能够生产异源抗体的转基因非人动物的制作方法

专利名称：：能够生产异源抗体的转基因非人动物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及能够生产异源抗体的转基因非人动物、用于生产所述动物的转基因、能够以V-D-J重组功能性重排异源D基因的转基因、能够生产异源抗体的无限增殖化B细胞、用于生产多种同种型异源抗体的方法和转基因、用于生产异源抗体的方法和转基因(其中与种系重排的可变区序列相比，可变区序列含有体细胞突变)、生产具有人一级序列并与人抗原结合之抗体的转基因非人动物、从所述转基因动物B细胞制备的杂交瘤以及由所述杂交瘤表达的单克隆抗体。
背景技术：
：发展单克隆抗体在人体中的体内治疗和诊断应用所面临的主要障碍是非人免疫球蛋白的内在免疫原性。例如，当给具有免疫能力的病人施用治疗剂量的啮齿类单克隆抗体时，病人产生抗啮齿类免疫球蛋白序列的抗体；这些人抗小鼠抗体(HAMA)中和了治疗抗体并会引起急性毒性。因此需要生产与特异性人抗原反应的人免疫球蛋白，所述抗原是预定的治疗和/或诊断靶。但是，生产与人抗原特异性结合的人免疫球蛋白还有很多问题。目前用于生产单克隆抗体的技术涉及用抗原预接触或引发动物(通常是大鼠或小鼠)、从所述动物中收集B细胞并产生杂交瘤克隆文库。通过筛选具有抗原结合特异性(个体型)的杂交瘤群并筛选免疫球蛋白类型(同种型)，可以筛选出分泌所需抗体的杂交瘤克隆。但是，当将现有生产单克隆抗体的技术用于生产具有人抗原结合特异性的人抗体时，获得生产人免疫球蛋白的B淋巴细胞则出现了严重的障碍，因为人通常对自身抗原不产生免疫反应。因此，现有生产能与人抗原特异性反应的人单克隆抗体的方法显然不适当。显然，当用非人品种作为制备杂交瘤的B细胞源时，对于生产抗真正自身抗原的单克隆抗体也有同样的限制。构建含有功能性异源免疫球蛋白转基因的转基因动物是可以生产与自身抗原有反应性的抗体的一种方法。但为了表达有治疗用途的抗体或获得生产所述抗体的杂交瘤克隆，转基因动物必须产生能够通过B淋巴细胞发育途径成熟的转基因B细胞。所述成熟要求在转基因B细胞上存在表面IgM，但有治疗用途的只有不是IgM的同种型。因此，需要转基因和含所述转基因的动物，所述转基因通过功能性V-D-J重排可产生重组多样性和连接多样性。此外，所述转基因和转基因动物优选包含顺式作用序列，所述序列有利于从B细胞成熟所需的第一同种型转变成有良好治疗效用的同种型。已经报道了许多试验，这些试验利用转染的细胞系确定Ig基因重排所需的特异性DNA序列(见LewisandGellert(1989)，Cell，59,585-588中的综述)。所述报告鉴定了推测的序列并得出结论这些序列对重排所用重组酶的可接近性受转录调节(YancopoulosandAlt(1985)，Cell，40,271-281)。报道认为V(D)J连接的序列是高度保守的接近回文的七聚体以及由12或23bp间隔序列分开的不太保守的富集AT的九聚体(nanomer)(Tonegawa(1983)，Nature，，302,575-581；Hesse，etal.，(1989)，GenesinDev.，3,1053-1061)。报道说有效重组仅发生在含重组信号序列的位点之间，所述信号序列含有不同长度的间隔区。Ig基因重排，尽管在组织培养细胞中进行了研究，但在转基因小鼠中还未得到广泛地验证。只有很少的报告公开描述了导入到小鼠中的重排试验构建体[Buchini，etal.，(1987)，Nature，326,409-411(未重排的鸡λ转基因)；Goodhart，etal.，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84,4229-4233(未重排的兔κ基因)；和Bruggemann，etal.，(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86,6709-6713(杂种小鼠—人重链)]。但这些试验的结果是不确定的，在一些情况下，发生了转基因的不完全或很少的重排。此外，抗体分子的各种生物学功能由分子的Fc部分产生，如通过Fcε与肥大细胞或嗜碱细胞相互作用、通过Fcμ或Fcγ进行补体结合，还需要通过同种型的改变使具有给定特异性的抗体产生功能多样性。尽管已经有了带有编码异源抗体的一条或多条链的转基因的转基因动物，但尚未有成功地进行同种型转换的异源转基因的报道。不能转换同种型的转基因动物只能生产单一同种型异源抗体，更具体地说，只限于生产B细胞成熟所必需的同种型，如IgM和可能的IgD，因此只有有限的治疗应用。因此需要异源免疫球蛋白转基因和转基因动物，它们可将B细胞发育所需的同种型转换成具有治疗所需特征的同种型。基于上述原因，显然需要能够有效生产异源抗体，例如在第二个品种中生产由第一品种的遗传序列编码的抗体的方法。更具体地说，本领域需要异源免疫球蛋白转基因和转基因动物，它们能够进行掺入全部或部分D基因片段的功能性V-D-J基因重排，所述D基因片段是产生重组多样性的原因。此外，本领域还需要可支持V-D-J重组和同种型转换的转基因和转基因动物，以便(1)功能性B细胞可发育和(2)可生产治疗上有用的异源抗体。还需要可用于制备杂交瘤的B细胞源，所述杂交瘤生产在所针对的特定靶种中有治疗或诊断用途的单克隆抗体。能够进行功能性V-D-J重组和/或能够进行同种型转换的异源免疫球蛋白转基因可满足这些需要。根据前述目的，提供了能够生产异源抗体如人抗体的转基因非人动物。此外，另一个目的是提供来自所述转基因动物的能够表达异源抗体的B细胞，其中所述B细胞是可无限增殖的，是产生特异于特定抗原的单克隆抗体的源。根据前述目的，本发明的另一目的是提供能够生产所述异源单克隆抗体的杂交瘤细胞。另外，本文的又一个目的是提供异源未重排和重排的免疫球蛋白重链和轻链转基因，这些转基因可用于生产前述非人转基因动物。此外，本文的再一个目的是提供破坏转基因动物中内源免疫球蛋白座位的方法。另外，本文的另一个目的是提供在前述转基因非人动物中诱导异源抗体生产的方法。本发明的另一目的是提供生产免疫球蛋白可变区基因片段库的方法，该库可用于构建本发明的一种或多种转基因。本文所讨论的参考文献仅仅是本申请申请日之前其公开的内容。本文没有任何内容表明发明人不可以通过在先发明而将所述文献内容的公开日期提前。发明综述提供了能够生产异源抗体，如人抗体的转基因非人动物。