品的运输、保存等可以在室温下进行，具有变得更方便的优点ο在本发明的基因型判断方法中，上述步骤中，从采集获得的细胞数量是一定的，且可以为基因型判断提供稳定量的模板，再现性好这样的观点来看，优选固体待测样品为血液或唾液的干燥物或者是毛根，此外，由于如上所述是从根部拔出毛发，能够相对不伴随疼痛而采集，因此固体待测样品特别优选是毛根。需要说明的是，在固体待测样品是血液的干燥物的情况下，与传统的乙醇敏感度相关基因的基因型判断方法相比，具有血液采集量较少即可以判断的优点。图1中，显示了从检测对象中小心地拔出含有毛根2的头发1，作为固体待测样品来采集的实例。在本文中，图2是模式化的示意乙醇在体内被分解直到排泄到体外的图。被摄入体内的乙醇一般首先通过乙醇脱氢酶ADH、肝微粒体氧化体系的细胞色素CYP2E1等被分解为乙醛。乙醛通过乙醛脱氢酶(ALDH)被分解为乙酸。之后，乙酸在被分解为水和二氧化碳后，被排泄到体外。本发明中的“乙醇敏感度相关基因”指与此类乙醇代谢相关的酶的基因，优选是乙醇脱氢酶ADHlB基因、乙醛脱氢酶ALDH2基因和细胞色素CYP2E1基因中的至少一个基因。如上所述，在乙醇脱氢酶ADHlB基因中存在基因型ADHB1*1 (SEQ IDNO :1所示碱基序列)和基因型ADHB1*2(SEQ ID NO :2所示碱基序列)，已知约60%的日本人具有乙醇脱氢酶ADH具有正常活性(酶活性200)的等位基因ADHB1*2A2，约35%的日本人具有乙醇脱氢酶ADH具有正常活性(酶活性100)的等位基因ADHB1*1#2，约5%的日本人具有乙醇脱氢酶ADH具有低活性(酶活性1)的等位基因ADHB1*1/*1。此外，在乙醛脱氢酶ALDH2基因中存在基因型ALDH2*1 (SEQ ID NO 3所示碱基序列)和基因型ALDH2M (SEQ ID NO 4所示碱基序列)，已知约56%的日本人具有乙醛脱氢酶ADH具有正常活性(酶活性100)的等位基因ALDH2*1/*1，约40%的日本人具有低乙醛脱氢酶ADH活性(酶活性6)的等位基因ALDH2*l/*2，约4%的日本人具有乙醛脱氢酶ADH为无活性型(酶活性0)的等位基因ALDH2M/*2。进一步的，在细胞色素CYP2E1基因中已知有基因型CYP2El*cl(SEQID NO :5所示碱基序列)和基因型CYP2El*c2(SEQ ID NO 6所示碱基序列)。需要说明的是，本发明中的乙醇敏感度相关基因可适用的长度一般为20至数十万碱基左右，优选50至3000个碱基。本发明的基因型判断方法中，接下来，将如上所述采集的固体待测样品与含有缓冲液和DNA聚合酶的溶液，以及用于扩增特定基因的引物DNA直接接触，实施选自聚合酶链式反应、LAMP法、链置换扩增、逆转录酶链置换扩增、逆转录酶聚合酶链式反应、逆转录LAMP法、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增和滚环扩增法的方法，扩增包含在固体待测样品中的乙醇敏感度相关基因。本步骤优选在板状或管状的担载体上扩增上述基因。具体而言，首先将试剂放在板状或管状的担载体上。在管状担载体的情况下，试剂放入其内部，在板状担载体的情况下，试剂放在其表面。该试剂含有包含缓冲液和DNA聚合酶的溶液，以及引物DNA。在担载体上放置固体待测样品从而使试剂和固体待测样品直接接触，通过公知的方法，通过选自聚合酶链式反应、LAMP法、链置换扩增、逆转录酶链置换扩增、逆转录酶聚合酶链式反应、逆转录LAMP法、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增和滚环扩增法的方法扩增基因。需要说明的是，也可以在担载体上放置固体待测样品，然后再在担载体上放置试剂。图1中显示了在管状担载体3的内部放入PCR反应溶液4，再在担载体3中放入作为固体待测样品的头发1，使固体待测样品与PCR反应溶液接触，然后在管状的担载体3上盖上盖5，进行PCR反应的实例。在本步骤中，DNA聚合酶只要是以Taq DNA聚合酶为代表的耐热性DNA聚合酶即可，没有特殊的限制，但优选使用KOD DNA聚合酶。对缓冲液而言，只要是即使在包含于固体待测样品中的抑制PCR反应的物质存在的条件下，缓冲液也可以扩增DNA即可，没有特殊的限制，但优选使用feWay (商标)(KOMA Biotechnology)、AmpdireCt (注册商标)(岛津制作所)、Phusion (注册商标)Blood Direct PCR试剂盒缓冲液(New ENGLANDBio-Labs) ,KODFX缓冲液(Τ0Υ0Β0)等，特别优选使用为KOD DNA聚合酶开发的KOD FX缓冲液(Τ0Υ0Β0)。