识别基因型的方法

专利名称：识别基因型的方法
技术领域：
本发明涉及一种基因多态性或体细胞突变等基因型的识别方法以及该方法中所用的试剂盒，更详细而言，涉及一种改善以利用了链置换反应的竞争性杂交来识别核酸碱基序列微小差异的方法的识别精度的方法，以及该方法中所用的试剂盒。本申请是基于2009年3月31日在日本提出的“特愿2009-084967号”要求优先权，并在此将其内容援引到本申请中。
背景技术：
通过人类基因组的解读、尤其是通过制作SNP (Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性)图谱的国际人类基因组单体型图计划，有关人类基因组的信息日趋增加。并且，在全世界范围内已经大规模开展以实现下述“对应于个人遗传信息的医疗”(量身定制式医疗)作为目标的研究通过发现所获得的基因组信息与个人体质之间的关联，掌握基因水平上的个人体质差别，可对应于个人特性进行疾病诊断、治疗、预防或施药。这里的基因差别，意指每个人的基因组碱基序列上的差别，其主要差别是单核苷酸的差别(SNP(单核苷酸多态性))。另外，最近，已了解短碱基序列的重复次数(拷贝数)的差别(拷贝数变异(Copy Number Variation,CNV))也广泛存在于全基因组中，并指出了该 CNV的差别与疾病之间的关联性。在此，为了掌握个人在基因水平上的差别，有必要调查每个人的基因型。例如，已知在某SNP中，其基因型为AA、AG、GG三种。A表示腺嘌呤、G表示鸟嘌呤碱基，该SNP是基因组位置有腺嘌呤时和鸟嘌呤时的一个例子。因此，为识别该SNP的基因型的检查，就是要确定是该三种基因型中的哪一种。即，只要发现A是0和100中的哪一个、G是0和100中的哪一个或者A和G是否为50和50即可。如此，SNP等生殖细胞突变的检测，基本可以说是定性的检测，该方法中较容易的、简便的各种方法得到实用化。另一方面，在癌细胞中，在体细胞水平上发生突变并且该突变成为癌的诱因而与异常增殖有关。因此，在某特定种类的癌细胞中，有时会出现特定基因的突变，可以将该突变作为指标进行癌细胞的检测。但是，癌细胞富有多样性，根据一种突变来确定癌细胞则未必容易。另外，在最近的药物疗法中，开发了以生物体内特定的分子(蛋白质等)作为目标的药剂，且发现了副作用少、效果高的药剂。它们被称作分子靶向药物，主要在癌治疗领域中得到积极的开发。最近，明确了在这些分子靶向药物中，当作为靶标的分子的信号传递的下游蛋白质中发生突变时，则该药剂的效果得不到发挥等。此时，通过调查对发生有突变的蛋白质进行编码的基因的突变，可以预测该药剂的效果，不断开拓与SNP检测不同的新型 “量身定制式医疗”的领域。在此所述的癌细胞中的特征性突变或者对分子靶向药物显示抵抗性的突变，几乎都是体细胞突变。在前述的生殖细胞突变时在所有细胞中均发现相同的突变，与此相对，在体细胞突变中只在引起突变的细胞中发现突变，在未引起突变的细胞(通常为正常细胞)中未发现突变。因此，通常在标本(作为检查对象的试样)中处于突变细胞和正常细胞相混合的状态，对应于这些细胞的丰度比(abundance ratio)，存在有突变基因和正常基因。即， 若试样的大部分是正常细胞而含有部分突变细胞，则不得不从大量正常基因中检测出所存在的少许突变基因，而这就是与生殖细胞中的突变检测的不同点，使体细胞的基因变异检测变得更加困难。在体细胞的基因变异检测法中，大致分为两种方法。其中，一种是在基因扩增阶段区别正常基因和突变基因的方法，具体而言，只对突变基因进行特异性扩增的方法。例如，作为灵敏度最好的方法，是用限制酶只对正常基因进行切割并只对未切割的突变基因进行扩增的、被称作“mutant-enriched PCR(突变体富集PCR) ”的方法(例如， 参照非专利文献1)。在该方法中，通过反复进行扩增突变基因的反应，可以从正常基因IO6 分子中检测出1分子的突变基因(例如，参照非专利文献幻。该方法在这种所谓高灵敏度的方面优良，但操作非常繁杂，并不是可以适用于通常的诊断中的方法。另外，开发了一种在PCR等的引物的延伸反应中通过区分单核苷酸的差别进行扩 ±曾的方法。该方法是被称作 “ARMS (amplification refractory mutation system,扩增抑制突变系统)”(例如，参照非专利文献3)、“ASPCR(allele specific PCR，等位基因特性 PCR) ”(例如，参照非专利文献4)等的方法。该方法是一种具有以下所述优点的方法灵敏度较高，不需要再进行除通常PCR扩增反应以外的操作，可以在封闭系统中进行全部反应且非常简便，不存在PCR残留污染(交叉污染)。但是，但凡有一次错误识别单核苷酸而进行了正常基因的扩增时，则在此后的扩增反应中，也会与扩增突变基因同样地扩增正常基因， 因此，也被称作一种假阳性危险高的方法。当采用该方法时，需要严格控制反应条件(即， 反应温度、盐浓度等)，并且模板量也需要严格相同(例如，参照非专利文献5)，因此对检查非特定多数的标本的临床检查或者要求有高精度的基础上还要求简便性的诊断方法中并不适合采用。另一种检验体细胞的基因变异的方法，是在同时扩增突变基因和正常基因后通过区别突变基因和正常基因来进行检测的方法。作为通过区别所扩增的突变基因和正常基因进行检测的方法，有利用电泳的方法、利用杂交的各种方法等(例如，参照非专利文献 5)。但是，在大部分方法中，很难以良好的精度检测出包含在大量正常基因中的少量突变基因。例如，作为被称作突变基因检测的金标准(gold standard)的方法，有双脱氧测序法 (dideoxy sequencing) 0尽管双脱氧测序法能够以较高灵敏度检测突变基因，但当突变基因和正常基因混在时，突变基因的检测灵敏度为10%左右，无法达到高灵敏度的检测。除此之外，已有报道，在焦磷酸测序法中，可以提高检测灵敏度至5%左右，优于双脱氧测序法 (例如，参照非专利文献6)。另外，正在开发下述方法将含有突变的序列通过PCR进行扩增，求出其生成物的双链DNA的解链曲线，根据突变基因和正常基因的解链曲线的差别求出突变基因的比例。 在该方法中，可检测正常基因中所含的突变基因达到5%左右(例如，参照非专利文献7)。除此之外，还开发了利用具有相同碱基序列的双链之间链的重组反应(链置换反应)的PCR-PHFA法。PCR-PHFA法是若作为基因型的识别对象的试样(双链核酸)和已知序列的标准双链核酸之间的碱基序列完全相同，则不能对各链进行区别，并且发生链的重组(链置换(strand displacement))，但只要一个碱基有差别，则会在具有完全互补的碱基序列的链相互之间优先形成双链，因此，在试样与标准双链核酸之间不发生重组，而 PCR-PHFA法是利用该现象的突变检测法。已有报道通过使用该PCR-PHFA法，能够以左右的高灵敏度从实际标本中检测出突变基因(例如，参照非专利文献8)。如上所述，虽然 PCR-PHFA法是检测灵敏度高、再现性优良的方法，但在操作上稍有繁杂(例如，参照专利文献1)并且还有残留污染等问题。为了解决这些问题，提出了几种改良方法。例如，在专利文献2中，作为PCR-PHFA法的改良方法公开了利用荧光共振能量转移的方法。在以高灵敏度准确测定微量的突变基因的PCR-PHFA法中，有必要检测出具有相同序列的两个双链核酸之间的链的重组，但多数情况下不标记试样的双链核酸而标记用于使链发生重组的已知序列的标准核酸。