所述异源抗体可以是各种同种型，包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgM、IgA1、IgA2、IgAsec、IgD、IgE。为了使所述转基因非人动物产生免疫反应，需要使转基因B细胞和前B细胞产生表面结合的免疫球蛋白，特别是IgM(或可能是IgD)同种型，以便实现B细胞发育以及抗原刺激的成熟。IgM(或IgD)表面结合免疫球蛋白只需在B细胞发育的抗原-刺激成熟期表达，然后成熟B细胞可以生产其它同种型，尽管一次只能生产单一转换的同种型。通常，B细胞系的细胞一次只能生产单一的同种型，尽管可进行顺式或反式RNA剪接，例如天然产生的μS(分泌的μ)和μM(膜结合的μ)型，但μ和δ免疫球蛋白链会导致一个细胞同时表达多种同种型。因此，为了产生多同种型的异源抗体，具体地说是治疗上有用的IgG、IgA和IgE同种型，就需要有同种型转换发生。所述同种型转换可以是经典的型-转换，或者可源于一种或多种非经典的同种型转换机制。本发明提供了异源免疫球蛋白转基因和含所述转基因的转基因非人动物，其中所述转基因动物能够通过同种型转换生产多种同种型的异源抗体。经典的同种型转换是通过重组而进行的，该重组过程至少与转基因的一个转换序列区有关。非经典的同种型转换可通过例如人σμ和人∑μ序列之间的同源重组(δ-相关的缺失)而进行的。其它非经典转换机制如包括转基因间和/或染色体间重组以及其它方式也可以发生并可实现同种型转换。所述转基因和转基因非人动物生产受抗原-刺激的B细胞成熟所必需的第一免疫球蛋白同种型，然后可转换成编码并产生具有治疗和/或诊断用途的一种或多种异源同种型。因此，本发明的转基因非人动物在一个实施方案中能够生产，由人免疫球蛋白遗传序列编码并以高亲和力与特异性人抗原结合的IgG、IgA和/或IgE抗体。本发明还包括来自能够表达各种同种型异源抗体的转基因动物的B细胞，其中所述B细胞被无限增殖化以便提供特异于特定抗原的单克隆抗体源。衍生于所述B细胞的杂交瘤可作为所述异源单克隆抗体的一种来源。本发明提供异源未重排和重排的免疫球蛋白重链和轻链转基因，所述转基因能够在前述非人转基因动物体内或来自所述转基因动物B细胞谱系的人工培养的淋巴细胞内进行同种型转换。所述同种型转换可以自发发生或者通过促进同种型转换的试剂如T-细胞衍生的淋巴因子(如IL-4和IFNγ)处理转基因动物或人工培养的B谱系淋巴细胞而诱导产生。此外，本发明包括在前述转基因非人动物中诱导异源抗体生产的方法，其中所述抗体可以是各种同种型。这些方法包括在转基因非人动物中产生抗原-刺激的免疫反应以产生异源抗体，特别是转换的同种型的异源抗体(即，IgG、IgA和IgE)。本发明也提供了使转基因含有可实现同种型转换的序列的方法，以便在转基因动物中产生的异源免疫球蛋白和衍生于所述动物B细胞的单克隆抗体克隆是各种同种型的。本发明还提供了有利于转基因同种型转换的方法，以便特定同种型之间的转换可以以比通常发生于种系免疫球蛋白座位高或低得的多频率或以不同的时间顺序发生。转换区可取自各种CH基因，然后在转基因构建体中与其它CH基因相连；这样移植出的转换序列通常对于相连的CH基因来说是功能上独立的，以便在转基因构建体中的转换通常是相连转换区的一种功能。另一种方法是，或与转换序列组合，可将δ-相关缺失序列与不同CH基因相连，通过缺失两个δ-相关缺失序列之间的序列来实现非经典转换。因此，可以构建转基因以便将特定的CH基因与不同转换序列相连，由此，使转换以高于使用天然相关转换区时的频率发生。本发明还提供了确定在含免疫球蛋白转基因的转基因动物中是否发生了转基因序列的同种型转换的方法。本发明提供了免疫球蛋白转基因构建体以及生产免疫球蛋白转基因构建体的方法，其中的一些构建体含有种系免疫球蛋白座位序列的子序列(可包含缺失)。本发明包括便于进行克隆并构建免疫球蛋白转基因的具体方法，所述方法涉及使用XhoI和SalI单限制位点的载体，所述限制位点两侧翼各有一个NotI位点。该方法研究了XhoI和SalI限制位点的互补末端，并可用于将限制片段依次连接到载体中产生大构建体。本发明的转基因包括重链转基因，包含编码至少一个可变基因片段、一个多样性基因片段、一个连接基因片段和一个恒定区基因片段的DNA。免疫球蛋白轻链转基因包含编码至少一个可变基因片段、一个连接基因片段和一个恒定区基因片段的DNA。编码轻和重链基因片段的基因片段对于转基因非人动物来说是异源的，即它们衍生于或相应于编码与转基因非人动物不同的品种的重和轻链基因片段的DNA。在本发明的一个方面，构建转基因以便个各基因片段是未重排的，即没有被重排以便编码有功能的免疫球蛋白轻或重链。所述未重排的转基因可以进行基因片段的重组(功能性重排)并当将所述动物与抗原接触后，在所述转基因非人动物中可以表达重排的免疫球蛋白重和/或轻链。在本发明的一个方面，异源重和轻链免疫球蛋白转基因含有未重排异源DNA的相对大的片段。所述大片段通常含有来自异源免疫球蛋白座位C、J(在重链的情况下，和D)片段的必需部分。此外，所述片段还含有可变基因片段的必需部分。在一个实施方案中，所述转基因构建体含有与衍生于异源DNA的序列对应的调节序列(如启动子、增强子)、型转换区、重组信号等。另外，也可将所述调节序列掺入到转基因中，所述转基因来自与本发明所用非人动物相同或相关的种。例如，可将人免疫球蛋白基因片段与啮齿类免疫球蛋白增强子序列组合以用于转基因小鼠。在本发明的方法中，将含有种系未重排轻和重免疫球蛋白转基因(在D细胞分化过程中进行了VDJ连接)的转基因非人动物与抗原接触，以便在二级B细胞库中诱导异源抗体的生产。本发明还包括在本发明中所用的载体和破坏本发明所用非人动物中的内源免疫球蛋白座位的方法。所述载体和方法利用转基因，优选阳性-阴性选择载体，使所构建的载体靶向功能性破坏的一组编码本发明所用非人动物的内源重和/或轻免疫球蛋白链的基因片段。所述内源基因片段包括多样性、连接和恒定区基因片段。在本发明的该方面，将阳性-阴性选择载体与非人动物的至少一种胚胎干细胞接触，此后，选择其中将阳性-阴性选择载体通过同源重组整合到非人动物基因组中的细胞。移植后，由于所述载体同源整合到染色体DNA中，所得的转基因非人动物基本上不能发生免疫球蛋白介导的免疫反应。因此可将所述免疫缺陷型非人动物用于研究免疫缺陷或用作免疫球蛋白重和轻链转基因的受体。