在构成乙醇敏感度相关基因的核酸是DNA的情况下，可以进行直接PCR法或LAMP法等。此外，在所述核酸是RNA片段的情况下，在RNA片段进行逆转录反应后，可以使用聚合酶链式反应(PCR)、LAMP 法、链置换扩增(SDA Strand Displacement Amplification)、逆转录酶链置换扩增(RT(逆转录)_SDA)、逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)、逆转录 LAMP 法(RT-LAMP)、基于核酸序列的扩增(NASBA =Nucleic Acid Sequence-BasedAmplification)、转录介导的扩增(TMA =Transcription-MediatedAmplification)和滚环扩增法等基因扩增方法进行扩增。需要说明的是，PCR等的扩增条件只要引起特异性扩增即可，没有其他特殊限制，可以进行恰当设定。需要说明的是，在本发明中，优选同时扩增选自乙醇脱氢酶ADHlB基因、乙醛脱氢酶ALDH2基因和细胞色素CYP2E1基因中的至少2个，同时判断基因型。本发明中用于PCR法的引物DNA只要可以特异性的扩增乙醇敏感度相关基因即可，没有特殊的限制，此外，可以用适当公知的方法来设计。需要说明的是，因为可以用简单的步骤判断基因型，在PCR方法中优选利用等位基因扩增(ASP :Allele SpecificPrimer)-PCR 法和 PCR-RFLP (限制性酶切片段长度多态性Restriction Fragment LengthPolymorphism)法，故使用为此设计的引物DNA是优选的。此外，在本发明中，PCR方法可利用TaqMan方法。TaqMan方法是利用荧光标记的等位基因特异性寡核苷酸(TaqMan探针)和TaqDNA聚合酶的PCR方法(例如，参见Genet.Anal.，14143-149 (1999)，J. Clin. Microbiol.，34，2933-2936 (1996)等)。针对包含目标序列的区域设计引物，TaqMan探针设置在其间。在该探针的5’末端侧标记报告荧光色素 (R)，在3’末端侧标记淬灭剂荧光色素⑴)。通过设计探针的Tm值比引物的Tm值高10°C， 从而首先杂交探针。然后杂交引物，通过DNA聚合酶的5’-3’外切核酸酶活性，逐个碱基的水解TaqMan探针，游离出报告荧光色素。利用该游离的报告色素的强度与PCR产物成比例这一点。在用TaqMan方法解析基因的情况下，可以恰当的确定引物和探针的具体的核苷酸序列。5’末端侧的报告荧光色素和3’末端侧的淬灭剂荧光色素这两种荧光标记物只要是可以相互识别的组合即可，这类荧光标记物的组合可以使用各自公知产品。适当的具体实例可列举6-FAM(注册商标)、VIC (注册商标)和TET (注册商标)的任何组合。需要说明的是，上述引物和探针只不过是一个例子，如果是寡核苷酸引物则只要不妨碍能够进行目的扩增反应，而另一方面如果是寡核苷酸探针则只要不妨碍能够进行目标杂交反应即可，在一部分碱基序列中也可以进行缺失、取代、插入和/或添加等改变。发生改变的碱基数可以是例如1-5个，优选1-3个。需要说明的是，此类改变原则上在与多态性位点对应的碱基以外的部分中进行。用于多态性解析的寡核苷酸(探针、引物)可使用与解析方法对应的恰当的DNA 片段或RNA片段。用于多态性解析的寡核苷酸的碱基长度只要是能发挥各自功能的长度即可，以在用作引物的情况下的碱基长度为例，是15-30个碱基的长度，优选18-25个碱基左右的长度。根据所使用的检测方法适当地设定所扩增的多核苷酸的长度，一般而言是20-500 个碱基的长度，优选20-200个碱基的长度。本发明的引物和探针在其序列末端还包括添加了用于检测的恰当标记。作为标记，可列举例如ROX(注册商标)、FITC(注册商标；荧光黄)、TET(注册商标)、Cy5(注册商标)、HEX (注册商标)、NED (注册商标)、6-FAM (注册商标)、ROX (注册商标)、TAMRA (注册商标)、罗丹明(rhodamin)或它们的衍生物等荧光色素、酶、蛋白质、放射性物质、生物素、 硫醇等，但不限于此。用荧光色素标记碱基的方法，可使用公知的方法。此外，也可以使用市售的荧光标记试剂盒。用于多态性解析的寡核苷酸(探针、引物)的合成具体可通过普通的亚磷酰胺法、 磷酸三酯法等化学合成法，或者可使用市售的自动化寡核苷酸合成装置(例如Wiarmacia LKB Gene Assembler Plus :Pharmacia公司生产)等来合成。或者可以使用用户合成的寡核苷酸。在本文中，作为本发明所称的“不溶性担载体”，除了由塑料、玻璃等组成的管之外，还可列举96孔板等。所谓的管状，是指中空的状态，可以是具有底的PCR管或Eppendorf 管这样的形状。如上所述，在担载体表面固定探针DNA是特别优选的。这是因为固体待测样品中的乙醇敏感度相关基因经由固定在管状担载体上的寡聚DNA(探针DNA)通过杂交而被捕获，可以利用RT-PCR法进行基因扩增，或者在担载体上的液相中扩增特定基因，同时用固定在板状担载体中的多种探针DNA检测多种生物体的特异性基因，从而具有可以包罗性的检测基因多态性(SNP)的优点。
