专利名称：具有免疫球蛋白结合能力的肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有免疫球蛋白结合能力的肽、以及与所述肽的融合蛋白、编码它们的核酸、制备方法、用于与免疫球蛋白结合的组合物以及手段。本发明还涉及由于Clq与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物等，该药物组合物包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或与所述肽的融合蛋白。
背景技术：
已知Clq是补体蛋白的一种，在补体活化途径中发挥作用。例如，经典途径的活化是通过Clq与免疫球蛋白分子的Fc部分结合而引起的。有报道称，Clq在血液中较多存在的类风湿性关节炎(RA)患者将来会出现关节破坏(非专利文献1)。可以认为这与上述的Clq的活化有关，人们希望开发Clq与免疫球蛋白分子结合的抑制剂。有报道称，Clq与免疫球蛋白分子的结合中，ClqB亚基(B链)的精氨酸残基可能参与(非专利文献幻。但是，该报告是通过计算机模拟来预测的，实际的免疫球蛋白结合部位尚未明确。所述结合部位的详细的氨基酸序列也并未了解。免疫球蛋白的纯化中使用ftOtein A或ftOtein G等的与免疫球蛋白特异性结合的蛋白质。但是，这些蛋白质与免疫球蛋白的结合力强，因此，一旦结合后若要分离，则必须是使用强酸性缓冲液等的严苛条件。因此，免疫球蛋白的立体结构容易破坏，无法纯化亲和性高的抗体。现有技术文献非专利文献非专利文献1 =Ochi T 等人.，Arthritis Rheum. 1988Jan ；31 (1) :37 43非专利文献2 =Gaboriaud C 等人·，J Biol Chem. 2003Nov 21 ；278 (47) :46974 82.Epub 2003S印
发明内容
发明所要解决的课题本发明的解决课题在于提供具有免疫球蛋白结合能力的肽以及与所述肽的融合蛋白、编码它们的核酸、含有所述核酸的载体等。还在于提供不破坏抗体的立体结构、与抗原的亲和性高的抗体也可纯化的新型抗体纯化方法、以及为此的组合物和手段。解决课题的手段本发明人等针对上述情况进行了深入的研究，结果，成功地鉴定了参与Clq与免疫球蛋白结合的氨基酸序列，完成了本发明。还令人惊讶地发现，所述氨基酸序列并不含有被报道参与了结合的精氨酸残基。并且，含有该氨基酸序列的肽比I^rotein A或ftOtein G 弱地与免疫球蛋白结合，因此消除了抗体立体结构的破坏或对纯化对象抗体的限制(无法纯化与抗原的亲和性高的抗体等)等的以往的抗体纯化时的问题，可以在温和的条件下进行抗体纯化。SP，本发明涉及以下内容(1)肽，该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽，选自(a)具有SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列的肽；(b)具有下述氨基酸序列的肽，其是在SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列中， 缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列；以及(c)具有下述氨基酸序列的肽，其是与SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列具有66. 7%以上同源性的氨基酸序列，其中，肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换。(2)⑴所述的肽，其中，肽中的半胱氨酸被丝氨酸置换。(3)⑵所述的肽，该肽具有SEQ ID NO 28 32的任意的氨基酸序列。(4)肽，该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽，选自(a)具有SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列的肽；(b)具有下述氨基酸序列的肽，其是在SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列中， 缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列；以及(c)具有下述氨基酸序列的肽，其是与SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列具有66. 7%以上同源性的氨基酸序列，其中，肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。(5) (4)所述的肽，其中，所有的氨基酸均可被对应的D-氨基酸置换。(6) (5)所述的肽，该肽具有dPro Gly dLeu dTyr dTyr dPhe所示的氨基酸序列。(7)肽，该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽，选自(a)具有SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列的肽；(b)具有下述氨基酸序列的肽，其是在SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列中， 缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列；以及(c)具有下述氨基酸序列的肽，其是与SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列具有66. 7%以上同源性的氨基酸序列，其中，肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换，且肽中的氨基酸可被对应的 D-氨基酸置换。