本发明海提供了用于抑制一种或多种免疫球蛋白链表达，而不破坏内源免疫球蛋白座位的载体、方法和组合物。所述方法可用于抑制一种或多种内源免疫球蛋白链的表达，但却可以表达一种或多种转基因-编码的免疫球蛋白链。与从遗传上破坏内源免疫球蛋白链座位不同，免疫球蛋白链表达的抑制不需要耗时的、建立被破坏了内源Ig座位纯合的转基因动物的育种过程。与内源Ig基因破坏相比，抑制作用的另一优点是在特定实施方案中，在个体动物中链抑制是可逆的。例如，Ig链抑制可利用下列序列完成(1)编码并表达反义RNA的转基因，所述反义RNA与内源Ig链基因序列可特异性杂交，(2)与内源Ig链基因序列可特异性杂交的反义寡核苷酸，和(3)与内源Ig链多肽特异性结合的免疫球蛋白。本发明提供了转基因非人动物，所述动物含有纯合的功能被破坏了的内源重链等位基因，纯合的功能被破坏了的内源轻链等位基因，至少一个拷贝的异源免疫球蛋白重链转基因，和至少一个拷贝的异源免疫球蛋白重链转基因，其中在用抗原如人抗体(如CD4)免疫接种后，所述动物产生抗体反应。本发明还提供了所述的转基因非人动物，其中所述功能破坏了的内源重链等位基因是同源重组失效的JH区，所述功能破坏了的内源轻链等位基因是同源重组失效的Jκ区，所述异源免疫球蛋白重链转基因是HC1或HC2人小基因(minigene)转基因，所述异源轻链转基因是KC2或KC1e人κ转基因，而且其中所述的抗原是人抗原。本发明还提供了抑制、除去和/或功能破坏内源非人免疫球蛋白座位的各种实施方案。本发明还提供了表达人重链序列和嵌合重链的转基因小鼠，所述嵌合重链含有人重链可变区序列和鼠重链恒定区序列。所述嵌合重链通常通过在功能重排的人转基因和内源鼠重链恒定区(如γ1、γ2a、γ2b、γ3)之间的反转换(trans-switching)而产生。含所述嵌合重链的抗体(通常与转基因编码的人轻链序列或内源鼠轻链组合)是应答用预定抗原进行的免疫接种而形成的。这些实施方案的转基因小鼠可含有B细胞，所述B细胞在第一时间点产生(表达)人重链序列，并在第二(随后)的时间点反转换产生(表达)由人可变区和鼠恒定区(如γ1、γ2a、γ2b、γ3)组成的嵌合重链；将所述人序列和嵌合重链掺入到带轻链的有功能抗体中；所述抗体存在于所述转基因小鼠的血清中。因此重申这些实施方案的转基因小鼠可含有表达人重链序列并随后进行转换(经反式转换或顺式转换)表达嵌合或同种型转换的重链(由人可变区和其它恒定区(如鼠γ1、γ2a、γ2b、γ3；人γ、α、ε)组成)的B细胞；所述人序列和嵌合或同种型转换的重链被掺入到带轻链(人或小鼠)的有功能抗体中；所述抗体存在于所述转基因小鼠的血清中。本发明还提供了产生大的转基因的方法，所述方法包括将至少三种多核苷酸导入到哺乳动物细胞中；第一种多核苷酸含有与第二种多核苷酸享有序列一致性的重组(recombinogenic)区，第二种多核苷酸含有与第一种多核苷酸享有序列一致性的重组区和与第三种多核苷酸享有序列一致性的重组区，而第三种多核苷酸含有与所述第二种多核苷酸享有序列一致性的重组区。重组区是具有足以在哺乳动物细胞(如ES细胞)，优选还在非哺乳动物真核细胞(如糖酵母属和其它酵母或真菌细胞)中产生体内同源重组的必需的序列一致性区。通常，重组区通常为至少50-100000个核苷酸或更长，优选500-10000个核苷酸长，而常常有80-100％一致性，优选95-100％一致性，最好是同基因的。本文讨论的参考文献仅提供了在本申请申请日之前的其公开的内容。本文没有任何内容表明发明人不可以通过在先发明而将所述文献内容的公开日期提前。附图的简要说明图1描述了在未重排基因组DNA和重排免疫球蛋白重链基因表达的mRNA中的互补决定区CDR1、CDR2和CDR3和框架区FR1、FR2、FR3和FR4。图2描述了人λ链座位；图3描述了人κ链座位；图4描述了人重链座位，图5描述了含有重排的IgM基因的转基因构建体，所述IgM基因依次与含有人γ3和γ1恒定区的25kb片段、含大鼠链3’增强子序列的700bp片段相连，图6是人κ链座位的限制图谱，描述了通过体内同源重组，用于形成轻链转基因的片段。图7描述了pGP1的构建。图8描述了pGP1中所含多接头的构建。图9描述了用于构建本发明人重链转基因的片段。图10描述了pHIG1和pCON1的构建。图11描述了插入到pRE3(大鼠3’增强子)以形成pREG2的人Cγ1片段。图12描述了pHIG’和pCON的构建。图13描述了含人D区片段的片段，所述D区片段用于构建本发明的转基因。图14描述了pHIG2(含D片段的质粒)的构建。图15描述了用于构建本发明的转基因的跨人Jκ和人Cκ基因的片段。图16描述了pEμ的构建。图17描述了pKapH的构建。图18A-18D描述了阳性-阴性选择载体的构建，该载体用于功能性破坏小鼠内源重链免疫球蛋白座位。图19A-19C描述了阳性-阴性选择载体的构建，该载体用于功能性破坏小鼠内源轻链免疫球蛋白座位。图20A-20E描述了以小鼠κ轻链为靶的载体的结构。图21A-21F描述了以小鼠重链为靶的载体的结构。图22描述了载体pGPe的图谱。图23描述了载体pJM2的结构。图24描述了载体pCOR1的结构。图25描述了用于pIGM1、pHIC1和pHIC2的转基因构建体。图26描述了pγe2的结构。图27描述了pVGE1的结构。图28描述了在pHIC1转基因小鼠中人Ig表达的检测结果。图29描述了pJCK1的结构。图30描述了人工合成的重链可变区的构建。图31是重链小座位构建体pIGM1、pHC1和pHC2的示意图。图32是重链小座位构建体pIGG1和κ轻链小座位构建体pKC1、pKVe1和pKC2的示意图。图33描述了重建功能重排的轻链基因的示意图。图34描述了血清ELISA结果。图35描述了8只转基因小鼠血清的ELISA检测结果。图36是质粒pBCE1的示意图。图37A-37C描述了本发明转基因小鼠对KLH-DNP的免疫反应，这是通过测量KLH-DNP(37A)、KLH(37B)和BSA-DNP(37C)特异性的IgG和IgM水平得到的。图38是ELISA数据，说明存在结合人癌胚抗原(CEA)并含有人μ链的抗体；每个图均表示出免疫接种后表明的天数时，小鼠血清样品的系列稀释倍数。图40表示与种系转基因序列(上线)相比，从mRNA产生的23个随机选择cDNA的排列的可变区序列，所述mRNA是从用人癌胚抗原(CEA)免疫接种的HC1转基因小鼠的淋巴样组织中获得的；在每一行上表明了相对于种系序列的核苷酸变化。