在专利文献2记载的方法中，通过在标准核酸的一条链的5'末端附近结合荧光物质来进行标记，采用其它荧光物质对另一条链的3'末端附近进行标记。当未发生链置换反应而标准核酸有原来的双链时，能够观察到两种不同荧光物质之间的荧光共振能量转移。与此相比，若试样的双链核酸之间发生链置换反应，则观察不到荧光共振能量转移。因此，通过测定该荧光共振能量转移的程度，可以测定链的重组程度。另一方面，近年来基因检测技术的进展显著，已经开发出整合微细加工技术和荧光检测法的、同时检测多个基因表达或突变的方法，并希望开发出可与这些技术整合的突变基因的高灵敏度检测。并且，通过在封闭系统的反应容器中进行PCR-PHFA，与在试管内进行相比明显降低了污染的危险性，可应用于简便且快速的核酸检查。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特许第四82304号公报专利文献2 日本特开2003-174882号公报非专利文献非专利文献1 =Chen等(另外1人)，((Analytical Biochemistry (分析生物化学)》，1991年，第195卷，第51 56页。非专利文献2 Jacobson等(另外1人)，((Oncogene (致癌基因)》，1994年，第九卷，第553 563页。非专利文献3 =Newton 等(另外 7 人)，((Nucleic Acids Research (核酸研究)》， 1989年，第17卷，第2503 2516页。非专利文献 4 :Wu 等(另夕卜 3 人)，《Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (美国国家科学院学报)》，1989 年，第 86 卷， 第2757 2760页。非专利文献5 =Nollau 等(另外 1 人)，((Clincal Chemistry (临床化学)》，1997 年，第43卷，第1114 11 页。非专利文献6 =Ogino 等(另外 9 人)，《The Journal of molecular diagnostics (分子诊断学杂志)》，2005年，第七卷，第413 421页。非专利文献7:Krypuy等(另外4人)，《BMC Cancer (BMC癌症)》，2006年，第六卷，第四5页。非专利文献8 Jada等(另外7人)，《Clinica Chimica Acta (临床化学学报)》，2002年，第3 卷，第105页。

发明内容
发明要解决的课题在以往的PCR-PHFA法中，链置换反应中的碱基序列的识别灵敏度不充分，很难以良好的精度检测、识别基因突变、尤其是体细胞突变。例如，专利文献2中所记载的利用了荧光共振能量转移的PCR-PHFA法，由于不需要繁杂的固液分离操作，所以很简便，并且由于在封闭系统的反应容器中进行PCR-PHFA，所以也可以明显降低污染的危险，可称为良好的方法，但识别灵敏度仍然不充分。本发明是鉴于这种状况而完成的，其目的在于，提供在利用了 PCR-PHFA法的识别基因型的方法中，可以改善识别碱基序列差别的精度的方法以及在前述方法中适用的试剂
品.ο解决课题的方法在PCR-PHFA法中，通常，试样的双链核酸多数情况下是使用通过聚合酶链反应 (PCR)制备的产物，但以往为了使操作简便，将PCR的反应液在未纯化的状态下，与用于使链发生重组的、已知序列的标准核酸混合，进行竞争性链置换反应。本发明人等，为了解决上述课题进行了精心研究，结果发现，在通过PCR-PHFA法来进行基因型的识别时，当将核酸扩增反应液在未纯化的状态下添加于竞争性链置换反应的反应液的情况下，通过抑制竞争性链置换反应中基于聚合酶进行的延伸反应，可以改善基因型的识别灵敏度，从而完成了本发明。即，本发明包括下述技术方案(1) (10)。(1) 一种识别基因型的方法，是识别基因突变中的基因型的方法，其特征在于，包括核酸扩增工序，通过核酸扩增反应对具有试样中所含基因中的突变位点的区域进行扩增，获得含有试样双链核酸的扩增反应液；以及识别工序，通过将上述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液与上述突变位点为特定基因型并且由标记物质所标记的标准双链核酸进行混合而进行竞争性链置换反应，并测定标准双链核酸与试样双链核酸之间产生链置换的程度，由此识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性；并且，上述竞争性链置换反应是在抑制由聚合酶引起的延伸反应的条件下进行。(2)如前述(1)所述的识别基因型的方法，其特征在于，前述竞争性链置换反应是在延伸反应抑制剂的存在下进行。(3)如前述(2)所述的识别基因型的方法，其特征在于，前述延伸反应抑制剂是螯合剂。(4)如前述(3)所述的识别基因型的方法，其特征在于，前述延伸反应抑制剂是 EDTA，前述竞争性链置换反应的反应液中的EDTA浓度为15mM以上。(5)如前述(2)所述的识别基因型的方法，其特征在于，前述延伸反应抑制剂是 DNA合成抑制剂。(6)如前述(1)所述的识别基因型的方法，其特征在于，在竞争性链置换反应之前，对前述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液进行热处理。(7)如前述(1)所述的识别基因型的方法，其特征在于，在竞争性链置换反应之前，对前述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液，进行单链核酸分解处理或者核苷三磷酸分解处理。(8)如前述(1) (7)中任一项所述的识别基因型的方法，其特征在于，在构成前述标准双链核酸的两条核酸链中，分别地，通过第一标记物质标记一条链的3'端部，通过第二标记物质标记另一条链的5'端部，前述第一标记物质和前述第二标记物质是可以互相进行能量转移的物质，通过测定由前述第一标记物质和前述第二标记物质之间的能量转移引起的能量变化的程度，测定前述识别工序中的标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度。(9)如前述(8)所述的识别基因型的方法，其特征在于，前述第一标记物质与前述第二标记物质中的至少一者是荧光物质，前述识别工序中的竞争性链置换反应是通过将含有前述标准双链核酸和前述试样双链核酸的反应液的温度从高温慢慢降低来进行，并且， 基于由前述反应液的温度降低引起的荧光强度的变化量与由不含前述试样双链核酸而含前述标准双链核酸的对照反应液的温度降低引起的荧光强度的变化量的比值，来测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度。(10) 一种基因型识别用试剂盒，其为通过前述(1)所述的识别基因型的方法识别基因型所用的试剂盒，其特征在于，包含选自于由延伸反应抑制剂、单链核酸分解酶和核苷三磷酸分解酶所组成的组中的一种以上；用于制备试样双链核酸的核酸扩增试剂；以及在标准核酸的一条链的5'端部导入了一种标记物质而在标准核酸的另一条链的3'端部导入了另一种标记物质的标准双链核酸。发明的效果本发明的识别基因型的方法，大幅改善了基因型的识别精度和灵敏度，不仅可以高精度地识别SNP等的生殖细胞突变，而且还可以高精度地识别以往通过SNP检查法难以识别的体细胞突变。另外，通过使用本发明的基因型识别用试剂盒，可以更加简便地进行本发明的识别基因型的方法。