然后，通过选自聚合酶链式反应、LAMP法、链置换扩增、逆转录酶链置换扩增、逆转录酶聚合酶链式反应、逆转录LAMP法、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增和滚环扩增法的方法，扩增乙醇敏感度相关基因。在本发明的基因型判断方法中，随后根据如上所述扩增的基因判断该基因的基因型。该步骤中的解析方法只要能够检测或定量所扩增的基因即可，没有特殊的限制，可列举选自DNA测序法、凝胶电泳法、通过平板状DNA芯片或珠的杂交、Realtime PCR法和利用探针DNA的延伸反应，或通过杂交的基因测定法中的任何方法。通过凝胶电泳法，可以评估 PCR扩增产物的量及其大小。此外，通过Realtime PCR法，可以快速的定量PCR扩增产物。 在采用Realtime PCR法的情况下，一般而言，由于扩增循环数到1_10时，荧光强度的变化与作为噪音水平的零相等，因此将其作为扩增产物零的空白样品，计算出它们的标准偏差， 乘以10后的荧光值作为阈值，最初高于该阈值的PCR循环数被称为循环数阈值(Ct值)。 因此，在PCR反应溶液中，初始的DNA模板量越多，则Ct值越小，模板DNA量越少，则Ct值越大。此外，即使模板DNA的量相同，在该模板内的PCR特定基因发生切割的比例越高，则同区域的PCR反应的Ct值越大。根据本发明，可以安全、快速且廉价的判断乙醇敏感度相关基因的基因型。由此使得能够以比传统安全、快速且廉价得多的构建乙醇敏感度相关基因的检测系统。此类基因检测系统可用于预防未成年人饮酒的酒精健康教育、面向通过基因诊断的定制医疗的普及以及理解的启蒙活动，用于针对酒精的安心及安全的健康管理等。实施例下面，列举实施例更详细的说明本发明，但本发明不限于这些实施例。〈实施例1>(1)通过PCR-RFLP法判断基因型按以下顺序，针对从检测对象分别采集的血液(全血)、唾液(包含口腔内的细胞)、毛根，进行乙醇脱氢酶ADHlB基因和乙醛脱氢酶ALDH2基因的基因多态性检测。对于血液和唾液，浸透在滤纸(Advantec定性滤纸No. 2)上，使其自然干燥，作为固体待测样品采集。省略了一般进行的DNA提取、纯化过程，将该干燥滤纸的直径Imm的打孔片("千片)直接放入管状担载体内的PCR反应溶液中。此外，对于毛根，将其直接放入管状担载体内的PCR反应溶液中。PCR反应溶液使用PCR试剂盒KOD FX (Τ0Υ0Β0 (株)生产)，遵循所附规程，分别配制含以下试剂的25 μ L反应溶液。(用于ADHlB基因的PCR反应溶液)· KOD FX 的 2 X PCR 缓冲液:7· 5 μ L‘ dNTP 1. 5μ L 引物 1 (ADHlB-F) (10 μ Μ) :0. 6M1 引物 2 (ADHlB-R) (10 μ Μ) :0. 6 μ L· KOD FX :0. 3Μ1.DW(蒸馏水)4.5yL。(用于ALDH2基因的PCR反应溶液)· KOD FX 的 2 X PCR 缓冲液:7· 5 μ L‘ dNTP 1. 5μ L
弓丨物 3 (ALDH2-F) (10 μ Μ) :0. 6 μ L·引物 4(ALDH2_R) (10 μ Μ) :0. 6 μ L‘ KOD FX :0. 3μ L.DW(蒸馏水)4.5yL。需要说明的是，作为ADHlB基因用的PCR-RFLP引物使用以下2种。 引物 I(ADHlB-F) :5，-CCTTGGGGATAAACTGAATCTT-3，(SEQ IDNO 7)·引物 2 (ADHlB-R) :5，-GAAATCCTGGATGGTGAACC-3，(SEQ ID NO :8)。此外，作为ALDH2基因用的PCR-RFLP引物使用以下2种。·引物 3(ALDH2-F) :5，-TCAAATTACAGGGTCAACTGCT-3，(SEQ IDNO 9)·引物 4(ALDH2-R) :5，-GGCTGGGTCTTTACCCTCTC-3，(SEQ ID N0:10)。给管状的担载体盖上盖，用以下扩增条件进行PCR反应。(扩增条件)热变性95°C，5分钟98 "C，10 秒一60 "C，30 秒一74 °C，45 秒，循环 40 次延伸反应74 °C，2分钟。