表明了对应于重链CDR1、CDR2和CDR3的区。用大写字母表示非种系编码的核苷酸。图41表示称为vk65.3的人DNA片段的核苷酸序列，该片段含有Vκ基因片段；还表示了Vκ编码区推测的氨基酸序列；用方框表示剪接和重组信号序列(七聚体/九聚体)。图42表示称为vk65.5人DNA片段的核苷酸序列，该片段含有Vκ基因片段；还表示了由Vκ编码区推测的氨基酸序列；用方框表示剪接和重组信号序列(七聚体/九聚体)。图43表示称为vk65.8人DNA片段的核苷酸序列，该片段含有Vκ基因片段；还表示了由Vκ编码区推测的氨基酸序列；用方框表示剪接和重组信号序列(七聚体/九聚体)。图44表示称为vk65.15人DNA片段的核苷酸序列，该片段含有Vκ基因片段；还表示了由Vκ编码区推测的氨基酸序列；用方框表示剪接和重组信号序列(七聚体/九聚体)。图45表示通过共注射的两个重叠片段之间的同源重组形成轻链小座位。图46表示与CEA和非CEA抗原有反应性的单克隆抗体的ELISA结果，说明抗原结合的特异性。图47表示通过PCR扩增的10个cDNA的DNA序列以扩增含有人VDJ和鼠恒定区序列的转录物。图48表示小鼠不同稀释度血清的ELISA结果，所述小鼠携带了人重链小座位转基因和人κ小座位转基因；用人CD4免疫接种小鼠，所列的数据说明与人CD4有反应性并分别含有人κ、人μ或人γ表位的抗体。图49表示由FACS确定人μ或小鼠μ的淋巴细胞染色的相对分布情况，以说明三种小鼠的基因型。图50表示由FACS确定人κ或小鼠κ的淋巴细胞染色的相对分布情况，以说明三种小鼠的基因型。图51表示由FACS确定小鼠λ的淋巴细胞染色的相对分布情况，以说明三种小鼠的基因型。图52表示由FACS确定小鼠λ或人κ的淋巴细胞染色的相对分布情况，以说明四种小鼠的基因型。图53表示在未免疫接种的0011小鼠血清中，人μ、人γ、人κ、小鼠μ、小鼠γ、小鼠κ和小鼠λ链的量。图54表示不同基因型的非免疫0011小鼠血清中，说明人μ、人γ、人κ、小鼠μ、小鼠γ、小鼠κ和小鼠λ链的量的散点图。图55表示在用人CD4免疫接种0011小鼠后3星期或7星期所取的血清中，在抗CD4抗体中，含人μ、人γ或人κ链之抗体的滴度。图56是人重链小座位转基因pHC1和pHC2，以及轻链小座位转基因pKC1pKC1e，和在所示出的位点通过pKC2和Co4之间的同源重组而得到的轻链小座位转基因的示意图。图57表示摘自Storb等(1989)的书中的鼠λ轻链座位谱系图；条框表示假基因。图58是以同源基因为靶，使鼠λ座位失活的示意图。图59图示说明用于缺失基因，如重链恒定区基因的同源重组靶转基因的结构。图60是从ImmunoglobulinGenes，Honjo，T，Alt，FWandRabbitsTH(eds)AcademicPress，NY(1989)p.129得到的BALB/c鼠重链座位图谱。在顶线中用封闭的框表示结构基因；第二和第三条线表示用符号表明的限制位点。图61表示小鼠重链α座位恒定区基因的核苷酸序列。图62表示移码载体(质粒B)的构建，该载体用于将2个bp的移码导入到鼠重链座位J4基因中。图63表示在超免疫过程中，转基因动物的同种型特异性反应。用比色ELISA测定值表示反应性人μ和γ1的相对水平(Y轴)。在纯合JHD背景下，通过腹膜内注射弗氏佐剂中的CEA，我们免疫接种了7-10周龄的雄性HC157品系的转基因动物(#1991，#2356，#2357)。该图描述了稀释250倍的采集血清(在各次注射前收集的)与CEA包被的微滴定孔的结合情况。图64A和64B说明通过型转换重组介导的转基因编码的γ1的同种型的表达。在表达两种不同人γ1的杂交瘤中，整合的转基因的结构与μ和γ1转换区之间的重组一致。图64A表示从三个表达转基因的杂交瘤中分离的PacI/SfiI消化之DNA的Southern印迹。从左到右克隆92-09A-5H1-5，人γ1+/μ-；克隆92-90A-4G2-2，人γ1+/μ-；克隆92-09A-4F7-A5-2，人γ1-，μ+。所有3个杂交瘤均衍生于对于HC1-57整合是半合子的、对于JHD破坏是纯合的7月龄雄性小鼠(小鼠#1991)。将印迹与衍生自含有人γ1的转换区3’那一半的2.3kbBglII/SfiIDNA片段的探针杂交。在表达μ的杂交瘤中未发现转换产物，而在表达γ1的两个杂交瘤92-09A-5H1-5和92-9A-4G2-2中，含有分别得自5.1和5.3kb的PacI/SfiI片段的转换产物。图64B是两种可能的缺失机制示意图，通过该机制可发生从μ到γ1的型转换。在人μ基因的两侧翼为可进行重组以缺失μ的400bp同向重复片段(σμ和∑μ)。由该机制进行的型转换总是产生6.4kbPacI/SfiI片段，而通过μ和γ1转换区之间的重组而发生的型转换则产生4-7kb的PacI/SfiI片段，在每次转换中，片段大小会发生变化。在图64A中检测的表达γ1的两个杂交瘤似乎已经在μ和γ1转换区之间进行了重组。图65表示通过反式转换产生的嵌合人/小鼠免疫球蛋白重链。反式转换产物的cDNA克隆通过反转录和PCR扩增脾和淋巴结RNA的混合物产生，所述RNA混合物从超免疫的HC1转基因-JHD小鼠(#2357，参见图63关于动物和免疫方案的说明中的图标)分离得到。给出了10种随机捡出的克隆的部分核苷酸序列。小写字母表示种系编码的，大写字母表示不能定为已知种系序列的核苷酸；这些可能是体细胞突变、N核苷酸或截短的D片段。两种都表示是小鼠γ序列。图66A和66B表示超免疫小鼠中的重排VH251转基因发生体细胞突变。IgG重链可变区cDNA的部分核苷酸序列克隆自对抗原展示出一级反应(图64A和对抗原展示出二级反应(图64B)的CH1系26小鼠。在该图的顶部列出了种系序列；给出了各克隆种系的核苷酸变化。A区表示与种系序列的一致性，大写字母表示未鉴定的种系源。将序列按照J片段的用法分组。列出了各J片段的种系序列。CDR3序列内的小写字母表示与HC1转基因中所含已知D片段的一致性。在各序列的末端列出了指定的D片段。未指定的序列可能衍生于N区添加或体细胞突变；或在某些情况下，它们很短以致不能从已知的D片段中区分出随机N核苷酸。图66A一级反应13个随机捡出的VH251-γ1cDNA克隆。给4周龄的雌性HC1系26-JHD小鼠(#2599)注射一次KLH和完全弗氏佐剂；5天后分离脾细胞RNA。