(8) (7)所述的肽，其中，肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换，且所有的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。(9)核酸，该核酸是编码具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸，选自(a)编码(1)所述的肽的核酸；(b)具有SEQ ID NO 33 37的任意的核苷酸序列的核酸；(c)具有下述核苷酸序列的核酸，其是在SEQ ID NO 33 37的任意的核苷酸序列中，缺失、置换或附加1个或多个核苷酸得到的核苷酸序列；(d)可与上述(b)或(C)的核酸或其互补链在严谨的条件下杂交形成的核酸；(e)具有下述核苷酸序列的核酸，其是与SEQ ID NO 33 37的任意的核苷酸序列具有50%以上同源性的核苷酸序列。(10) (9)所述的核酸，该核酸具有SEQ ID NO 33 37的任意的核苷酸序列。
(11)载体，该载体含有(9)或(10)所述的核酸。(12)融合蛋白，其是⑴ (3)中任一项所述的肽附加于目标蛋白质的N末端和 /或C末端得到的融合蛋白。(13)融合蛋白，其是⑷ ⑶中任一项所述的肽附加于目标蛋白质的N末端和 /或C末端得到的融合蛋白。(14)核酸，该核酸编码(12)所述的融合蛋白。(15)载体，该载体含有(14)所述的核酸。(16)细胞，该细胞含有(9)或(10)所述的核酸或(14)所述的核酸、或者(11)或 (15)所述的载体。(17)具有免疫球蛋白结合能力的肽的制备方法，该方法包含以下步骤(a)使用(11)所述的载体来转化细胞；(b)培养该细胞以生产肽。(18)具有免疫球蛋白结合能力的肽，该肽可通过(17)所述的方法得到。(19)融合蛋白的制备方法，该融合蛋白是具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的，所述方法包含(a)使用(1 所述的载体来转化细胞；(b)培养该细胞以生产融合蛋白。(20) (19)所述的方法，该方法进一步包含由融合蛋白获取目标蛋白质的步骤。(21)融合蛋白，该融合蛋白可通过(19)或00)所述的方法得到。(22)用于使免疫球蛋白结合的组合物，该组合物包含(1) (8)中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白。(23) (22)所述的组合物，该组合物用于确定免疫球蛋白的存在或量、或者用于分离免疫球蛋白。(24)用于使免疫球蛋白结合的手段，该手段是将⑴ ⑶中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白固定。(25) (24)所述的手段，该手段用于确定免疫球蛋白的存在或量、或者用于分离免疫球蛋白。(26)使免疫球蛋白结合的方法，该方法包含(a)将⑴ ⑶中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白添加到试样中，(b)检测肽或融合蛋白与免疫球蛋白的结合体。(27)试剂盒，该试剂盒用于在06)所述的方法中使用，包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或含有所述肽的融合蛋白。(28)由Clq与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物，该药物组合物包含(1) (8)中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白。(29) (28)所述的药物组合物，其中，疾病是类风湿性关节炎。(30) (28)所述的药物组合物，其中，疾病是系统性红斑狼疮简写为SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病。(31)标记的(1) ⑶中任一项所述的肽、或者(12)或(13)所述的融合蛋白。
(32)试样中抗体的检测方法，其特征在于使(31)所述的标记肽或融合蛋白与试样中的抗体反应，接着检测与抗体结合的该肽或融合蛋白。发明效果本发明提供具有免疫球蛋白结合能力的肽以及与所述肽的融合蛋白、编码它们的核酸、制备方法、用于使免疫球蛋白结合的组合物和手段、以及由于Clq与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物等，该药物组合物包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或与所述肽的融合蛋白。
图1表示具有6个氨基酸的肽R1、具有9个氨基酸的肽R2、具有15个氨基酸的肽 R3 R6抑制Clq与免疫球蛋白的结合。图中、NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果，PC是将不含有肽的 DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结^ ο图2表示具有6个氨基酸的变异肽R7 R9、具有9个氨基酸的变异肽10、具有15 个氨基酸的变异肽Rll抑制Clq与免疫球蛋白的结合。图中，NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果，PC 是将不含有肽的DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果。图3表示变异肽R12 18抑制Clq与免疫球蛋白的结合。图中，NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果，PC是将不含有肽DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG) 的反应液所得的样品的结果。图4表示变异肽R19 22抑制Clq与免疫球蛋白的结合。