PCR反应后获得的ADHlB基因的扩增产物是349bp。将该ADHlB基因的扩增产物在以下组成的反应溶液中37°C进行1小时的限制性酶切反应。(用于ADHlB基因的限制性酶切反应溶液)· 10XNEB 缓冲液 4 :2 μ L· ADHlB基因的扩增产物6 μ L· Msl 1 :0. 25 μ L蒸馏水)11.75yL。此外，PCR反应后获得的ALDH2基因的扩增产物是430bp。将该ALDH2基因的扩增产物在以下组成的反应溶液中37°C进行1小时的限制性酶切反应。(用于ALDH2基因的限制性酶切反应溶液)· 10XNEB 缓冲液 4 :2 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· ALDH2基因的扩增产物6 μ L· Acu 1 :0. 25 μ L蒸馏水)9.25yL。将反应后的ADHlB基因、ALDH2基因的限制性酶切处理片段分别上样至琼脂糖凝胶，利用电泳确定所扩增的基因。图3是显示实施例1的结果的电泳照片。需要说明的是，从图3中，已知分别获得了 189bp、160bp的ADHlB基因的限制性酶切处理片段，296bp、134bp 的ALDH2基因的限制性酶切处理片段。在图3(a)中，各条带显示了以下结果。·条带 1(血液)·条带 2 :ADHlB*2/*2 (唾液)·条带 3 :ADHlB*2/*2 (毛根)·条带 4 :ALDH2*2/*2 (血液)条带 5 :ALDH2*2/*2 (唾液) 条带 6 :ALDH2*2/*2 (毛根)。 在图3(b)中，各条带显示了以下结果t 条带 1 :ADHlB*2/*2 (血液) 条带 2 :ADHlB*2/*2 (唾液) 条带 3 :ADHlB*2/*2 (毛根) 条带 4 :ALDH2*1/*1 (血液) 条带 5 :ALDH2*1/*1 (唾液) 条带 6 :ALDH2*1/*1 (毛根)。 在图3(c)中，各条带显示了以下结果t 条带 1 :ADHlB*2/*2 (血液) 条带 2 :ADHlB*2/*2 (唾液) 条带 3 =ADHlB(毛根)
条带 4:ALDH2 *1/*2(血液) 条带 5:ALDH2 *1/*2(唾液) 条带 6:ALDH2 *1/*2(毛根)。 在图3(d)中，各条带显示了以下结果t 条带 1 :ADH1B *1/*1 (血液) *1/*1 (唾液) *1/*1(毛根) *1/*1(血液) *1/*1 (唾液) *1/*1(毛根)。 在图3(e)中，各条带显示了以下结果t 条带 1 :ADH1B *1/*1 (血液) *1/*1 (唾液) *1/*1(毛根)
氺 1/氺 2 (lit)
*1/*2(唾液) *1/*2(毛根)。 在图3(f)中，各条带显示了以下结果t 条带 1 :ADH1B *1/*2(血液) *1/*2(唾液) *1/*2(毛根) *1/*1(血液) *1/*1 (唾液) *1/*1(毛根)。 在图3(g)中，各条带显示了以下结果t 条带 1 :ADH1B *1/*2(血液)
条带 2 =ADHlB 条带 3 =ADHlB 条带 4 :ALDH2 条带 5 :ALDH2 条带 6 :ALDH2
条带 2 =ADHlB 条带 3 =ADHlB 条带 4 :ALDH2 条带 5 :ALDH2 条带 6 :ALDH2
条带 2 =ADHlB 条带 3 =ADHlB 条带 4 :ALDH2 条带 5 :ALDH2 条带 6 :ALDH2
·条带 2 =ADHlB(唾液) 条带 3:ADH1B *1/*2(毛根)·条带 4 :ALDH2(血液)·条带 5 :ALDH2(唾液)·条带 6 :ALDH2(毛根)。〈实施例2>与实施例1同样的将采集的血液浸透滤纸(Advantec定性滤纸No. 2)，使其自然干燥，作为固体待测样品，将该干燥滤纸的直径Imm的打孔片直接放入管状担载体内的PCR反应溶液中。PCR反应溶液使用PCR试剂盒K0DFX(T0Y0B0(株)生产)，遵循所附规程，分别配制含以下试剂的25 μ L反应溶液。
0173](用于ADHlB基因的PCR反应溶液)
0174]· KOD FX 的 2 X PCR 缓冲液10 μ L
0175]· dNTP :2μ L
0176] 弓丨物 5 (ADHlB-F) (10 μ Μ) :0· 8μ L
0177] 弓丨物 6 (ADHlB-R) (10 μ Μ) :0· 8μ L
0178]· KOD FX :0· 4μ L
0179]· DW(蒸馏水)6yL。
0180](用于ALDH2基因的PCR反应溶液) 0181 ]· KOD FX 的 2 X PCR 缓冲液10 μ L