图1是表示在竞争性链置换反应中发生聚合酶延伸反应时对识别灵敏度的影响的示意图。图2A是表示将由供体标记物质和受体标记物质进行标记的标准双链核酸与非标记的试样双链核酸加以混合、变性后慢慢降低温度时的各标记物质的荧光强度的行迹变动的示意图。图2B是表示将由供体标记物质和受体标记物质进行标记的标准双链核酸与非标记的试样双链核酸加以混合、变性后慢慢降低温度时的各标记物质的荧光强度的行迹变动的示意图。图3是通过使用供体标记物质的荧光强度的行迹变动求出AF的方法的说明图。图4是表示实施例1中伴随着温度变化的FAM的荧光变化图。图5是表示实施例2中伴随着温度变化的FAM的荧光变化图。图6是表示实施例3中伴随着温度变化的FAM的荧光变化图。
图7是表示实施例3的各反应中由温度降低引起的荧光强度的变化量AF的图。图8是表示实施例4的各反应中由温度降低引起的荧光强度的变化量AF的图。图9是表示将实施例5的各反应中所获得的AF相对于EDTA浓度标出的图。图IOA是表示将实施例6中所获得的指数值(Index值)按每个标记标准DNA的基因型表示的图，其中指数值是基于35°C中的受体标记物质的荧光值和供体标记物质的荧光值的比值而求出。图IOB是表示将实施例6中所获得的指数值按每个标记标准DNA的基因型表示的图，其中指数值是基于后述的式(4)求出。
具体实施例方式在本发明中，所谓基因突变是指同一生物种的个体之间存在的基因碱基序列的差异，所谓突变位点是指碱基序列中的差异位点。具体而言，是碱基序列中的一个或多个碱基通过置换、缺失、插入而产生碱基序列的差异。即，本发明中的基因突变，除了诸如体细胞突变等后天性突变以外，还包括诸如SNP或微卫星多态性等基因多态性之类的先天性突变。在本发明的识别基因型的方法中，所谓标准双链核酸，是指与来自作为识别对象的试样的双链核酸进行竞争性置换链的、碱基序列已知的双链核酸。具体而言，标准双链核酸，是指含有对象基因突变位点的部分区域、并且含有与突变位点为特定基因型的序列相同的碱基序列的双链核酸。若该标准双链核酸与来自试样的双链核酸之间发生链置换反应，则可识别为该试样中所含的基因是与标准双链核酸相同的基因型；若不发生链置换反应，则可识别为与标准双链核酸不同的基因型。本发明的识别基因型的方法，是在使用PCR-PHFA法识别基因突变中的基因型时， 通过抑制竞争性链置换反应中发生的聚合酶延伸反应，改善竞争性链置换反应中的碱基序列的识别灵敏度和精度的方法。尚不明确通过抑制延伸反应可改善碱基序列的识别灵敏度的原因，但推测如下。在以往的PCR-PHFA法中，以试样中的核酸作为模板、通过使用非标记的引物进行核酸扩增反应，将所获得的扩增产物不进行纯化，而与用于使链发生重组的已知序列的被标记标准双链核酸加以混合，进行竞争性链置换反应，通过测定来自试样的非标记核酸与被标记的标准双链核酸之间发生的链置换反应的程度，由此识别试样中的基因的基因型是否与标准双链核酸相同。在此，在核酸扩增反应的反应液中，含有DNA聚合酶或引物等用于进行核酸延伸反应的试剂，这些试剂也在保持其活性的状态下和核酸扩增产物同时与标准双链核酸混合。在核酸扩增反应中所用的引物，可与标准双链核酸进行杂交，因此，例如将未纯化的核酸扩增产物和标准双链核酸来加以混合而进行热变性，并通过慢慢降低温度来进行竞争性链置换反应的情况下，当温度条件成为适合聚合酶延伸反应的温度时，会造成引物与标准双链核酸杂交而产生新的延伸生成物。当试样中所含基因的基因型与标准双链核酸的基因型相同时，该延伸生成物成为与来自试样的非标记核酸相同的基因型。即，即使在竞争性链置换反应中发生聚合酶延伸反应，那也只不过是合成了具有与来自试样的非标记核酸相同基因型的非标记核酸，基本不对结果造成影响。与此相比，当试样中所含基因的基因型与标准双链核酸的基因型不同时，通过竞争性链置换反应中发生延伸反应，可合成新的具有在试样中未含的基因型的非标记核酸，并存在于反应液中。由于该非标记的核酸以标准双链核酸作为模板，从而具有与标准双链核酸完全相同的碱基序列，与来自标准双链核酸的通过变性成为单链的核酸链相互恢复原双链的情况进行竞争。图1是表示在竞争性链置换反应中发生聚合酶延伸反应时对识别灵敏度的影响的示意图。此外，图中“〇”表示荧光标记，“ ”表示对通过能量转移由该荧光标记发出的荧光进行猝灭的猝灭剂标记。在图1所示的反应体系中，通过检测由荧光标记所射出的荧光，识别来自试样的双链核酸(试样)的基因型是否与已标记的标准双链核酸(标记标准DNA)的基因型相同。 当从竞争性链置换反应后的反应液中没有检测到来自荧光标记射出的荧光时，识别为没有发生链置换并且标记标准DNA恢复(双链恢复)，即识别试样为不同于标记标准DNA的基因型。另一方面，当检测到荧光时，则识别为链置换发生并且标记标准DNA没有恢复，即识别试样为相同于标记标准DNA的基因型。在图1中，上半部分(A)说明了试样中所含基因的基因型与已标记的标准双链核酸(标记标准DNA)的基因型相同时的情况。通过核酸扩增反应所获得的来自试样的双链核酸(试样)有20个，在其中混合一个标记标准DNA进行竞争性链置换反应时，若在竞争性链置换反应中没有发生延伸反应，则在竞争性链置换反应后标记标准DNA恢复的概率为 1/21。另一方面，若竞争性链置换反应中发生延伸反应、并产生具有与一个标记标准DNA 相同碱基序列的非标记的双链核酸，则竞争性链置换反应后标记标准DNA恢复的概率为 1/22。如此，通过发生延伸反应，标记标准DNA恢复的概率降低，但对基因型的识别灵敏度影响不大。在图1中，下半部分(B)说明了试样中所含基因的基因型与已标记的标准双链核酸(标记标准DNA)的基因型不同时的情况。图中，“ ”表示标记标准DNA中的突变位点 (与试样不同的碱基)。与上半部分(A)同样地，当在20个试样中混合一个标记标准DNA来进行竞争性链置换反应时，若竞争性链置换反应中没有发生延伸反应，则标记标准DNA不与试样杂交，因此，竞争性链置换反应后标记标准DNA的恢复概率为1。另一方面，若竞争性链置换反应中发生延伸反应、并产生具有与一个标记标准DNA相同碱基序列的非标记的双链核酸，则该新产生的延伸产物与标记标准DNA进行竞争性杂交，因此，竞争性链置换反应后标记标准DNA的恢复概率显著降低为1/2。其结果是，竞争性链置换反应之前(变性后) 的单链状态的荧光值与竞争性链置换反应后的双链状态的荧光值之间的变化量减小，并关系到灵敏度的降低。另外，在PCR-PHFA法中，其根本原理是利用标记的标准双链核酸与非标记的试样来源的双链核酸之间的链置换，从精度的角度出发，不希望在反应中生成没有来自试样的非标记的核酸。例如，如图1的下半部分(B)所示，若新产生的延伸产物和标记标准DNA之间发生链置换，则从竞争性链置换反应后的反应液中检测出荧光，会导致错误识别试样为相同于标记标准DNA的基因型。即，通过在竞争性链置换反应中发生延伸反应，也降低了基因型的识别精度。在竞争性链置换反应中，基于核酸扩增反应的反应液所夹带的聚合酶发生延伸反应，其结果，降低核酸碱基序列的识别精度和灵敏度，这是首次由本发明人等探索到的见解。