在V片段内体细胞突变的总频率为0.06％(2/3198bp)。图66B二级反应13个随机捡出的VH251-γ1cDNA克隆。给2月龄的雌性HC1系26-JHD小鼠(#3204)在一个月内注射3次KLH和弗氏佐剂(第一次注射完全弗氏佐剂，在1周和3周后，用不完全弗氏佐剂加强注射)；4个月后分离脾细胞和淋巴结。在V片段内体细胞突变的总频率为1.6％(52/3198bp)。图67A和67B表示限于γ1序列的广泛的体细胞突变体细胞突变和类型转换发生在B细胞的相同种群中。从超免疫的抗CEA(参见图63的免疫过程)的HC1系57转基因-JHD小鼠(#2357)的脾和淋巴结细胞中分离VH251cDNA克隆的部分核苷酸序列。图67AIgM23个随机捡出的VH251-μcDNA克隆。156bp的核苷酸序列包含CDR1和2的周围残基。体细胞突变的总水平为0.1％(5/3744bp)。图67BIgG23个随机捡出的VH251-γ1cDNA克隆。核苷酸序列包含CDR1-3和周围残基。V片段内体细胞突变的总频率为1.1％(65/5658bp)。与图67A中的μ序列进行比较前156个核苷酸的突变频率为1.1％(41/3588bp)。参见图66A和66B的解释符号的标注。图68表示VH51P1和VH56P1在未免疫小鼠中显示有广泛的体细胞突变。IgG重链可变区cDNA的部分核苷酸序列克隆自9周龄、未免疫雌性HC2系2550转基因-JHD小鼠(#5250)。在19个VH56P1片段内体细胞突变的总频率为2.2％(101/4674bp)。在单个VH51P1片段内体细胞突变的总频率为2.0％(5/246bp)。图示参见图66A和66B的解释符号的标注。图69表示带有内源Ig座位被破坏了的双转基因小鼠含有人IgMκ阳性B细胞。从4个不同基因型的小鼠脾中分离细胞的FACS。左边对照小鼠(#9944，6周龄雌性JH+/-，JCκ+/-；杂合野生型小鼠重和κ轻链座位，非转基因的)。第二列人重链转基因(#9877，6周龄雌性JH-/-，JCκ-/-，HC2系2550+；被破坏的小鼠重和κ轻链座位纯合，半合子的HC2转基因)。第三列人κ轻链转基因(#9878，6周龄雌性JH-/-，JCκ-/-，KCo4系4437+；被破坏的小鼠重和κ轻链座位纯合，半合子的KCo4转基因)。右列双转基因(#9879，6周龄雌性JH-/-m，JCκ-/-，HC2系2550+，被破坏的小鼠重链和κ轻链座位纯合；KCo4系4437+；半合子的HC2和KCo4转基因)。顶行表达小鼠λ轻链(x-轴)和人κ轻链(y-轴)的染色的脾细胞。第二行表达人μ重链(x-轴)和人κ轻链(y-轴)的染色的脾细胞。第三行表达小鼠μ重链(x-轴)和人κ轻链(y-轴)的染色的脾细胞。底行表达小鼠B220抗原的染色的脾细胞的直方图(对数荧光x-轴；细胞数y-轴)。对于两个颜色组的各图，所示四个象限中的相对细胞数量基于碘化丙锭(propidium)染色和光散色给出的相对于e参数通经的百分数。在底行所示的各样品中的B220+细胞馏分以淋巴细胞光散色栅的百分数给出。图70表示在双转基因小鼠血清中分泌的免疫球蛋白水平。来自18个HC2/KCo4双转基因小鼠的人μ、γ和κ以及小鼠γ和λ，所述小鼠是内源重链和κ-轻链座位破坏纯合的。小鼠(+)HC2系2550(每次整合～5个HC2拷贝)，KCo4系4436(每次整合1-2个KCo4拷贝)；(○)HC2系2550，KCo4系4437(每次整合～10个KCo4拷贝)；(×)HC2系2550，KCo4系4583(每次整合～5个KCo4拷贝)；(□)HC2系2572(每次整合30-50个HC2拷贝)，KCo4系4437；(Δ)HC2系5467(每次整合20-30个HC2拷贝)，KCo4系4437。图71A和71B表示对人抗原的人抗体反应。图71A对重组可溶CD4的一级反应。报道了4只双转基因小鼠在取血前(○)和免疫后(·)血清中人IgM和人κ轻链的水平。图71B体内转换成IgG。为了抑制非特异性交叉反应，在存在1.5μ/ml过量IgE、κ和1％正常小鼠血清条件下，用与过氧化物酶结合的多克隆抗人IgG检测人IgG(圈)。在存在1％正常小鼠血清条件下，用与过氧化物酶结合的多克隆抗人κ试剂检测人κ轻链(方块)。列出了一个小鼠(#9344；HC2系2550，KCo4系4436)的代表性结果。各点代表两个孔减背景吸收值的的平均值。图72表示用杂交瘤上清液进行人PBL的FACS分析，将人CD4+淋巴细胞和人CD8+淋巴细胞区分开来。图73表示在转基因小鼠血清中的人α-CD4IgM和IgG。图74表示竞争结合试验，以比较转基因小鼠α-人CD4杂交瘤单克隆、2C11-8与RPA-TA和Leu-3A单克隆。图75表示培养的2C11-8杂交瘤的Ig表达的生产数据。图76表示构成Hco7转基因的重叠的质粒插入片段组。图77A描述了pGP2b质粒载体的核苷酸序列和限制图谱。图77B描述了pGP2b质粒载体的限制图谱。图78(A和B)描述了组装大转基因的克隆策略。图79表示大插入片段在高拷贝的pUC衍生的质粒中是不稳定的。图80表示噬菌体P1克隆P1-570。插入片段覆盖包含γ3和γ1的人重链恒定区部分以及转换元件。N，NotI；S，SalI；X，XhoI。图81表示在HCo7转基因动物中，人μ和γ1的血清表达。图82表示在HCo7/Kco4双转基因/双缺失小鼠中，人免疫球蛋白的血清表达。图83表示在HCo7转基因小鼠脾RNA中，人γ1和γ3转录物的RTPCR检测。图84表示用LPS和IL-4体外诱导人IgG1和IgG3。图85表示浓缩YACDNA浓度的琼脂糖凝胶电泳装置。图86表示来自HC2/KCo5/JHD/JKD和HC2/KCo4/JHD/JKD小鼠的骨髓细胞的双色FACS分析。以百分数给出了B220+/CD43-、B220+/CD43+和B220+IgM+栅的细胞馏分中的细胞数。图87表示来自HC2/KCo5/JHD/JKD和HC2/KCo4/JHD/JKD小鼠的脾细胞的双色FACS分析。以百分数给出了在各B220亮/IgM+和B220暗/IgM+栅的细胞馏分的细胞数。图88IgGκ抗-nCD4单克隆抗体与CD4+SupT1细胞的结合。图89通过流式细胞计数对IgG抗-CD4单克隆抗体的表位测定。