0182]· dNTP :2μ L
0183] 引物 7(ALDH2_F) (ΙΟμΜ) :0· 8μ L
0184] 引物 8(ALDH2_R) (ΙΟμΜ) :0. 8μ L
0185]‘ KOD FX :0. 4μ L
0186]· DW(蒸馏水)6yL。
0187]需要说明的是，作为用于ADHlB基因的PCR-RFLP引物使用以下2种。
0188]·引物 5 (ADHlB-F) :5，-GGAAGGTAGAGAAGGGCTTTAGACTG-3，(SEQ ID NO 11)
0189]·引物 6 (ADHlB-R) :5，-GTGCAAGCACTTTCGTCTCTCATTG-3，(SEQID NO 12)。
0190]需要说明的是，作为用于ALDH2基因的PCR-RFLP引物使用以下2种。
0191]·引物 7(ALDH2-F) :5，-TGGGCGAGTACGGGCTGCAGGCAIAGACT-3，(SEQ ID NO 13)
0192]·引物 8(ALDH2-R) :5，-CCGGCAGGTCCTGAACCTCTGGCAGGC—3，(SEQ ID NO: 14)。
0193]给管状的担载体盖上盖，用以下扩增条件分别独立的进行ADHlB基因、ALDH2基因的PCR反应。
0194](扩增条件)
0195]热变性95°C，10分钟
0196]98 "C，10 秒一62 "C，30 秒一74°C，30 秒，循环 40 次
0197]延伸反应74°C，2分钟。
0198]PCR反应后获得的ADHlB基因的扩增产物是428bp。将该ADHlB基因的扩增产物在以下组成的反应溶液中37°C进行1小时的限制性酶切反应。(用于ADHlB基因的限制性酶切反应溶液)
· 10 XNEB 缓冲液 4 :2 μ L· ADHlB基因的扩增产物6 μ L· Msl 1 :0. 5μ L.DW(蒸馏水)11.5yL。此外，PCR反应后获得的ALDH2基因的扩增产物是169bp。将该ALDH2基因的扩增产物在以下组成的反应溶液中37°C进行1小时的限制性酶切反应。(用于ALDH2基因的限制性酶切反应溶液)· 10 XNEB 缓冲液 4 :2 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· ALDH2基因的扩增产物6 μ L· Acu 1 :0. 5μ L蒸馏水)9.25yL。将反应后的ADHlB基因、ALDH2基因的限制性酶切处理片段分别上样至琼脂糖凝胶，利用电泳确定所扩增的基因。需要说明的是，作为对照，还使用了 DW。图4是显示实施例2的结果的电泳照片。需要说明的是，从图4中，已知分别获得了 217bp、211bp的ADHlB 基因的限制性酶切处理片段，48bp、121bp的ALDH2基因的限制性酶切处理片段。在图4(a)中，各条带显示了以下结果。·条带 1 :ADHlB*l/*2 条带 2 :ADH1B*1/*1 条带 3 :ADH1B*1A2 条带 4:而。在图4(b)中，各条带显示了以下结果。·条带 1 :ALDH2*lA2 条带 2 :ALDH2*2A2·条带 3 :ALDH2*2/*2 条带 4:而。<实施例3>使用以下限制性酶切反应溶液，将与实施例2同样获得的ADHlB基因、ALDH2基因的扩增产物，同时在37°C进行限制性酶切反应1小时。(限制性酶切反应溶液)· 10 XNEB 缓冲液 4 :2 μ L· ADHlB基因的扩增产物3 μ L· ALDH2基因的扩增产物3 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· Msl 1 :0. 5μ L· Acu 1 :0. 5μ L蒸馏水)8.5yL。将反应后的ADHlB基因、ALDH2基因的限制性酶切处理片段分别上样至琼脂糖凝胶，利用电泳确定所扩增的基因。需要说明的是，作为对照，还使用了 DW。图5是显示实施
14例3的结果的电泳照片。在图5中，各条带显示了以下结果。·条带 1 :ADHlB*l/*2、ALDH2*l/*2·条带 2 :ADHlB*l/*l、ALDH2M/*2·条带 3 :ADHlB*l/*2、ALDH2*2/*2·条带 4 =Dff0<实施例4>与实施例1同样的将采集的血液浸透滤纸(Advantec定性滤纸No. 2)，使其自然干燥，作为固体待测样品，将该干燥滤纸的直径Imm的打孔片直接放入管状担载体内的PCR反应溶液中。PCR反应溶液使用PCR试剂盒K0DFX(T0Y0B0(株)生产)，遵循所附规程，分别配制含以下试剂的25 μ L反应溶液。