本发明基于该见解，通过抑制基于竞争性链置换反应中由聚合酶引起的延伸反应。从而改善识别精度和灵敏度。本发明的识别基因型的方法，具体而言，具有核酸扩增工序，通过核酸扩增反应对具有试样中所含基因中的突变位点的区域进行扩增，获得含有试样双链核酸的扩增反应液；以及识别工序，通过将由标记物质所标记的标准双链核酸与前述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液进行混合，在聚合酶延伸反应得到抑制的条件下进行竞争性链置换反应， 通过测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换发生的程度，来识别前述标准双链核酸与前述试样双链核酸的同一性。作为用于本发明的识别方法的试样，例如，可以举出细菌、病毒等的病原体，从人等生物体分离的血液、唾液、组织病变等，或粪尿等排泄物。并且，在出生前进行诊断时， 也可以将在羊水中存在的胎儿细胞、或者试管内的分裂卵细胞的一部分作为被检测体。另外，这些试样可以使用直接或根据需要通过离心分离操作等作为沉淀进行浓缩后，例如预先通过酶处理、热处理、表面活性剂处理、超声波处理或它们的组合等施以细胞破坏处理的产物。此时，上述细胞的破坏处理，是为了使作为目标的组织来源的核酸表露化而进行。此外，细胞破坏处理的具体方法，可以依照《PCR PROTOCOLS (PCR实验指南)))Academic Press Inc.(学术出版社)(PCR PROTOCOLS Academic Press Inc.，pl4、p352 (1990))等文献所记载的公知的方法来进行。另外，优选试样中的核酸总量为5 50ng左右，但在5ng以下也可以充分扩增。在本发明的识别方法中，作为识别对象的突变位点，可以举出癌关联基因、与遗传病相关的基因、病毒基因、细菌基因和被称为疾病的危险因素的显示多态性的基因等中存在的突变位点。作为癌关联基因，例如，可以举出K-ras基因、N-ras基因、p53基因、BRCAl 基因、BRCA2基因或者APC基因等。作为与遗传病相关的基因，可以举出已报告有与各种先天性代谢异常症等有关的基因等。作为病毒基因、细菌基因，例如，可以举出C型肝炎病毒、 B型肝炎病毒等的基因。作为显示多态性的基因，例如，可以举出如HLA (Human Leukocyte Antigen)或与血型相关的基因等与疾病等的原因没有必然的直接关系的、根据个体不同而具有不同碱基序列的基因，或者影响到高血压、糖尿病等发病的基因等。这些基因，其中大部分存在于宿主的染色体上，但也有由线粒体基因编码的情况。本发明中，首先，作为核酸扩增工序，通过核酸扩增反应对具有试样中所含基因中的突变位点的区域进行扩增，制备试样双链核酸。作为核酸扩增反应，只要是可将含有突变位点的区域扩增为双链核酸的反应即可，并没有特别限定，可以适当使用选自PCR 法、LCR(Ligase Chain Reaction)法、3SR(Self-sustained Sequence Replication)法、 SDA (Strand Displacement Amplification)法等中的公知的核酸扩增反应(Manak (纳克) 著，《DNA Probes (DNA探针技术)》第二版第255 291页，Stockton Press (斯托克顿出版社)(1993))。本发明中，特别优选PCR法。例如，以夹住包括突变位点的要扩增区域的方式来设计引物，通过反复进行使用聚合酶的引物的延伸反应，可以制备试样双链核酸。该延伸反应所用的dNTP、聚合酶等试剂，可从进行核酸扩增时所惯用的试剂中适当地选择而使用。例如，作为聚合酶，可以使用大肠杆菌DNA聚合酶I、大肠杆菌DNA聚合酶I的克列诺片段(Klenow fragment)、T4DNA聚合酶等任意DNA聚合酶，但特别优选使用I1aq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Vent DNA聚合酶等耐热DNA聚合酶。基于此无需在每次循环中添加新的酶，可自动地进行反复循环。进而，可以将退火温度设定为50 60°C，因此可以提高通过引物识别靶标碱基序列的特异性，可快速且特异性地进行基因扩增反应(详细内容参照日本特开平1-314965号公报、日本特开平1-252300号公报)。另外，关于进行该延伸反应时的反应条件等的具体方法，可以依据 《实验医学》第八卷第九期(羊土社(Yodosha Co.，Ltd·)，(1990)), ((PCR Technology (PCR 技术)》(Stockton press (斯托克顿出版社))(1989)等的文献所记载的公知方法来进行。对试样双链核酸而言，只要是对基因中含有突变位点的区域进行扩增，以在基因型与标准双链核酸相同时会与标准双链核酸发生链置换反应的双链核酸即可，其两末端可以不必与标准双链核酸的两末端相等。例如，也可以是试样双链核酸与标准双链核酸的链长差别为两末端分别在10碱基以内的程度。本发明中，可以进一步提高突变位点仅为一个碱基时的识别精度，因此，优选试样双链核酸为通过对含有突变位点的基因的区域中与标准双链核酸完全相同的区域进行核酸扩增所获得的双链核酸。接着，作为识别工序，将标准双链核酸与前述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液进行混合，在基于聚合酶进行的延伸反应得到抑制的条件下，进行竞争性链置换反应，并通过测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度来识别标准双链核酸与试样双链核酸之间的同一性。作为防止延伸反应的第一方法，是在竞争性链置换反应的反应液中添加延伸反应抑制剂的方法。通过在竞争性链置换反应的反应液中添加延伸反应抑制剂，不需要其它特别操作就可以抑制竞争性链置换反应中的延伸反应。在此，所谓延伸反应抑制剂，只要是不直接分解延伸反应中必需的聚合酶、核苷三磷酸或引物而具有抑制延伸反应的作用的化合物即可，并没有特别限定，可根据核酸扩增反应中所用的聚合酶的种类等，使用适当选自具有延伸反应抑制作用的公知化合物。作为上述延伸反应抑制剂，例如，可以举出螯合剂、DNA 合成抑制剂等。例如，PCR中所通用的聚合酶，其酶活性容易受到离子浓度、尤其是2价离子浓度的影响。例如，镁离子是DNA聚合酶发挥活性所必需的二价金属离子。因此，在竞争性链置换反应的反应液中，通过添加可抑制聚合酶活性的浓度的螯合剂，可以有效抑制延伸反应。 此外，虽然也有物理去除镁离子的方法，但操作繁杂。对螯合剂而言，只要简单地将其添加于竞争性链置换反应的反应液中即可，简便并且对以后的PCR-PHFA反应产生的影响也小。作为螯合剂有EDTA、⑶TA、DTPA等。对螯合剂的添加量而言，可以从螯合剂的种类、聚合酶的种类等角度考虑，通过实验来求得。例如，作为螯合剂使用EDTA时，优选以使竞争性链置换反应的反应液中的EDTA浓度成为15mM以上的方式来添加。优选EDTA浓度范围为15mM IOOmM,更优选范围为25mM 50mM。除此之外，在竞争性链置换反应的反应液中，通过添加酶的抑制物质也可抑制延伸反应。通常作为抑制DNA聚合酶活性的物质有DNA合成抑制剂。DNA合成抑制剂可大致分为两种通过与DNA聚合酶结合来抑制其活性的抑制剂；以及通过与DNA结合来抑制合成的抑制剂。