图中，NC是将不含有肽的DMSO添加到不含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG)的反应液所得的样品的结果，PC是将不含有肽的DMSO添加到含有碱性磷酸酶(ALP)标记的人免疫球蛋白(IgG) 的反应液所得的样品的结果。图5表示通过腹腔内给予10mg/kg的肽R5 (1次/1天给予或2次/1天给予)，在诱发关节炎的小鼠中，关节炎得到抑制。作为对照，给出1次Λ天给予不含有肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果、以及1次Λ天给予0. lmg/kg甲氨蝶呤溶液的小鼠的结果。图6表示通过腹腔内给予10mg/kg的肽R1，在诱发关节炎的小鼠中，关节炎得到抑制。作为对照，给出同样地给予不含有肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果。图7表示通过腹腔内给予10mg/kg的肽R2，在诱发关节炎的小鼠中，关节炎得到抑制。作为对照，给出同样地给予不含有肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果。图8表示通过腹腔内给予10mg/kg的肽R5，在诱发关节炎的小鼠，关节炎得到抑制。作为对照，给出同样地给予不含有肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果。图9表示腹腔内给予10mg/kg的肽R2或R13、或者静脉内给予lmg/kg的Rl或 10mg/kg的R17的、诱发关节炎的小鼠中临床评分的变化。作为对照，给出同样地给予不含有肽的生理盐水的小鼠的结果。
图10表示腹腔内给予10mg/kg的肽R2或R13、或者静脉内给予lmg/kg的Rl或 10mg/kg的R17的、诱发关节炎的小鼠中后肢容积的变化。作为对照，给出腹腔内给予不含有肽的生理盐水或0. lmg/kg甲氨蝶呤的小鼠的结果。图11表示腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R13的、诱发关节炎的小鼠中临床评分变化。作为对照，给出腹腔内给予不含有肽的生理盐水或0. lmg/kg甲氨蝶呤的小鼠的结果。图12表示腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R19的、诱发关节炎的小鼠中临床评分的变化。作为对照，给出腹腔内给予不含有肽的生理盐水或0. lmg/kg甲氨蝶呤的小鼠的结果。图13表示腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R21的、诱发关节炎的小鼠中临床评分的变化。作为对照，给出腹腔内给予不含有肽的生理盐水或0. lmg/kg甲氨蝶呤的小鼠的结果。图14表示通过腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R1、R2或R5，诱发III型变态(阿图斯)反应的大鼠中，SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病得到抑制。 作为对照，给出同样地给予不含有肽的生理盐水的大鼠的结果。图15表示通过尾静脉内给予10mg/kg的肽Rl或R2，在诱发III型变态(阿图斯) 反应的大鼠中，SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病得到抑制。作为对照，给出同样地给予不含有肽的生理盐水的大鼠的结果。图16表示通过腹腔内给予10mg/kg或100mg/kg的肽R13或R19，在诱发III型变态(阿图斯)反应的大鼠中，SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病得到抑制。 作为阴性对照，给出同样地给予不含有肽的生理盐水的大鼠的结果，以及作为阳性对照，给出同样地给予50mg/kg氢化可的松的大鼠的结果。图17表示通过尾静脉内给予10mg/kg的肽R13或R19，在诱发III型变态(阿图斯)反应的大鼠中，SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病得到抑制。作为阴性对照，给出同样地给予不含有肽的生理盐水的大鼠的结果。图18表示通过以100mg/kg或10mg/kg给予R13肽，可见关节炎抑制效果。作为阴性对照，给出同样地给予生理盐水或错义肽(scramble peptide)的组(图表中，以CIA或错义表示)的结果，作为阳性对照，给出同样地给予甲氨蝶呤的组(图表中，以MTX(0. 15mg/ kg)表示)的结果。图19是表示通过本发明的肽来检测抗体的图。各泳道中使用的BSA的量如下所示泳道 IBSA 0. 1 μ g，泳道 2BSA 0. 5 μ g,泳道!3BSA1. Oyg,泳道 4BSA 2. O μ g图20是表示通过使用本发明的肽的亲和纯化用柱来纯化兔抗体的图。作为对照， 给出使用I^rotein A进行纯化的结果。值表示各组分中所含的IgG蛋白质量(mg/ml)。图中，PT表示未吸附组分，Wl 5表示洗涤组分、El 5表示洗脱组分。图21是表示通过使用本发明的肽的亲和纯化用柱来纯化人抗体的图。值表示各组分中所含的IgG蛋白质量(mg/ml)。图中，PT表示未吸附组分，Wl 5表示洗涤组分， El 5表示洗脱组分。
具体实施方式