SupT1细胞与缓冲液(左列)、2.5mg/mlRPA-T4(中列)、或2.5mg/mlLeu3a(右列)预保温，然后再与10种人IgG单克隆抗体(用上清液1∶2稀释的)之一，或嵌合Leu3a预保温。在该图中表明了3种人IgG单克隆抗体的结果。图90用人IgGk抗-CD4单克隆抗体抑制MLR。表1描述载体pGPe的序列。表2描述基因VH49.8的序列。表3描述在本发明转基因小鼠血清中人IgM和IgG的检测结果。表4描述VDJ连接的序列。表5描述了掺入到编码转录物的、pHC1转基因中的J片段在成人外周血淋巴细胞(PBL)的J片段中的分布。表6描述了掺入到编码转录物的、pHC1转基因中的D片段在成人外周血淋巴细胞(PBL)的D片段中的分布。表7描述了在pHC1转基因小鼠和人PBL中，来自框架区VDJ连接的转录物的CDR3肽的长度。表8描述了在30个被分析的pHC1转基因克隆中，VDJ区的推测氨基酸序列。表9列出了在所说明的试验中，所用品系112的转基因小鼠；(+)表示存在相应的转基因，(++)表示动物对VHD失效转基因是纯合的。表10表示数个0011小鼠的基因型。表11表示人可变区用于转基因小鼠的杂交瘤。表12表示转基因V和J片段的使用。表13表示在转基因小鼠的HC2重链转基因中，体细胞突变的发生率。表14表示在YAC4×17E1上鉴定人Vκ片段。表15列出了在小鼠品系KCo5-9272中表达的人Vγ基因的鉴定。表16列出了IgGκ抗-nCD4单克隆抗体的分泌水平。表17列出了与人CD4结合的单克隆抗体的速率和亲合力常数。表18列出了人抗-人CD4单克隆抗体的亲合力和速率常数。表19列出了人抗-人CD4单克隆抗体的亲合力和速率常数。表20报道了抗-CD4单克隆抗体的亲合力和速率常数。表21列出了用流式细胞计数确定的人抗-人CD4单克隆抗体的亲合力常数。表22列出了功能转录物的部分核苷酸序列。表23列出了在杂交瘤转录物中种系V(D)J片段的使用。表24描述了在小基因构建中所用的引物、载体和产物。表25描述了人mAb对猩猩外周淋巴细胞的影响。发明详述如上文所讨论的，需要生产与特异性人抗原有反应性的人免疫球蛋白，所述抗原是有前途的治疗和/或诊断靶。但生产与人抗原特异性结合的人免疫球蛋白还有许多问题。首先，作为B细胞源的被免疫的动物必须对提呈的抗原产生免疫反应。为了使动物产生免疫反应，提呈的抗原必须是外源的，而且所述动物对所述抗原不耐受。因此例如，如果需要生产与人蛋白质结合的、具有个体型的单克隆抗体，自身耐受性会使被免疫的人不会对人蛋白质产生实质性的免疫反应，因为可致免疫的抗原表位仅是起因于人群中的蛋白质多态性的表位(同种异型表位)。第二，如果作为形成杂交瘤的B细胞源的动物(以人为例)对真正的自身抗原产生免疫反应，在动物中将产生严重的自身免疫疾病。若人作为杂交瘤的B细胞源，根据目前的标准，认为所述自身免疫是不道德的。因此，开发分泌与预定人抗原有特异性反应之人免疫球蛋白的杂交瘤存在许多问题，因为需要可靠的分泌人抗体的B细胞源，所述B细胞会引发抗预定抗原的抗体反应。可用于得到与人抗原有特异性反应的人抗体的一种方法是，生产带有本发明人免疫球蛋白转基因构建体的转基因小鼠。总之，将含全部或部分人免疫球蛋白重链和轻链座位的转基因，或含合成“小座位”的转基因(下文描述的，在未决申请U.S.S.N.08/352322，1994年12月7日申请；U.S.S.N.07/990860，1992年12月16日申请；U.S.S.N.07/810279，1991年12月17日申请；U.S.S.N.07/904068，1992年6月23日申请；U.S.S.N.07/853408，1992年3月18日申请；U.S.S.N.07/574748，1990年8月29日申请；U.S.S.N.07/575962，1990年8月31日申请，以及PCT/US91/06185，1991年8月28日申请，以上文献均引入本文作为参考)用于生产转基因非人动物，所述转基因均含有人重链和轻链座位必需的功能元件。所述转基因非人动物有能力生产由人免疫球蛋白基因编码的免疫球蛋白链，此外并能对人抗原产生免疫反应。因此，所述转基因动物可作为与特定人抗原具有反应性的免疫血清源，可将来自所述转基因动物的B细胞与骨髓瘤细胞融合以产生分泌由人免疫球蛋白基因编码的、并与人抗原有特异性反应的单克隆抗体的杂交瘤。此前已经报道了含各种免疫球蛋白基因的转基因小鼠的制备。已经用重排的小鼠免疫球蛋白重链或轻链基因生产转基因小鼠。此外，在转基因小鼠中已经表达了含μ或γ1恒定区的功能重排的人Ig基因。但其中含未重排的(V-D-J或V-J未重排)免疫球蛋白基因的转基因的试验是不稳定的，在某些情况下，产生出不完整或很小的重排转基因。但没有公开的实例说明重排或未重排的免疫球蛋白转基因在转基因内的CH基因之间进行了成功地同种型转换。本发明还提供了鉴定候选杂交瘤的方法，所述杂交瘤分泌含人免疫球蛋白链的单克隆抗体，所述免疫球蛋白链主要是由与人恒定区序列相连的多肽中的人VDJ序列组成。从含有下列杂交瘤的杂交瘤克隆池中鉴定所述候选杂交瘤(1)表达主要由人VDJ区和人恒定区组成的免疫球蛋白链的杂交瘤克隆，和(2)表达主要由人VDJ区和鼠恒定区组成的异种杂种免疫球蛋白链的反式转换的杂交瘤。在筛选与预定抗原具有结合特异性之抗体的结合条件下，将各个或合并的杂交瘤克隆上清液与预定的抗原接触，通常是与通过吸附到固体基质(如微滴定孔)上而固定的抗原接触。还将与人恒定区特异性结合的抗体与杂交瘤上清液和预定抗原在结合条件下接触，以便所述抗体选择性地与至少一种人恒定区表位结合，并基本上不与鼠恒定区表位结合；因此形成复合物，所述复合物主要由与预定抗原结合的杂交瘤上清液(转基因单克隆抗体)和与人恒定区特异性结合的抗体(并可用可检测标记或报告基团标记)组成。所述复合物的形成表明杂交瘤克隆或克隆池表达人免疫球蛋白链。在本发明优选的实施方案中，在筛选中所用的抗人恒定区免疫球蛋白特异性地识别非μ、非δ同种型，优选α或ε，更优选γ同种型恒定区。γ同种型的单克隆抗体是优选的(i)因为对于一些治疗应用而言，IgG免疫球蛋白的特征比IgM免疫球蛋白的更好(例如由于IgG二聚体比IgM五聚体小些)和(ii)因为体细胞突变的过程与从μ恒定区向非μ(如γ)恒定区的型转换有关。从已经进行了型转换的免疫球蛋白种群中选出的免疫球蛋白(如IgG)与抗原的亲和力，高于从未经型转换的种群中选出的免疫球蛋白(如IgM)与抗原的亲合力。