本发明中，当使用与DNA结合的抑制剂时，有可能也抑制了 PCR-PHFA反应本身。因此，优选使用与DNA聚合酶结合的DNA合成抑制剂。另外，通过添加与DNA聚合酶结合的负离子蛋白质，也可以抑制DNA聚合酶的活性。即，与聚合酶结合的负离子蛋白质也可以用作延伸反应抑制剂。作为防止延伸反应的第二方法，有对核酸扩增反应后的扩增反应液进行热处理的方法。通过对核酸扩增反应后的扩增反应进行液热处理，可以使扩增反应液所含的聚合酶失活。通常在PCR反应中使用耐热DNA聚合酶，但这些聚合酶多数情况下通过在95°C以上处理10分钟以上会失去活性。耐热性DNA聚合酶对热的稳定性根据酶的不同而不同，因此， 热处理的温度和时间，可以考虑核酸扩增反应中所用酶的种类来进行适当设定。例如，在耐热性DNA聚合酶中，惯用的Taq DNA聚合酶的耐热性比较低，当将采用这种酶进行PCR反应后的反应液作为试样时，可较容易地通过热处理来防止新的延伸反应。扩增反应液的热处理，可在竞争性链置换反应之前进行，也可以在与标准双链核酸混合前进行，还可以在混合后进行。当在混合后进行时，通过该热处理，可以使标准双链核酸和试样双链核酸两者均变性，因此，可以不另外进行变性操作。作为防止延伸反应的第三方法，有使扩增反应液中的延伸反应所必需的物质等发生分解或者失活(变性)的方法。具体而言，可以举出对扩增反应液进行单链核酸分解处理或者核苷三磷酸分解处理的方法。在扩增反应液中，残留有延伸反应所必需的引物，该引物通过与标准双链核酸进行杂交来引起延伸反应。因此，通过对扩增反应液进行单链核酸分解处理，分解该引物，可以抑制延伸反应。具体而言，单链核酸分解处理可以在扩增反应液中添加单链特异性核酸酶来进行酶反应。此外，在扩增反应液中也含有试样双链核酸，但因其是双链核酸，因此，通过单链特异性核酸酶，可以有选择性地只分解引物而使其失去作为引物的功能。单链核酸分解处理可在竞争性链置换反应之前进行，可以在与标准双链核酸混合之前进行，也可以在混合后进行。这是由于标准双链核酸在单链特异性核酸酶的作用下不发生分解。但是，在竞争性链置换反应的变性处理前，必须使竞争性链置换反应的反应液中的单链特异性核酸酶活性处于失活状态。这是为了防止通过变性处理成为单链的试样双链核酸和标准双链核酸发生分解。因此，优选在单链核酸分解处理中使用在双链核酸发生变性的高温下导致失活的单链特异性核酸酶。作为这种核酸酶，有外切核酸酶I、外切核酸酶 T、绿豆核酸酶等。另外，在扩增反应液中，残留有延伸反应所必需的作为底物的四种脱氧三磷酸。当它们分解为脱氧一磷酸时，会失去作为底物的活性。因此，通过对扩增反应液进行核苷三磷酸分解处理，使脱氧三磷酸分解为脱氧一磷酸，可以抑制延伸反应。作为将脱氧三磷酸转换为脱氧一磷酸的酶，有腺苷三磷酸双磷酸酶等。为了防止聚合酶延伸反应，认为只要对核酸扩增反应所生成的双链核酸纯化后进行PCR-PHFA反应即可。但是，纯化需要费工夫并且容易因扩增物飞散而造成污染，谈不上是诊断现场适用的方法。本发明中，如上述三个方法，能够以更加简单的操作来抑制新的延伸反应。竞争性链重组反应，是在具有相同碱基序列的双链核酸与单链核酸之间或者在具有相同碱基序列的双链核酸与双链核酸之间发生的竞争性核酸链的取代反应(竞争性杂交)，可以使标准双链核酸和试样双链核酸发生变性后，通过退火来进行。作为使标准双链核酸和试样双链核酸发生变性的方法，优选基于加热的方法或者基于碱的方法。本发明中，从简便的角度出发，优选采用基于加热的变性。具体而言，通过将双链核酸在90 100°C、优选在95 100°C下加热规定时间，可以发生变性。此外，标准双链核酸和试样双链核酸的混合时期，既可以是即将变性前也可以是变性后。
当对所变性的标准双链核酸和试样双链核酸进行退火时，优选以使反应液中的盐浓度成为最佳的方式进行制备。最佳盐浓度，通常取决于链长度。通常，在杂交时使用缓冲液SSC (20 X SSC 3M氯化钠，0. 3M柠檬酸钠)或SSPE (20 X SSPE 3. 6M氯化钠，0. 2M磷酸钠， 2mM EDTA)，在本发明的识别方法中，也可以稀释这些溶液至适当浓度后使用。并且，根据需要也可以添加二甲基亚砜(DMSO)、二甲基甲酰胺(DMF)等有机溶剂。当通过加热进行变性时，可通过将反应液温度从高温(通常是为变性温度，例如在90 100°C范围中的任一温度)慢慢降低来退火，并进行竞争性链重组反应。反应液的降温速度、反应结束时的反应液温度等条件，可以根据标准双链核酸和试样双链核酸的链长或碱基序列来进行适当设定。反应液的温度的降低速度越慢，则越可以降低具有非互补碱基序列的单链之间相互杂交的概率。例如，通过在98 50°C范围内以0. I0C /分钟 0. 3°C /分钟的速度、更优选在98 70°C的范围内以0. 1°C /分钟的速度来降低温度，能够以良好的精度进行竞争性链重组反应。在本发明中，用标记物质对标准双链核酸进行标记，并制备非标记的试样双链核酸。将该标记作为指标，可以测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度。例如，在构成标准双链核酸的两条核酸链中，用某种标记物质标记其中一条链，并用其它标记物质标记另一条链。此时，若未发生链置换反应，则可从完全相同的分子中检测有两种标记物质。另一方面，若发生链置换反应，则存在仅检测出两种标记物质中的任一种的分子。因此，通过检测反应液中双链核酸的各个分子是否被任一种标记物质标记，可以测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度。作为标记物质，可以使用非放射性、放射性物质中任一种类，但优选使用非放射性物质。对非放射性的标记物质而言，作为可直接标记的举出荧光物质[例如，荧光素衍生物(异硫氰酸荧光素等)，罗丹明及其衍生物(四甲基异硫氰酸罗丹明等)]，化学发光物质 (例如，吖啶等)等。另外，通过利用与标记物质特异性结合的物质，可以间接检测标记物质。作为这种标记物质，可以举出生物素、配体、特定的核酸或蛋白质半抗原等。并且，作为与标记物质进行特异性结合的物质，若是生物素则可利用与其进行特异性结合的亲和素 (avidin)或链霉亲和素，若是半抗原则可利用与其进行特异性结合的抗体，若是配体则可利用受体，若是特定的核酸或蛋白质，则可利用与其特异性结合的核酸、核酸结合蛋白质或与特定蛋白质有亲和性的蛋白质等。作为上述半抗原可使用具有2，4-二硝基苯基的化合物或地高辛(Digoxigenin)，并且生物素或荧光物质等也可以作为半抗原使用。这些标记物质，均能够以单独一种或者在必要时以多种组合的方式通过公知的方法(参照日本特开昭 59-93099号公报、日本特开昭59-148798号公报、日本特开昭59-204200号公报)导入。另外，当将在对标准双链核酸进行标记的两种标记物质中任一种标记物质作为可在固相载体上结合的物质时，通过进行惯用的固液分离操作，可以测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度。例如，用标记物质A标记标准双链核酸的一条链而用可在固相载体上结合的标记物质B标记另一条链，使链置换反应后的反应液接触可与标记物质B结合的固相载体。然后，测定在该固相载体上结合的双链核酸中的标记物质A。