(PCR反应溶液)· KOD FX 的 2 X PCR 缓冲液10 μ L‘ dNTP :2μ L 引物 5 (ADHlB-F) (10 μ Μ) :0. 4 μ L 引物 6 (ADHlB-R) (10 μ Μ) :0. 4 μ L 弓 I物 7 (ALDH2-F) (10 μ Μ) :0· 8 μ L 弓 I物 8 (ALDH2-R) (10 μ Μ) :0· 8 μ L‘ KOD FX 0. 4μ L 而(蒸馏水)5.2口1^。给管状的担载体盖上盖，用以下扩增条件，同时进行ADHlB基因、ALDH2基因的PCR反应。(扩增条件)热变性95°C，10分钟98 "C，10 秒一62 "C，30 秒一74°C，30 秒，循环 40 次延伸反应74 °C，2分钟。使用以下组成的限制性酶切反应溶液，将所获得的PCR扩增产物在37°C进行1小时的限制性酶切反应。(限制性酶切反应溶液)· 10XNEB 缓冲液 4 :2 μ L· PCR 扩增产物6 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· Msl 1 :0. 5μ L· Acu 1 :0. 5μ L蒸馏水)8.5yL。将反应后的限制性酶切处理片段分别上样至琼脂糖凝胶，利用电泳确定所扩增的基因。需要说明的是，作为对照，还使用了 DW。图6是显示实施例4的结果的电泳照片。在图6中，各条带显示了以下结果。·条带 1 :ADHlB*l/*2、ALDH2*l/*2
·条带 2 :ADHlB*l/*l、ALDH2M/*2·条带 3 :ADHlB*l/*2、ALDH2*2/*2 条带4 :DW(蒸馏水)。<实施例5>与实施例1同样的将采集的血液浸透滤纸(Advantec定性滤纸No. 2)，使其自然干燥，作为固体待测样品，将该干燥滤纸的直径Imm的打孔片直接放入管状担载体内的PCR反应溶液中。PCR反应溶液使用PCR试剂盒K0DFX(T0Y0B0(株)生产)，遵循所附规程，分别配制含以下试剂的25 μ L反应溶液。(PCR反应溶液)· KOD FX 的 2 X PCR 缓冲液12. 5 μ L‘ dNTP 2. 5μ L 引物 9(CYP2E1_F) (ΙΟμΜ) :1 μ L·引物 10(CYP2E1-R) (ΙΟμΜ) :1 μ L‘ KOD FX 0. 5μ L蒸馏水)7.5yL。需要说明的是，作为用于CYP2E1基因的PCR-RFLP引物，使用以下2种。·引物 9(CYP2E 1-F) :5，-CCAGTCGAGTCTACATTGTCA-3，(SEQ IDNO 15)·引物 10(CYP2E1-R) :5，-TTCATTCTGTCTTCTAACTGG-3，(SEQ IDNO :16)。给管状的担载体盖上盖，用以下扩增条件同时进行CYP2E1基因的PCR反应。(扩增条件)热变性95°C，10分钟98 "C，10 秒—55 "C，30 秒—74°C，30 秒，循环 40 次延伸反应74 °C，2分钟。PCR反应后获得的CYP2E1基因的扩增产物为410bp。将该CYP2E1基因的扩增产物在以下组成的限制性酶切反应溶液中，37°C进行1小时的限制性酶切反应。(限制性酶反应溶液)· IOXNEB 缓冲液 4 :2 μ L· PCR 扩增产物6 μ L· 8XSAM 2. 5μ L· Pst 1 :0. 5μ L.DW(蒸馏水)11.5yL。将反应后的限制性酶切处理片段分别上样至琼脂糖凝胶，利用电泳确定所扩增的基因。图7是显示实施例5的结果的电泳照片。在图7中，各条带显示了以下结果。·条带 1 :CYP2El*cl/*cl·条带 2 :CYP2El*cl/*c2·条带 3 :CYP2El*c2/*c2。<实施例6>按以下顺序，针对分别从检测对象(被检测者A、B、C、D)采集的唾液(包含口腔内的细胞)或血液，使用Realtime PCR装置ABI7300 (Applied Biosystems公司生产)，通过 TaqMan (注册商标)法进行乙醇脱氢酶ADHlB基因和乙醛脱氢酶ALDH2基因的基因多态性的检测。对于唾液或血液，浸透在滤纸(Advantec定性滤纸No. 2)中，使其自然干燥，作为固 #Ι# #[ πΜ_。 $ Taqman Genotyping Master Mix (Applied Biosystems)白勺