在一个方案1中，本发明涉及一种肽，该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽，选自(a)具有SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列的肽；(b)具有下述氨基酸序列的肽，其是在SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列中， 缺失、置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列；以及(c)具有下述氨基酸序列的肽，其是与SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列具有66. 7%以上同源性的氨基酸序列，其中，肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换，且/或肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。本发明的肽与ftOtein A和ftOtein G比较，与免疫球蛋白的结合能力弱，因此，例如，可以温和的条件下将与本发明的肽结合的免疫球蛋白解离等。另外，与本发明的肽结合的免疫球蛋白自身的变性也降低。结合能力可通过该技术领域中已知的方法检测。例如，可以在免疫球蛋白存在下将肽进行培育，直接检测有否结合。本发明的肽中，肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换。上述不同种类的氨基酸除了甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸和脯氨酸等的氨基酸的L构型和D构型之外，还可举出β-丙氨酸、Y-氨基丁酸(GABA)、 5-氨基乙酰丙酸、5-氨基戊酸、高半胱氨酸、鸟氨酸、5-羟基色氨酸、3，4-二羟基苯丙氨酸 (多巴)、三碘甲腺原氨酸、甲状腺素、高赖氨酸(homolysine)、正亮氨酸、肌酸、锁链赖氨素、正缬氨酸和碘酪氨酸等的非天然氨基酸的L构型和D构型。优选本申请发明的肽中，肽中的半胱氨酸被置换为丝氨酸。本发明的肽中，肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。 具体来说，在SEQ ID NO :1 7的任意的氨基酸序列中，可将1个以上、优选1个或多个、 例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14个或15个氨基酸用对应的D-氨基酸置换。对应的D-氨基酸除了丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、赖氨酸、精氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、组氨酸和脯氨酸等氨基酸的D构型之外，也可以是上述非天然氨基酸的D构型。优选本申请发明的肽中，所有的氨基酸被对应的D-氨基酸置换。或者，本申请发明的肽中，肽中的半胱氨酸可被上述不同种类的氨基酸置换，且肽中的氨基酸被上述的对应的D-氨基酸置换。优选本申请发明的肽中，肽中的半胱氨酸被置换为丝氨酸，且所有的氨基酸被对应的D-氨基酸置换。即使是具有任意一种氨基酸序列的情形，本发明的肽也都是具有免疫球蛋白结合能力的肽。并且，本发明的肽是将来自天然蛋白质的氨基酸序列进行修饰，因此难以进行蛋白质分解，在所给予的对象体内具有高稳定性和长的半衰期。本发明的肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽。所述肽可以是具有SEQ ID NO 观 32的任意的氨基酸序列或dPro Gly dLeu dTyr dTyrdPhe所示的氨基酸序列的肽； 还可以是具有下述氨基酸序列的肽(变异肽)其是在上述氨基酸序列的内部、N末端和/ 或C末端，缺失、置换或附加1个以上、优选1个或多个、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、 13或14个氨基酸得到的氨基酸序列；以及具有下述氨基酸序列的肽其是与上述氨基酸序列具有例如26. 6%以上或44. 4%以上、优选至少为50%以上、更优选例如60、66. 7、70、75、 80、83.3、85、90、93%以上同源性的氨基酸序列。在本说明书中，“ dL (dLeu)，，、“ dP (dPro)，，、 “dA(dAla) ”、“dY (dTyr)，，和 “dF(dPhe) ”、“dS(dSer) ”、“dK(dLys) ”、“dV(dVal) ”、 “dT(dThr) ”、“dH(dHis) ”分别表示亮氨酸、脯氨酸、丙氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、丝氨酸、赖氨酸、缬氨酸、苏氨酸、组氨酸的D构型。并且，关于氨基酸序列的同源性，为短链肽时，可以单纯地对序列进行比较来计算。或者，可使用FASTA、BLAST、DNASIS(Hitachi Software Engineering (株)制造)、GENEITX ((株)Genetyx制造)进行测定。并且，这些氨基酸的任意一种均可以进行适当修饰。即使是具有任意一种氨基酸序列的情形，本发明的肽也都是具有免疫球蛋白结合能力的肽。 本发明的肽只要具有上述氨基酸序列即可，可以是任意的肽。例如，本发明的肽可以是由SEQ ID NO J8 32的任意的氨基酸序列或dPro Gly dLeu dTyr dTyr dPhe所示的氨基酸序列组成的肽本身。或者，还可以是含有上述氨基酸序列或其同源序列作为核心序列，且在所述氨基酸序列的N末端和/或C末端结合有肽或氨基酸、它们的类似物、聚乙二醇、糖、多糖、核苷酸等各种物质的肽。还可以在N/C末端经由氨基酸或肽、或者使用可利用的官能基团在氨基酸序列的内部结合荧光标记、生物素、链霉抗生物素蛋白、地高辛(DIG)、 磁珠、胶乳珠、胶体金等的物质。例如，肽结合时，所述肽可以是由1个 50个、例如1 20 个、1 15个、1 9个氨基酸组成的肽。所述肽可以是发挥组氨酸标记物、GST标记物、S 标记物、Myc标记物、HA标记物、或E标记物功能等的、具有功能的肽。