当发生链置换反应时，通过在该固相载体上结合的双链核酸中的标记物质A所标记的双链核酸的比例减少。特别是，在本发明中，优选通过使用可相互能量转移的两种标记物质(例如，通过激发而产生荧光的供体标记物质以及吸收上述荧光的受体标记物质)，以这些标记物质间的能量转移所产生的能量变化程度作为指标，测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度。本发明中的标记物质间的能量转移是指当产生能量的供体标记物质和吸收该供体标记物质所产生能量的受体标记物质中的至少两种标记物质在处于相互接近的状态时， 能量由供体标记物质向受体标记物质转移。例如，当两种标记物质为荧光物质时，受体标记物质吸收了通过激发供体标记物质所产生的荧光，并测定该受体标记物质发出的荧光。或者，可以测定由受体标记物质吸收通过激发供体标记物质所产生的荧光并由此引起的供体标记物质的猝灭(((PCR Methods and applications (PCR 方法与应用)》4，357-362 (1995)， ((Nature Biotechnology (自然生物技术)》16，49-53 (1998))。此外，即使供体标记物质的荧光波长和受体标记物质的吸收波长不重叠，有时也引起能量转移，本发明中也包括这种能量转移。具体而言，作为标准双链核酸，使用如下所述进行标记的双链核酸在构成标准双链核酸的两条核酸链中，由第一标记物质标记一条链的3'端部，由可与第一标记物质互相能量转移的第二标记物质来标记另一条链的5'端部。可以是第一标记物质和第二标记物质中的任一个为供体标记物质。该标准双链核酸处于第一标记物质和第二标记物质接近状态，所以发生能量转移。另一方面，若与试样双链核酸之间发生竞争性链置换反应，则在链发生置换的双链核酸中，第一标记物质和第二标记物质处于远离状态，因此不发生能量转移，反应液中产生能量转移的双链核酸的比例减少。因此，通过测定由第一标记物质或第二标记物质所发出的能量(当用荧光物质的情况下指荧光强度)，可测定通过能量转移所产生的能量变化的程度，并可测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度。与基因型不同的(突变部的碱基序列有差异)核酸链相互之间比较，基因型相同的(具有完全互补的碱基序列)核酸链相互之间更优先形成双链。因此，采用任意的检测器来测定随之在标记物质之间因能量转移所产生的能量变化程度(即，经过链置换反应所产生或消失的能量转移的变化程度)，由此可以检测出试样中所含的基因突变位点的基因型是否与标准双链核酸相同、或者可以检测出试样中所含的与标准双链核酸相同的基因型的比例。例如，在检测中利用荧光能量转移时，通过用荧光分光光度计、荧光读板机等测定特定波长的荧光光谱，可容易检测出有无包含与标准双链核酸相同的基因型的基因或其比例。图2A和图2B表示将由供体标记物质标记一条链的3'端部而由受体标记物质标记另一条链的5'端部的标准双链核酸与非标记试样双链核酸加以混合、变性后慢慢降低温度时的供体标记物质的荧光强度的行迹变动的示意图(图2A)和受体标记物质的荧光强度的行迹变动的示意图(图2B)。在图中，“匹配”是标准双链核酸和试样双链核酸的基因型相同时的行迹变动，“错配”是基因型相互不同时的行迹变动。如此，通过测定标记物质之间的能量转移引起的能量变化的程度，来测定标准双链核酸与试样双链核酸之间发生链重组的程度，由此，不需要进行固液分离操作等繁杂的操作，就可以快速且简便地识别标准双链核酸和试样双链核酸的同一性。而且，通过将两种标记物质导入相互近接的3'端部和5'端部，可以准确可靠地获知发生链置换的程度，因此，即使标准双链核酸或者试样双链核酸是长链的基因片断，也常常能够以良好的灵敏度来准确可靠地测定互补链的置换程度，可准确且稳定地识别基因型的同一性。尤其是，该方法是无需以往繁杂的固液分离操作的简易方法，因此也可实现自动化并可满足最前沿医疗现场的期望。作为第一标记物质或者第二标记物质可以使用的标记物质，只要在相互接近的状态下可进行能量转移即可，并没有特别限制，但其中优选为荧光物质、延迟荧光物质，根据不同情况还可以使用化学发光物质、生物发光物质等。作为这种标记物质的组合，可以举出荧光素及其衍生物(例如，异硫氰酸荧光素等)与罗丹明及其衍生物(例如，四甲基异硫氰酸罗丹明、四甲基罗丹明-5(6)-己酸等)的组合，荧光素与丹磺酰基(dabsyl)的组合等，可以从它们中选择任意组合(Nonisotopic DNA Probe Techniques (非同位素DNA探针技术)，Academic I^ress (美国学术出版社)(199 )。除此之外，还可以是在接近时发生热能量释放的组合的分子。作为这种标记物质的组合，可以举出选自于由Alexa Fluor(注册商标)488 (Invitrogen (英杰)公司制造)、ATT0 488 (ATTO-TEC GmbH 公司制造)、Alexa Fluor (注册商标)594 Gnvitrogen 公司制造)和 ROX (Carboxy-X-rhodamine (羧基-X-罗丹明))所组成的组中的一种与BHQ(注册商标、Black hole quencher)_1或者BHQ(注册商标)_2的组合等。作为标准双链核酸中导入第一标记物质或者第二标记物质的方法，可以采用通常在核酸中导入标记的方法。例如，可以举出将标记物质直接化学方法导入核酸的方法 (((Biotechniques (生物技术) 24,484-489 (1998))，通过DNA聚合酶反应或RNA聚合酶反应导入标记物质结合单核苷酸的方法(《Science (科学)》238，336-3341 (1987))，通过使用导入有标记物质的引物进行PCR反应而导入的方法(《PCR Methods and Applications (PCR 方法与应用)》2，34-40 (1992))等。在标准双链核酸中导入标记物质的位置，必须是通过链置换反应发生能量转移或消失的位置、即核酸链的3'端部和/或5'端部。具体而言，在本发明中，5'端部和3'端部是表示分别从核酸链的5'末端和3'末端出发的30个碱基以内的范围，双方标记物质越近就越容易发生能量转移，因此，优选从各末端出发为10个碱基以内，最优选为5'末端和3'末端。在此，若将标记物质大量导入与互补链杂交的碱基部分时，有可能无法检测一个碱基程度的置换，因此优选只在各核酸链的端部分导入。例如，通过在一条核酸链的5' 端部(3'端部)导入两种标记物质中的一种，而且在与其互补的另一条核酸链的3'端部 (5'端部)导入另一种标记物质，由此，在并不影响杂交反应的情况下，两核酸链通过链置换反应发生能量转移或者消失。具体而言，作为制备5'端部具有标记的核酸链的方法，可以举出下列方法将在5'端部导入了标记物质的寡核苷酸与任意核酸链通过连接酶(Iigase)来结合的方法 (《Nucleic Acids Research (核酸研究)》25，922-923 (1997))；或者，通过使用在5'端部导入了标记物质的引物进行PCR反应的方法(《PCR Methods and Applications (PCR方法与应用)》2，34-40 (1992))等。另一方面，作为制备3'端部具有标记的核酸链的方法，有下述方法将与上述在 5'端部导入标记物质时同样地在3'端部导入了标记物质的寡核苷酸与任意核酸链通过连接酶来结合的方法。此外，当核酸链不是DNA而是RNA或者DNA的3‘端部是RNA时，还可以通过使其末端的RNA的糖(核糖)部有选择性地开环，并利用所产生的醛基进行标记。