情况下，省略了一般进行的DNA提取、纯化过程，将该干燥滤纸的直径2mm的打孔片1片放入装有10 μ L水的Eppendorf管中，于90°C加热10分钟。将其5 μ L的上清液放入TaqMan 反应溶液中。在使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造和 RNA-directRT-PCR Master Mix (T0Y0B0 (株)制造)的情况下，如下调整干燥滤纸唾液或干燥滤纸血液加热处理的上清。将干燥滤纸唾液或干燥滤纸血液的1张直径2mm的打孔片放入装有含IM甜菜碱的10 μ LPCR缓冲液的Eppendorf管中，90°C加热10分钟。将其5 μ L的上清液放入TaqMan 反应溶液中。在此，已知血液中含有大量抑制PCR的物质，以此为模板不能成功的进行PCR。 迄今为止，在以血液为样品的PCR中，Tth DNA聚合酶比Taq DNA聚合酶更有利，血液中的抑制物质是血红蛋白、乳铁蛋白，已报道BSA或甜菜碱可作为添加剂有效回避抑制物质的影响。另一方面，已知作为抗凝血剂的肝素也抑制PCR(例如，参见Michael P.和Andrew L.， Nucleic Acids Reserch，19，1151 (1991)(非专利文献 8) ；Henke W.，Herdel K.，Jung K.， Schnorr D.和 Loening A. S.，Nucleic Acids Reserch，25，3957 (1997)(非专利文献 9)； Waleed Α. A.和 Peter R.，J. clin. Microbiol.，39，485-493 (2001)(非专利文献 10)等)。在通过TaqMan法判断基因中，探针和引物对使用Applied Biosystems公司的 TaqMan(注册商标)SNP基因分型测定试剂盒，PCR扩增使用TaqmanGenotyping Master Mix (Applied Biosystems 公司生产)、Realtime PCR MasterMix (T0Y0B0 (株)生产)或 RNA-direct RT-PCR Master Mix (T0Y0B0(株)生产)，分别配制含有以下试剂的20 μ L反应溶液。基因型的判断是根据该反应的结果，按附带的规程通过检测到的2色荧光强度来判断。(用于ADHlB基因的TaqMan探针和引物对)· TaqMan(注册商标)药物代谢基因分型测定(Drug Metabolism Genotyping Assays) (Applied Biosystems 公司生产)·基因名称乙醇脱氢酶IB (I类)，beta多肽· iTac1Man (注册商标)SNP Genotyping Assay Mix ID :C_2688467_20。(用于ADHlB基因的TaqMan反应溶液)〈在使用 Taqman Genotyping Master Mix (Applied Biosystems 公司生产)的情况下〉· Taqman Genotyping Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ L·干燥滤纸唾液加热处理的上清5 μ L· DW(蒸馏水)4yL。〈在使用Realtime PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情况下〉· Realtime PCR Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ LCN 102549171 A_
·干燥滤纸唾液加热处理的上清5 μ L· DW(蒸馏水)4yL。< 在使用 Realtime PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情况下 >· Realtime PCR Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ L·干燥滤纸血液加热处理的上清5 μ L· DW(蒸馏水)4yL。〈在使用RNA-direct RT-PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情况下〉· RNA-direct RT-PCR Master Mix :10 μ L· 25mM MgSO4 1 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ L·干燥滤纸唾液加热处理的上清5 μ L· DW(蒸馏水)3yL。〈在使用RNA-direct RT-PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情况下〉· RNA-direct RT-PCR Master Mix :10 μ L· 25mM MgSO4 1 μ L· Taqman Assay Mix C_2688467_20 :1 μ L·干燥滤纸血液加热处理的上清5 μ L· DW(蒸馏水)3yL。