本发明的肽可通过本领域技术人员已知的各种方法制备和取得。例如，可根据编码本发明的肽的核苷酸序列通过基因工程来制备，或者可根据肽固相合成法等进行化学合成，或者还可以将它们组合来制备和取得。如上所述，本发明的肽具有免疫球蛋白结合能力，因此，使用所述肽，使其与免疫球蛋白结合，可以确定免疫球蛋白的存在或量，可以分离免疫球蛋白等。在另一个方案中，本发明涉及一种核酸，该核酸是编码具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸，选自(a)编码具有SEQ ID NO 28 32的任意的氨基酸序列或其同源序列的肽的核酸；(b)具有SEQ ID NO 33 37的任意的核苷酸序列的核酸；(c)具有下述核苷酸序列的核酸，其是在SEQ ID NO 33 37的任意的核苷酸序列中，缺失、置换或附加1个或多个核苷酸得到的核苷酸序列；(d)可在严谨的条件下与上述(b)或(C)的核酸或其互补链杂交形成的核酸；(e)具有下述核苷酸序列的核酸，其是与SEQ ID NO 33 37的任意的核苷酸序列具有50%以上同源性的核苷酸序列。在本说明书中，核酸是指单链或双链的DNA或RNA。本发明的核酸可通过本领域技术人员已知的各种方法来制备和取得。本发明中，SEQ ID NO :33 37的核苷酸序列分别编码SEQ ID NO 28 32的氨基酸序列。具体来说，本发明的核酸为以下(1) (7)所述的核酸等(1)编码具有SEQ ID NO 28 32的任意的氨基酸序列的肽的核酸；(2)编码具有下述氨基酸序列的肽的核酸， 其是在SEQ ID NO 28 32的任意的氨基酸序列中，缺失、置换或附加1个以上、优选1个或多个、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个左右的氨基酸得到的氨基酸序列；(3) 编码具有下述氨基酸序列的肽的核酸，其是与SEQ ID NO :28 32的任意的氨基酸序列具有例如26. 6%以上或44. 4%以上、优选至少50%以上、更优选例如60,66. 7、70、75、80、 83. 3、85、90或93%以上同源性的氨基酸序列；(4)具有SEQ ID NO 33 37的任意的核苷酸序列的核酸；(5)具有下述核苷酸序列的核酸，其是在SEQ ID NO 33 37的任意的核苷酸序列中，缺失、置换或附加1个以上、优选1个或多个、例如2、3、4、5、6、7、8或9个左右的核苷酸得到的核苷酸序列；(6)可在严谨的条件下与上述C3)或的任意的核酸或其互补链杂交形成的核酸；以及(7)具有下述核苷酸序列的核酸，其是与SEQ ID N0:33 37的任意的核苷酸序列至少具有50%以上、优选例如60、70、75、80、90、93、95、或97%以上同源性的核苷酸序列。并且，这些核苷酸的任意一种均可以进行适当修饰。即使是具有任意一种氨基酸序列的情形，本发明的核酸也都是编码具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸。作为上述严谨的条件，例如可举出J. Sambrook等人.，“Molecular Cloning A Laboratory Manual, Second Edition，，，1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press 中记载的条件。例如在含有6XSSC、5XDenhardt，s溶液、0. 5 % SDS、100 μ g/ml变性鲑鱼精子DNA的溶液中，在68°C下与探针杂交形成后，洗涤条件有下述条件等自2XSSC、 0.1% SDS中、室温下变化为在0. 1XSSC.0. 5% SDS中、68 °C的条件；在65 °C下、在含有 2 X SSPE (Frederick Μ· Ausubel 等人·，"Current Protocols in Molecular Biology，，， 1987, John Wiley & Sons, Hoboken NJ.中记载)和 0. 1 % SDS 的溶液中洗涤 15 分钟、2 次， 在含有0.5 X SSPE和0. SDS的溶液中进一步洗涤15分钟、2次，接着在含有0. IXSSPE 和0. SDS的溶液中洗涤15分钟、2次的条件；或者在65°C下、在含有2 X SSPE、0. SDS 和甲酰胺(5 50% )的溶液中洗涤15分钟、2次，在含有0. 5XSSPE、0. 1% SDS和甲酰胺 (5 50% )的溶液中进一步洗涤15分钟、2次，接着在含有0. 1XSSPE、0. 1% SDS和甲酰胺(5 50% )的溶液中洗涤15分钟、2次的条件。上述核苷酸序列的同源性例如可使用FASTA、BLAST、DNASIS(Hitachi Software Engineering (株)制造)、GENETYX ((株)Genetyx 制造)来测定。本发明的核酸只要是具有上述核苷酸序列的核酸即可，可以是任意的核酸。例如， 可以是由SEQ ID NO :33 37的任意的核苷酸序列组成的核酸本身，还可以是含有上述核苷酸序列作为核心序列，且所述序列的5’末端和/或3’末端结合有核苷酸、多核苷酸、或它们的类似物等各种物质的核酸。例如多核苷酸结合时，所述多核苷酸可以是由1 150 个、例如1 60个、1 45个、1 18个核苷酸组成的多核苷酸。在又一方案中，本发明涉及含有上述核酸的载体。本发明的载体只要含有上述核酸即可，可以使任意的载体。载体的种类、上述核酸的核苷酸序列以外的序列等可根据导入载体的宿主的种类、目的等各种条件适当选择。本发明的载体例如可通过在SEQ ID N0 33 37的任一个所示的核苷酸序列的5’末端或3’末端读框内插入编码目标蛋白质的核苷酸序列，可作为具有免疫球蛋白结合能力的肽附加在目标蛋白质的N末端或C末端得到的融合蛋白的表达用载体使用。为了容易地从融合蛋白上分离目标蛋白质，本发明的载体可以在上述核苷酸序列和目标蛋白质的核苷酸序列插入部之间含有例如通过HRV 3C、凝血酶、因子fe、肠激酶等的蛋白酶识别的序列。也可以将本发明的载体导入细胞，以生产蛋白质，由此得到上述本发明的具有免疫球蛋白结合能力的肽。在另一方案中，本发明涉及本发明的具有免疫球蛋白结合能力的肽附加在目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的融合蛋白。本发明的融合蛋白可通过本领域技术人员已知的各种方法来制备和取得。