并且，也可以在末端脱氧核苷酸转移酶的作用下，将导入有标记物质的单核苷三磷酸导入核酸链的3'端部(〈〈Biotechniques (生物技术)》15,486-496(1993))。当标准双链核酸是100个碱基以下的较短的核酸链时，可以通过直接化学合成来制备标记核酸(《Nucleic Acids Research (核酸研究)》l6，2659I669 (I988)， ((Bioconjugate Chemistry (生物共轭化学)》3，85_87 (1992))。此外，标准双链核酸，可以通过将突变位点是所需基因型的碱基序列已知的核酸作为模板进行核酸扩增反应来制备。此时的核酸扩增反应，与制备试样双链核酸时同样，可从公知的核酸扩增反应中适当地选择而使用。在本发明中，特别优选PCR法。并且，将核酸扩增反应产物，嵌入选自质粒载体、噬菌体载体或者质粒与噬菌体的嵌合载体中的载体中，并通过导入大肠杆菌、枯草杆菌等细菌或酵母等可增殖的任意宿主中，由此可大量制备 (基因克隆)。另外，标准双链核酸，例如，可以通过公知的化学合成方法进行制备。作为化学合成法，可以举出三酯法、亚磷酸法等。例如，通过利用了液相法或者使用不溶性载体的固相合成法等的通常的自动合成仪(392型等，应用生物系统(Applied Biosystems)公司制造) 来大量制备单链DNA，然后通过进行退火来制备双链DNA。由标记物质间的能量转移产生的能量变化程度的测定，一般通过测定由标记物质发出的荧光来进行，但该荧光测定多数情况下使用可同时测定多个试样、而且可进行多种温度控制的所谓实时PCR装置等。但是，在这种装置中，每次检测的荧光测定精度未必高， 并且在多数情况下各个加样孔的偏差大。另外，所添加的标准双链核酸的添加量的偏差，也可成为对测定精度影响大的主要原因。因此，当进行定量测定时，优选对这些测定之间的偏差进行修正。在利用了荧光共振能量转移的检测法中，一般采用通过求出成为供体的荧光物质与成为受体的荧光物质的两者的荧光值的比来修正测定之间的偏差的方法。即，测定通过激发供体而产生的荧光和因来自供体的能量转移而被激发从而发光的受体的荧光，并求出其比值的方法。因此，本发明人等，在本发明的识别基因型的方法中，在测定由标记物质间的能量转移所产生的能量变化的程度时，通过求出在链重组反应后(终点)的供体标记物质的荧光值与受体标记物质的荧光值的比来探讨能否降低偏差，但如后述的实施例6所示，在该方法中无法进行充分的偏差修正。其原因在于，链重组反应后的供体标记物质的荧光值非常小，在这种状态下的荧光测定容易使偏差变得非常大，因而供体标记物质的荧光值与受体标记物质的荧光值的比值产生大的偏差。此外，供体标记物质的荧光值小的原因在于，在未发生链重组反应、变性后的标准双链核酸恢复为原来的双链核酸时，由于产生能量转移，所以供体标记物质的荧光几乎都将能量转移给受体标记物质，结果成为非常弱的发光。因此，本发明人等，通过进一步反复研究的结果，发现将反应液的温度降低所引起的荧光强度的变化量，即在存在试样双链核酸的反应液(试样反应液)中通过变性所引起的单链状态下的荧光强度与退火后的双链核酸状态下的荧光强度之间的变化量AF(荧光)，与不存在试样双链核酸的反应液(对照反应液)中的AF进行比较，由此可以良好地修正测定之间的偏差。AF既可以是供体标记物质的变化量，也可以是受体标记物质的变化量。具体而言，供体标记物质的Δ F可通过下式(1)来求出。同样，受体标记物质的Δ F可通过下式 (2)来求出。在下式(1)和(2)中，“F[start-p0int (起点)]”是指反应液的温度下降开始时的温度下的荧光强度，“Ftend-point (终点)]”是指反应液的温度下降结束时的温度下的荧光强度。(I)AF = F [start-point] -F [end-point](2) Δ F = F[end-point]—F[start-point]另外，不论是供体标记物质还是受体标记物质，均可以通过下式C3)求出AF。在下式(3)中，“F[maX(最高)]”是指从反应液的温度下降开始至结束为止的温度依赖性荧光行迹变动内的最高荧光强度；"F[min (最低)]，，是指在相同温度依赖性荧光行迹变动内的最低荧光强度。(3) Δ F = F [max] -F [min]图3是通过使用供体标记物质的荧光强度的行迹变动求出AF的方法的说明图。 在图中，“匹配”是在标准双链核酸与试样双链核酸的基因型相同时的行迹变动，“错配”是在基因型互相不同时的行迹变动，“标记标准DNA”是在不含试样双链核酸时(对照反应液) 的行迹变动。比较基于反应液温度降低的AF与基于对照反应液温度降低的AF，具体而言，可作为下式(4)所示的指数值(Index值)(％ )来求出。(4)指数值(％) = Δ F[反应液]/AF[对照反应液]X 100当链重组反应未发生、变性后的标准双链核酸恢复为原来的双链核酸时，链重组反应后的供体标记物质的荧光弱，并且单链状态下的受体标记物质的荧光也弱，但即使在这种状况下可知，竞争性链置换反应前的单链状态的供体标记物质的荧光值或者竞争性链置换反应后的双链状态的受体标记物质的荧光值的差的偏差，和采取供体标记物质的荧光值与受体标记物质的荧光值的比值的情形相比并不大，可知能够良好地修正测定之间的偏差。仅将标记后的双链核酸的荧光共振能量转移的程度，即将AF[对照反应液]为 100%，可以求出标准双链核酸与试样双链核酸的重组发生的程度。当混合标准双链核酸与试样双链核酸来进行链重组反应时，若指数值接近100 %，则显示链重组未发生，并被识别为试样双链核酸的基因型与标准双链核酸的不同。另一方面，当指数值接近0%时，则显示链重组发生并被识别为试样双链核酸的基因型与标准双链核酸的相同。进而，本发明人等还研究了关于竞争性链置换反应所需反应时间的缩短化。如前面所述，在PCR-PHFA法中，重要的是在高温下使试样双链核酸与标准双链核酸的混合物发生变性，且慢慢地降低温度(参照:0ka,T. ,((Nucleic Acids Research(核酸研究)》，1994， vol.22，pl541-lM7)。但是，希望在实际检查时快速检查，缩短反应时间则是重要课题。例如，在专利文献1中记载了在98°C 58°C的范围内、以3 10分钟1°C的速度降低温度的条件作为基准。此时，反应时间大约为120分钟至400分钟，需要非常长的时间。本发明人等认为，在PCR-PHFA法中链置换反应是在某一定温度以上时发生，并在该范围内慢慢地使温度变化是重要的。并且认为，当以供体标记物质和受体标记物质来对标准双链核酸进行标记时，通过测定使标准双链核酸发生变性并慢慢降低温度时的荧光强度变化，可以推断链置换反应发生的范围。通过在发生该链置换反应的温度范围中充分放慢反应液的降温速度，而在其它温度范围中加快降温速度，由此可不损害识别精度的情况下缩短反应时间。发生链置换反应的范围，是在荧光强度变化的拐点(荧光强度相对于温度的平均变化率为最大的温度)附近，并且该荧光强度变化的拐点，可以通过计算各个温度下的荧光强度变化来求出(dF/dT:F为荧光值，T为时间)。