参见例如LonbergandHuszar.Intern.Rev.Immunol.1365-93(199)，该文献引入本文作为参考。在一个实施方案中，首先就γ同种型恒定区来筛选候选杂交瘤，然后就与预定抗原的特异性结合来筛选表达IgG的杂交瘤群。因此根据本发明方法，将本发明的转基因小鼠用预定的抗原免疫以诱导免疫反应。从所述小鼠中收集B细胞，然后将所述B细胞与无限增殖细胞融合以产生杂交瘤。首先筛选杂交瘤以鉴定分泌非μ、非δ同种型Ig(如IgG)的杂交瘤。然后对针对与所需预定抗原的特异性结合该组杂交瘤进行筛选。用如HarlowandLane，抗体实验室手册，冷泉港，纽约(1988)中所述的标准技术完成筛选。利用该方法，可以从实践上有效鉴定高亲和力的免疫球蛋白(如Ka大于约107M-1)。定义如本文所用的，术语“抗体”指含有至少两个轻多肽链和两个重多肽链的糖蛋白。每个重和轻多肽链都含有可变区(通常是多肽链的氨基末端部分)，所述可变区含有与抗原可相互作用的结构域。每个重和轻链还含有多肽链的恒定区(通常为羧基部分)，所述恒定区介导免疫球蛋白与宿主组织或因子(包括免疫系统的各种细胞、一些吞噬细胞和常规补体系统的第一组分(C1q))的结合。如本文所用的“异源抗体”是相对于生产所述抗体的转基因非人动物而言的。将其定义为具有在不构成转基因非人动物的生物(通常来自于除转基因非人动物以外的品种)中发现之氨基酸序列或相应DNA序列编码的抗体。如本文所用的，“异种杂种抗体”指含有不同生物源的轻和重链的抗体。例如，具有与鼠轻链相结合的人重链的抗体就是异种杂种抗体。如本文所用的，“同种型”指由重链恒定区基因编码的抗体类型(如IgM或IgG1)。如本文所用的，“同种型转换”指抗体类型或同种型从一种Ig类型转变成另一种Ig类型的现象。如本文所用的，“未转换的同种型”指在未发生同种型转换时生产的重链的同种型类型；编码未转换同种型的CH基因通常是紧接功能重排的VDJ基因下游的第一个CH基因。如本文所用的，术语“转换序列”指引起转换重组的DNA序列。“转换供体”序列，通常是μ转换区，是转换重组过程中待缺失构建体区的5’(即上游)。“转换受体”区则是在待缺失构建体区和取代恒定区之间的区(如γ，ε等)。由于没有总是发生重组的特异性位点，因此通常从构建体无法预测最后的基因序列。如本文所用的，“糖基化方式”是指与蛋白质，更具体地说与免疫球蛋白共价相连的碳水化合物单位的方式。本领域专业人员可认识到与转基因CH基因从中衍生的品种相比，在异源抗体的糖基化方式与非人转基因动物中的所述糖基化方式更相似时，可将异源抗体的糖基化方式表征为与天然发生的非人转基因动物品种产生之抗体的糖基化方式基本相似。如本文所用的，“特异性结合”指下列抗体特征(1)与预定抗原结合的亲和力至少为1×107M-1，和(2)以比其与除预定抗原或极为相关抗原以外的非特异性抗原(如BSA、酪蛋白)结合的亲和力至少高2倍的亲和力，优先与预定抗原结合。本文中用于形容某对象的术语“天然产生的”是指该对象可以在自然界中发现。例如，在生物(包括病毒)中存在的并从天然来源分离的以及未经实验室人们故意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然产生的。本文所用的术语“重排(的)”指重链或轻链免疫球蛋白座位的构型，其中在分别主要编码完整VH或VL结构域的结构中，V片段与D-J或J片段紧密相连。可通过与种系DNA进行比较来鉴定重排的免疫球蛋白基因座位；重排的座位至少是一个重组的七/九聚体同源元件。本文所用的与V片段有关的“未重排(的)”或“种系构型”指其中V片段不进行重组以便紧邻D或J片段的一种构型。对于核酸而言，术语“基本同源”指在进行最佳排列和比较时，两个核酸或指定的序列至少约80％的核苷酸，通常至少约90％-95％，最佳至少约98-99.5％的核苷酸是相同的，所述核酸含有适宜的核苷酸插入或缺失。或者，在选择性杂交的条件下，当片段与互补链杂交时，则表示基本同源。核酸可存在于完整细胞、细胞溶解产物中或是以部分纯化的或基本上纯的形式存在。当通过标准技术包括碱/SDS处理、CsCl分带、柱色谱、琼脂糖凝胶电泳和本领域熟知的其他技术，纯化掉其他细胞组分或其他污染物如其他细胞核酸或蛋白质后，则核酸是“分离的”或“基本上纯的”。参见F.Ausubel，etal.，ed.CurrentProtocolsinMolecularBiology，GreenePublishingandWiley-Interscience，NewYork(1987)。尽管常常是天然序列(除修饰的限制位点等外)，可按照标准技术将来自cDNA、基因组DNA或其混合物的本发明核酸进行突变以提供基因序列。对于编码序列，这些突变可按需要改变氨基酸序列。具体地说，提供了与天然V、D、J、恒定区、转换区和本文所述的其他序列基本上同源或自这些序列衍生的DNA序列(其中“衍生”指序列是与另一序列相同的或从另一序列修饰得到的)。核酸是“可操作相连的”指与另一核酸序列的功能关系。例如，如果要使启动子或增强子影响序列的转录，则需将其与编码序列可操作相连。就转录调节序列而言，若需连接两个蛋白质的编码区，可操作相连指被连接的DNA序列是相邻的，而且必要的时候使两个蛋白质的编码区相邻连接在解读框架中。对于转换序列，可操作相连指序列能够影响转换重组。能够生产异源抗体的转基因非人动物以异源抗体库应答外源抗原刺激的转基因非人动物的设计要求在转基因动物中所含的异源免疫球蛋白转基因在B细胞发育的整个过程中均能正确地发挥其功能。在优选的实施方案中，异源重链转基因的正确功能包括同种型转换。因此，构建本发明的转基因以便产生同种型转换以及实现下列一种或多种功能(1)高水平和细胞类型特异性的表达，(2)功能基因重排，(3)激活并应答等位排斥，(4)表达足够的一级抗体，(5)信号传导，(6)体细胞超突变，和(7)在免疫反应过程中，转基因抗体座位的控制。从下列公开中显而易见的是，并不需要满足前述所有标准。例如，在其中转基因动物的内源免疫球蛋白座位被功能性破坏的那些实施方案中，转基因不需激活等位排斥。此外，在其中转基因含有功能性重排的重和/或轻链免疫球蛋白基因的那些实施方案中，无需功能基因重排的第二种标准，至少对于已经重排的转基因是如此。关于分子免疫学背景，参见FundamentalImmunology，2ndedition(1989)，PaulWilliamE.，ed.