本发明的融合蛋白含有具有免疫球蛋白结合能力的肽，因此， 可以使用所述肽作为标记物序列，进行目标蛋白质的分离和/或纯化等。另外，如上所述，本发明的肽与免疫球蛋白的结合能力低，因此，本发明的融合蛋白例如固定于纯化用柱中时，与ftOtein A或ftOtein G比较，可在温和的条件下进行免疫球蛋白的纯化以及将所述柱反复使用(可抑制劣化)，例如，作为免疫球蛋白的检测用探针时，具有再探测容易等的优点。本发明的融合蛋白中所含的目标蛋白质可以使任意的蛋白质。本发明的融合蛋白含有例如碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(HRP)、萤光素酶和绿色荧光蛋白(GFP)等的荧光蛋白质、β -半乳糖苷酶、谷胱甘肽S转移酶、麦芽糖结合蛋白质等的酶作为目标蛋白质时， 可以容易地检测本发明的融合蛋白中所含的具有免疫球蛋白结合能力的肽与免疫球蛋白的结合等。本发明的融合蛋白还可以含有例如组氨酸标记物、GST标记物、S标记物、Myc标记物、HA标记物或E标记物等的标记物序列，核定位信号、硅结合蛋白质或ftOtein A等。本发明的融合蛋白可以在本发明的肽与目标蛋白质之间含有蛋白酶识别肽。通过含有所述肽，可以容易地从融合蛋白中分离目标蛋白质。因此，在又一方案中，本发明涉及编码上述融合蛋白的核酸。本发明进一步涉及含有编码上述融合蛋白的核酸的载体。可通过将所述载体导入细胞，生产蛋白质，来得到本发明的融合蛋白。在一个方案中，本发明涉及编码上述具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸、编码上述融合蛋白的核酸、或含有载体的细胞，该载体含有上述这些核酸。本发明的细胞例如可通过使用上述核酸或载体来转化大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、动物细胞等宿主细胞来制备。 培养本发明的细胞，回收所生产的具有免疫球蛋白结合能力的肽、或含有具有免疫球蛋白结合能力的肽的融合蛋白，由此可以制备本发明的肽或融合蛋白。在又一方案中，本发明涉及具有免疫球蛋白结合能力的肽的制备方法，该方法包含以下步骤(a)使用含有核酸的载体来转化细胞，其中，该核酸编码具有免疫球蛋白结合能力的肽；(b)培养该细胞以生产肽。细胞的转化可通过本领域技术人员已知的手段和/或方法进行。因此，本发明涉及可通过上述肽的制备方法得到的、具有免疫球蛋白结合能力的肽。在另一方案中，本发明涉及具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N 末端和/或C末端得到的融合蛋白的制备方法，该方法包含以下步骤(a)使用含有核酸的载体来转化细胞，其中，所述核酸编码具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N末端或C末端得到的融合蛋白；(b)培养该细胞以生产融合蛋白。本发明的融合蛋白的制备方法可以进一步包含从融合蛋白中获取目的蛋白质的步骤。因此，本发明涉及可通过上述融合蛋白的制备方法得到的、具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的融合蛋白。在一个方案中，本发明涉及用于使免疫球蛋白结合的组合物，该组合物包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或含所述肽的融合蛋白。上述肽或融合蛋白以外的成分可根据使用本发明的组合物的目的等各种条件适当选择。如上所述，本发明的组合物含有具有免疫球蛋白结合能力的肽，因此，本发明的组合物例如可以是用于确定免疫球蛋白的存在或量的组合物，也可以是用于分离免疫球蛋白的组合物。通过本发明的组合物，可以确定试样中免疫球蛋白的量，也可以从试样中分离免疫球蛋白。在又一方案中，本发明涉及用于使免疫球蛋白结合的手段，该手段是将具有免疫球蛋白结合能力的肽、或含有所述肽的融合蛋白固定。本发明的手段例如是在板、树脂、柱、 珠、琼脂等的含有糖的树脂、硅基板、玻璃(玻片等)、金属(金等)、磷灰石等的担体上固定上述肽或融合蛋白。固定可通过以下方法进行经由肽、或蛋白质的氨基或羧基的方法，经由氨基酸支链的SH基的方法，通过离子性结合的方法，通过疏水性结合的方法等本领域技术人员已知的手段、方法。如上所述，本发明的手段是将具有免疫球蛋白结合能力的肽固定，因此，本发明的手段包含用于确定免疫球蛋白的存在或量的手段、以及用于分离免疫球蛋白的手段。例如也可以以ELISA用板、免疫球蛋白纯化用柱、检测用玻璃阵列(glass array)、微流体系统、 SI^R用传感芯片、检测用硅基板、抗体药物纯化系统等的形式使用本发明的手段。在又一方案中，本发明涉及使免疫球蛋白结合的方法，该方法包含(a)将具有免疫球蛋白结合能力的肽、或含有所述肽的融合蛋白添加到试样中；(b)检测肽或融合蛋白与免疫球蛋白的结合体。试样只要具有含免疫球蛋白的可能性即可，可以是任意的试样。通过检测与免疫球蛋白的结合体的存在和/或量，可以确定试样中是否存在免疫球蛋白，并可进一步确定存在于试样中的免疫球蛋白的量等。本发明的方法中使用的肽或融合蛋白可以进行标记。 标记可举出生物素化、荧光标记、RI标记、酶标等本领域技术人员已知的各种标记。通过附加所述标记，使得对与肽或融合蛋白的结合体的检测变得容易。本发明的方法可进一步包含从结合体上分离免疫球蛋白的步骤。因此，本发明涉及试剂盒，该试剂盒是用于在使免疫球蛋白结合的方法中使用，包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或含所述肽的融合蛋白。本发明的试剂盒中，除了上述肽或融合蛋白之外，例如还可含有标记、检测结合体的手段等。在另一方案中，本发明涉及由Clq与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物，该药物组合物含有具有免疫球蛋白结合能力的肽、或含所述肽的融合蛋白。