该拐点，一般相当于作为双链核酸的融解温度的基准使用的Tm。Tm值被认为根据双链核酸长度、碱基序列、溶液组成等的不同而不同。本发明中，可以求出所用标准双链核酸在竞争性链置换反应的反应液中的拐点，并以与其相对应的温度作为基准来设定温度变化范围。另外，对温度变化的速度而言，可以在能够充分识别基因型的范围内进行加快。由于基因型识别的难易取决于碱基序列，预测非常困难，所以必须以识别突变为目的而反复进行试验来加快。本发明的识别基因的方法中，基因型的识别精度非常优良，除了 SNP等的生殖细胞突变之外，还能够以充分的精度识别诸如在癌细胞等中所观察的体细胞突变。因此，在临床检查等方面也非常有用。本发明的基因型识别用试剂盒，是用于按照本发明的识别基因型的方法识别试样中所含基因变异的基因型或者检测含有特定基因型的比例所用的试剂盒，其特征在于，具有选自于由延伸反应抑制剂、单链核酸分解酶和核苷三磷酸分解所组成的组中的一种以上；以及用于制备试样双链核酸的核酸扩增试剂。并且，在试剂盒中，优选组合有可互相能量转移的两种标记物质、用于在核酸链的3'端部导入标记物质的试剂以及用于在核酸链的5'端部导入标记物质的试剂。除此之外，也可以组合试样预处理用的细胞破坏试剂或用于检测标记物质的标记的试剂等。如此，通过使本发明的识别基因型的方法所必需的试剂等进行试剂盒化，可以更简便且在短时间内识别基因型。实施例下面，通过描述实施例来具体说明本发明，但本发明并不局限于下述实施例。在实施例1 6中，将癌基因K-ras的密码子12或密码子13的基因突变作为识别对象的突变位点。并且，突变位点是各基因型的、已标记的标准双链核酸(下称“标记标准DNA”)，是按照通常的寡核苷酸化学合成法进行制备。各标记标准DNA，在其双链中的一条链的5'末端施以FAM标记(Glen Research公司制造)，在另外一条链的3‘末端施以 Alexa标记anvitrogen公司制造)。在表1中，按各基因型示出化学合成的DNA链的序列。 在表1中，密码子12、13用下划线示出，突变位点用小写字母示出。另外，分别地，“Wild”是指野生型，“G12S”是指密码子12的第一个由鸟嘌呤突变为腺嘌呤的基因型，“G12R”是指密码子12的第一个由鸟嘌呤突变为胞嘧啶的基因型，“G12C”是指密码子12的第一个由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶的基因型，“G12D”是指密码子12的第二个由鸟嘌呤突变为腺嘌呤的基因型，“G12A”是指密码子12的第二个由鸟嘌呤突变为胞嘧啶的基因型，“G12V”是指密码子 12的第二个由鸟嘌呤突变为胸腺嘧啶的基因型，“G13D”是指密码子13的第二个由鸟嘌呤突变为腺嘌呤的基因型。并且，基因型的后面记载有“-FAM”的是指5'末端施以FAM标记的DNA链，而记载有“-Ale”的是指3'末端施以Alexa标记的DNA链。右栏的数字表示在序列表中相对应的序列号。表权利要求
1.一种识别基因型的方法，是识别基因突变中的基因型的方法，其特征在于，包括核酸扩增工序，通过核酸扩增反应对具有试样中所含基因中的突变位点的区域进行扩增，获得含有试样双链核酸的扩增反应液；以及识别工序，通过将上述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液与上述突变位点为特定基因型并且由标记物质所标记的标准双链核酸加以混合而进行竞争性链置换反应，并测定标准双链核酸与试样双链核酸之间发生链置换的程度，由此识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性，并且，上述竞争性链置换反应是在抑制了由聚合酶引起的延伸反应的条件下进行。
2.如权利要求1所述的识别基因型的方法，其特征在于， 上述竞争性链置换反应是在延伸反应抑制剂的存在下进行。
3.如权利要求2所述的识别基因型的方法，其特征在于，上述延伸反应抑制剂是螯合剂。
4.如权利要求3所述的识别基因型的方法，其特征在于，上述延伸反应抑制剂是EDTA， 上述竞争性链置换反应的反应液中的EDTA浓度为15mM以上。
5.如权利要求2所述的识别基因型的方法，其特征在于，上述延伸反应抑制剂是DNA合成抑制剂。
6.如权利要求1所述的识别基因型的方法，其特征在于，在竞争性链置换反应之前，对上述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液进行热处理。
7.如权利要求1所述的识别基因型的方法，其特征在于，在竞争性链置换反应之前，对上述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液，进行单链核酸分解处理或者核苷三磷酸分解处理。
8.如权利要求1 7中任一项所述的识别基因型的方法，其特征在于，在构成上述标准双链核酸的两条核酸链中，分别地，通过第一标记物质标记一条链的 3'端部，通过第二标记物质标记另一条链的5'端部，上述第一标记物质和上述第二标记物质是能够互相进行能量转移的物质， 通过测定由上述第一标记物质和上述第二标记物质之间的能量转移引起的能量变化的程度，测定上述识别工序中的标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度。
9.如权利要求8所述的识别基因型的方法，其特征在于，上述第一标记物质和上述第二标记物质中的至少一者是荧光物质， 上述识别工序中的竞争性链置换反应是通过将含有上述标准双链核酸和上述试样双链核酸的反应液的温度从高温慢慢降低而进行，并且，基于由上述反应液的温度降低引起的荧光强度的变化量与由不含上述试样双链核酸而含上述标准双链核酸的对照反应液的温度降低引起的荧光强度的变化量的比值，测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度。
10.一种基因型识别用试剂盒，是通过权利要求1所述的识别基因型的方法识别基因型所用的试剂盒，其特征在于，具有选自于由延伸反应抑制剂、单链核酸分解酶和核苷三磷酸分解酶所组成的组中的一种以上；用于制备试样双链核酸的核酸扩增试剂；以及在标准核酸的一条链的5'端部导入了一种标记物质而在标准核酸的另一条链的3' 端部导入了另一种标记物质的标准双链核酸。
全文摘要
本发明涉及一种识别基因型的方法以及采用该方法来识别基因型所用的基因型识别用试剂盒，其中，所述识别基因型的方法中利用了PCR-PHFA法，并且包括下述核酸扩增工序和识别工序核酸扩增工序，通过核酸扩增反应对具有试样中所含基因中的突变位点的区域进行扩增，获得含有试样双链核酸的扩增反应液；识别工序，通过将上述核酸扩增工序中所获得的扩增反应液与上述突变位点为特定基因型并且由标记物质所标记的标准双链核酸进行混合而发生竞争性链置换反应，并通过测定标准双链核酸与试样双链核酸之间链置换的发生程度来识别上述标准双链核酸与上述试样双链核酸的同一性；并且，上述竞争性链置换反应是在抑制聚合酶延伸反应的条件下进行。
文档编号C12Q1/68GK102369297SQ20108001422
公开日2012年3月7日 申请日期2010年3月26日 优先权日2009年3月31日
发明者中山尚母, 北野史朗, 山根明男 申请人:凸版印刷株式会社