(用于ALDH2基因的TaqMan探针和引物对)·TaqMan (注册商标)Drug Metabolism Genotyping Assays (Applied Biosystems 公司生产)·基因名称乙醛脱氢酶2家族(线粒体的)· TaqMan (注册商标)SNP Genotyping Assay Mix ID :C_11703892_10。<Taqman Genotyping Master Mix (Applied Biosystems ^W]^zfe )白勺If 况下〉· Taqman Genotyping Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥滤纸唾液加热处理的上清5 μ L· DW(蒸馏水)4yL。< 在使用 Realtime PCR Master Mix(T0Y0B 0(株)制造)的情况下 >· Realtime PCR Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥滤纸唾液加热处理的上清5 μ L· DW(蒸馏水)4yL。< 在使用 Realtime PCR Master Mix(T0Y0B0 (株)制造)的情况下 >· Realtime PCR Master Mix :10 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥滤纸血液加热处理的上清5 μ L
· DW(蒸馏水)4yL。< 在使用 RNA-direct RT-PCR Master Mix(T0Y0B0 (株)制造)的情况下 >· RNA-direct RT-PCR Master Mix :10 μ L· 25mM MgSO4 1 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥滤纸唾液加热处理的上清5 μ L· DW(蒸馏水)3yL。< 在使用 RNA-direct RT-PCR Master Mix(T0Y0B0 (株)制造)的情况下 >· RNA-direct RT-PCR Master Mix :10 μ L· 25mM MgSO4 1 μ L· Taqman Assay Mix C_11703892_10 :1 μ L·干燥滤纸血液加热处理的上清5 μ L· DW(蒸馏水)3yL。(扩增条件)热变性95°C，10分钟95"C，15 秒一60°C，1 分钟，40 个循环。样品如下所示。表 权利要求
1.一种判断基因型的方法，其是判断乙醇敏感度相关基因的基因型的方法，该方法包括使含有所述基因的固体待测样品与含有缓冲液和DNA聚合酶的溶液，以及用于扩增所述基因的引物DNA直接接触，实施选自聚合酶链式反应、LAMP法、链置换扩增、逆转录酶链置换扩增、逆转录酶聚合酶链式反应、逆转录LAMP法、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增和滚环扩增法的方法，扩增所述基因的步骤，和根据所述扩增的基因，判断所述基因的基因型的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，所述乙醇敏感度相关基因是乙醇脱氢酶ADHlB基因、乙醛脱氢酶ALDH2基因和细胞色素CYP2E1基因中的至少一个基因。
3.根据权利要求1所述的方法，所述固体待测样品是血液的干燥物。
4.根据权利要求1所述的方法，所述固体待测样品是毛根。
5.根据权利要求1所述的方法，所述固体待测样品是唾液的干燥物。
6.根据权利要求2所述的方法，其同时扩增选自乙醇脱氢酶ADHlB基因、乙醛脱氢酶 ALDH2基因和细胞色素CYP2E1基因中的至少2个，同时判断基因型。
全文摘要
本发明是判断乙醇敏感度相关基因的基因型的方法，其包括使含有上述基因的固体待测样品与含有缓冲液和DNA聚合酶的溶液，以及用于扩增上述基因的引物DNA直接接触，实施选自聚合酶链式反应、LAMP法、链置换扩增、逆转录酶链置换扩增、逆转录酶聚合酶链式反应、逆转录LAMP法、基于核酸序列的扩增、转录介导的扩增和滚环扩增法的方法，扩增上述基因的步骤，和根据上述扩增的基因，判断所述基因的基因型的步骤；通过判断基因型的方法，提供了安全、快速且廉价的判断与乙醇敏感度相关的基因的基因型的方法。
文档编号C12Q1/68GK102549171SQ20108004536
公开日2012年7月4日 申请日期2010年10月6日 优先权日2009年10月7日
发明者木下健司 申请人:学校法人武库川学院, 株式会社大赛璐