由Clq与免疫球蛋白的结合而引起的疾病是指由于所述结合而直接或间接地发生的疾病，例如可举出类风湿性关节炎、关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎综合征、肾炎等的免疫复合物病，其它的炎症性疾病、感染症、和恶性肿瘤等。本发明的药物组合物是通过所含的具有免疫球蛋白结合能力的肽抑制Clq与免疫球蛋白的结合，可以治疗和预防上述疾病。本发明的肽来自原本存在于人体内的Clq，且为6 15个残基，较短，因此，将本发明的肽给予人时发生的副作用少。并且，本发明的肽是将来自天然蛋白质的氨基酸序列进行修饰，因此难以进行蛋白质分解，在所给予的对象体内具有高稳定性和长的半衰期。本发明的药物组合物的给予方法可根据疾病的种类、对象的状态、和/或靶部位等的条件适当选择。该方法可举出皮内给予、皮下给予、肌肉内给予、静脉内给予、透鼻给予、口服给予等，但并不限于此。本发明的药物组合物中所含的肽的量、药物组合物的剂型、 给予频率等可根据疾病的种类、对象的状态、靶部位等的条件适当选择，例如1次的肽给予量可以是0. 01 100mg/kg、优选0. 1 10mg/kg，但本发明的肽的给予量并不限于这些。在又一方案中，本发明涉及由Clq与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防方法，该方法包含将有效量的具有免疫球蛋白结合能力的肽或含所述肽的融合蛋白给予对象。以下给出实施例，具体且详细地说明本发明，但不能理解为实施例限定本发明。实施例1免疫球蛋白所识别的Clq中的氨基酸序列的鉴定材料和方法人Clq的亚基A链、B链、C链的氨基酸序列如SEQ ID NO 17 19所示，核苷酸序列如SEQ ID N0:20 22所示。以各氨基酸序列为基础，以3个氨基酸的间隔推移每15个氨基酸(残基)，以此序列作为合成肽(肽编号依次为1 78、97 117、193 270号)， 在玻璃阵列上合成各亚基的氨基酸序列。各肽的合成在阵列上特定的位置进行，制作肽阵列，该肽阵列含有包罗了 Clq亚基的全部氨基酸序列的合成肽。阵列的制作委托JPT公司进行。将330 μ 1 用 PBSdOmM 磷酸缓冲液，pH7. 0,0. IM NaCl)稀释 1，000 倍的 Cy3 标记山羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG) (lmg/ml ；Zymed Laboratories公司制造)涂布在肽阵列上， 密封，然后在4°C培育12小时。然后用甲醇洗涤1次，用Mili-Q水以5分钟X 5次洗涤。 离心，将阵列玻片干燥，用荧光扫描仪(Agilent DNA微阵列扫描仪；Agilent公司制造)扫描，使用软件(Feature Extraction软件；Agilent公司制造)，将阵列上各肽样点的荧光强度数值化。检测显示强荧光强度的几个样点。其中，显示比背景水平高的、60，000以上高的荧光强度的肽样点的氨基酸序列(SEQ ID N0:3 7)如表1所示。在本说明书中，氨基酸由本领域已知的单字母标记记载。[表1]
肽编号氨基酸序列SEQ ID NO荧光强度*149号SGKFTCKVPGLYYFT365，300150号FTCKVPGLYYFTYHA465，311244号STGKFTCKVPGLYYF565，311245号KFTCKVPGLYYFVYH665，311246号CKVPGLYYFVYHASH765，313*背景的荧光强度为2. 6结果149号和150号的肽是来自ClqB亚基(B链)的序列，244 246号的肽是来自 ClqC亚基(C链)的序列。由这些序列预测，Clq与免疫球蛋白结合所必须的序列是以 CKVPGLYYF(SEQ ID NO 2)的9个残基为核心的序列。还确认，如果是含有该核心序列的序列，即使是数个残基的氨基酸与该N末端或C末端一侧结合，也不妨碍与免疫球蛋白的结合。149号和150号、244 246号的肽的核苷酸序列如SEQ IDNO 12 16所示。实施例2具有免疫球蛋白结合能力的肽对免疫球蛋白与Clq结合的抑制抑制活性的研究 (1)材料和方法以下研究Clq与免疫球蛋白(IgG)的结合所必须考虑的CKVPGLYYF (SEQ ID NO 2)的9个残基的肽是否抑制Clq与免疫球蛋白的结合。委托GL Biochem(Shanghai) 公司制作具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列的肽(R2)、具有比所述肽短的氨基酸序列 PGLYYF (SEQ ID NO=D的肽(Rl)、以及具有含SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列的氨基酸序列 SGKFTCKVPGLYYFT (SEQ ID NO 3)的肽(R!3)、具有氨基酸序列 FTCKVPGLYYFTYHA(SEQ ID NO 4)的肽(R4)、具有氨基酸序列STGKFTCKVPGLYYF(SEQ ID NO 5)的肽(R5)、以及具有氨基酸序列CKVPGLYYFVYHASH(SEQ ID NO 7)的肽(R6)。这些肽如表2所示。将各肽溶解于 DMS0，使浓度为10mg/ml，保存。[表2]
权利要求
1.肽，该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽，选自(a)具有SEQID NO :1 7的任意的氨基酸序列的肽；(b)具有下述氨基酸序列的肽，其是在SEQID NO :1 7的任意的氨基酸序列中，缺失、 置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列；以及(c)具有下述氨基酸序列的肽，其是与SEQID NO :1 7的任意的氨基酸序列具有 66. 7%以上同源性的氨基酸序列，其中，肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换。
2.权利要求1所述的肽，其中，肽中的半胱氨酸被丝氨酸置换。
3.权利要求2所述的肽，该肽具有SEQID NO 28 32的任意的氨基酸序列。
4.肽，该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽，选自(a)具有SEQID NO :1 7的任意的氨基酸序列的肽；(b)具有下述氨基酸序列的肽，其是在SEQID NO :1 7的任意的氨基酸序列中，缺失、 置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列；以及(c)具有下述氨基酸序列的肽，其是与SEQID NO :1 7的任意的氨基酸序列具有 66. 7%以上同源性的氨基酸序列，其中，肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。
5.权利要求4所述的肽，其中，所有的氨基酸均可被对应的D-氨基酸置换。
6.权利要求5所述的肽，该肽具有dProGly dLeu dTyr dTyr dPhe所示的氨基酸序列。
7.肽，该肽是具有免疫球蛋白结合能力的肽，选自(a)具有SEQID NO :1 7的任意的氨基酸序列的肽；(b)具有下述氨基酸序列的肽，其是在SEQID NO :1 7的任意的氨基酸序列中，缺失、 置换或附加1个或多个氨基酸得到的氨基酸序列；以及(c)具有下述氨基酸序列的肽，其是与SEQID NO :1 7的任意的氨基酸序列具有 66. 7%以上同源性的氨基酸序列，其中，肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换，且肽中的氨基酸可被对应的D-氨基酸置换。
8.权利要求7所述的肽，其中，肽中的半胱氨酸可被不同种类的氨基酸置换，且所有的氨基酸均可被对应的D-氨基酸置换。
9.核酸，该核酸是编码具有免疫球蛋白结合能力的肽的核酸，选自(a)编码权利要求1所述的肽的核酸；(b)具有SEQID NO 33 37的任意的核苷酸序列的核酸；(c)具有下述核苷酸序列的核酸，其是在SEQID NO :33 37的任意的核苷酸序列中， 缺失、置换或附加1个或多个核苷酸得到的核苷酸序列；(d)可与上述(b)或(c)的核酸或其互补链在严谨的条件下杂交形成的核酸；(e)具有下述核苷酸序列的核酸，其是与SEQID NO :33 37的任意的核苷酸序列具有50%以上同源性的核苷酸序列。
10.权利要求9所述的核酸，该核酸具有SEQID NO 33 37的任意的核苷酸序列。
11.载体，该载体含有权利要求9或10所述的核酸。
12.融合蛋白，其是权利要求1 3中任一项所述的肽附加于目标蛋白质的N末端和/ 或C末端得到的融合蛋白。
13.融合蛋白，其是权利要求4 8中任一项所述的肽附加于目标蛋白质的N末端和/ 或C末端得到的融合蛋白。
14.核酸，该核酸编码权利要求12所述的融合蛋白。
15.载体，该载体含有权利要求14所述的核酸。
16.细胞，该细胞含有权利要求9或10所述的核酸或权利要求14所述的核酸、或者权利要求11或15所述的载体。
17.具有免疫球蛋白结合能力的肽的制备方法，该方法包含以下步骤(a)使用权利要求11所述的载体来转化细胞；(b)培养该细胞以生产肽。
18.具有免疫球蛋白结合能力的肽，该肽可通过权利要求17所述的方法得到。
19.融合蛋白的制备方法，该融合蛋白是具有免疫球蛋白结合能力的肽附加于目标蛋白质的N末端和/或C末端得到的，所述方法包含(a)使用权利要求15所述的载体来转化细胞；(b)培养该细胞以生产融合蛋白。
20.权利要求19所述的方法，该方法进一步包含由融合蛋白获取目标蛋白质的步骤。
21.融合蛋白，该融合蛋白可通过权利要求19或20所述的方法得到。
22.用于使免疫球蛋白结合的组合物，该组合物包含权利要求1 8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白。
23.权利要求22所述的组合物，该组合物用于确定免疫球蛋白的存在或量、或者用于分离免疫球蛋白。
24.用于使免疫球蛋白结合的手段，该手段是将权利要求1 8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白固定。
25.权利要求M所述的手段，该手段用于确定免疫球蛋白的存在或量、或者用于分离免疫球蛋白。
26.使免疫球蛋白结合的方法，该方法包含(a)将权利要求1 8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白添加到试样中；(b)检测肽或融合蛋白与免疫球蛋白的结合体。
27.试剂盒，该试剂盒用于在权利要求沈所述的方法中使用，包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或含所述肽的融合蛋白。
28.由Clq与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物，该药物组合物包含权利要求1 8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白。
29.权利要求观所述的药物组合物，其中，疾病是类风湿性关节炎。
30.权利要求观所述的药物组合物，其中，疾病是系统性红斑狼疮简写成SLE、肾小球肾炎、血管炎、关节炎等的免疫复合物病。
31.标记的权利要求1 8中任一项所述的肽、或者权利要求12或13所述的融合蛋白。
32.试样中抗体的检测方法，其特征在于使权利要求31所述的标记肽或融合蛋白与试样中的抗体反应，接着检测与抗体结合的该肽或融合蛋白。
全文摘要
本发明提供具有免疫球蛋白结合能力的肽、以及与所述肽的融合蛋白、编码它们的核酸、制备方法、用于与免疫球蛋白结合的组合物以及手段、以及由于C1q与免疫球蛋白的结合而引起的疾病的治疗或预防用药物组合物等，该药物组合物包含具有免疫球蛋白结合能力的肽或与所述肽的融合蛋白。
文档编号C12N1/21GK102361979SQ20108001403
公开日2012年2月22日 申请日期2010年1月19日 优先权日2009年1月23日
发明者真崎修 申请人:株式会社Mmt