，RavenPress，N.Y.，该文献引入本文作为参考。在本发明的一个方面，提供了在转基因动物种系中含重排的、未重排的或重排和未重排组合的异源免疫球蛋白重和轻链转基因的转基因非人动物。每个重链转基因至少含有一个CH基因。此外，重链转基因可含有功能同种型转换序列，该序列能够支持编码多个CH基因的异源转基因在转基因动物的B细胞中进行同种型转换。所述转换序列可以是来自作为转基因CH基因来源之品种的种系免疫球蛋白座位中天然的转换序列，或所述转换序列可衍生于接受转基因构建体的品种(转基因动物)中的转换序列。例如，如果人转基因构建体含有类似于天然小鼠重链座位中转换序列的转换序列，用于产生转基因小鼠的人转基因构建体可发生较高频的同种型转换，可能是由于小鼠转换序列与小鼠转换重组酶系统一起可发挥最佳功能，而人转换序列则不行的缘故。可通过常规克隆方法分离并克隆所述转换序列，或以与免疫球蛋白转换区序列有关的公开的序列资料为基础设计的重叠合成寡核苷酸，重新合成所述转换序列(Millsetal.，Nucl.AcidsRes.187305-7316(1991)；Siderasetal.，Intl.Immunol.，1631-642(1989)，所述文献引入本文作为参考)。对于前述各个转基因动物，在转基因动物的大部分B细胞(至少10％)中发现了功能重排的异源重和轻链。本发明的转基因包含重链转基因，含有编码至少一个可变片段、一个多样性基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。免疫球蛋白轻链转基因含有编码至少一个可变基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA。编码轻和重链基因片段的基因片段与转基因非人动物异源，因为它们衍生于或相应于编码免疫球蛋白重和轻链基因片段的DNA，所述DNA来自转基因非人动物以外的品种。在本发明的一个方面，构建转基因以便各个基因片段是未重排的，即不被重排以便编码有功能的转基因轻或重链。所述未重排的转基因有利于V、D和J基因片段的重组(功能性重排)，并当与抗原接触时，优选有利于将全部或部分D区基因片段掺入到转基因非人动物内所得的重排免疫球蛋白重链中。在另一实施方案中，转基因含有未重排的“小座位”。所述转基因通常含有C、D和J片段的主要部分以及V基因片段的子序列。在所述转基因构建体中，各种调节序列，如启动子、增强子、型转换区、用于RNA加工的剪接-供体和剪接-受体序列、重组信号等，含有衍生于异源DNA的相应序列。可将所述调节序列掺入到转基因中，所述转基因来自与本发明所用非人动物相同的或相关的品种。例如，可将人免疫球蛋白基因片段与啮齿类免疫球蛋白增强子序列组合在转基因中，用于转基因小鼠。或者，可将合成的调节序列掺入到转基因中，其中所述合成调节序列与哺乳动物基因组中已知的天然功能性DNA序列不同源。按照一致的规则如说明剪接-受体位点或启动子/增强子基元之许可序列的规则来设计合成的调节序列。例如，与天然种系的Ig座位相比，小座位含有基因组免疫球蛋白座位的一部分，所述免疫球蛋白座位含有至少一个非必需DNA部分(例如间插序列；内含子或其部分)的中间(即不在该部分末端)缺失。本发明还包括含具有重和轻链转基因之种系细胞的转基因动物，其中所述转基因之一含有重排的基因片段，另一个含有未重排的基因片段。在优选的实施方案中，重排的转基因是轻链免疫球蛋白转基因，而未重排的转基因是重链免疫球蛋白转基因。抗体的结构和产生所有免疫球蛋白的基本结构均是以由两个轻多肽链和两个重多肽链组成的单位为基础。每个轻链均含有称为可变轻链区和恒定轻链区的两个区。同样，免疫球蛋白重链含有称为可变重链区和恒定重链区的两个区。重或轻链的恒定区均由被称为重或轻恒定区基因(CH)片段的基因组序列编码。用特定的重链基因片段定义免疫球蛋白的类型。例如，在人类中，μ恒定区基因片段确定了IgM类型的抗体，而γ、γ2、γ3或γ4恒定区基因片段确定了IgG类型的抗体以及IgG亚型IgG1-IgG4抗体。同样，用α1或α2恒定区基因片段确定了IgA类型的抗体以及亚型IgA1和IgA2抗体。δ和ε恒定区基因片段分别确定了IgD和IgE抗体类型。重和轻免疫球蛋白链的可变区都含有抗体的抗原结合结构域。因为需要抗体在该区具有多样性以结合各种抗原，所以编码起始或一级可变区的DNA含有许多不同的DNA片段，所述DNA片段衍生于特定可变区基因片段的家族。在轻链可变区的情况下，所述家族含有可变(V)基因片段和连接(J)基因片段。因此，轻链的起始可变区由一个V基因片段和一个J基因片段编码，所述V基因片段和J基因片段分别选自生物基因组DNA中所含的V和J基因片段家族。在重链可变区的情况下，编码重链的起始或一级可变区的DNA含有一个重链V基因片段、一个重链多样性(D)基因片段和一个J基因片段，每个片段分别选自基因组DNA中免疫球蛋白基因片段的V、D和J家族。为了增加有助于形成抗体结合位点的序列多样性，优选重链转基因包括有利于V-D-J功能重排的顺式作用序列，在所述重排过程中，可将全部或部分D区基因序列掺入到重排的V-D-J基因序列中。通常至少约1％表达的由转基因-编码的重链(或mRNA)在V区中包含可识别的D区序列。优选，至少约10％转基因-编码的V区包含可识别的D区序列，更优选至少约30％，且最优选50％以上包含可识别的D区序列。可识别的D区序列通常是对应于重链转基因D区基因片段中的序列的至少约8个的连续的核苷酸和/或由所述D区核苷酸序列编码的氨基酸序列。例如，如果转基因包含D区基因DHQ52，则含有位于V基因片段和J基因片段之间的V区内之序列5’-TAACTGGG-3’的转基因-编码的mRNA就可识别为含D区序列，具体地说为DHQ52序列。同样，例如如果转基因包含D区基因DHQ52，则含有位于V基因片段氨基酸序列与J基因片段氨基酸序列之间的V区内的氨基酸序列-DAF-的转基因-编码的重链多肽就可识别为含D区序列，具体地说是DHQ52序列。但，由于可将D区片段以不同程度掺入到VDJ连接和各解读框架中，所以就需要将重链可变区的D区与转基因中的D区片段进行比较以确定掺入的特定D片段。此外，重组过程中，可能的外切核酸酶消化也会在V-D-J重组过程中产生不精确的V-D和D-J连接。但由于体细胞突变和N区添加，有些D区序列也是可识别的，但可能不会等同于转基因中的连续的D区序列。例如，可将核苷酸序列5’-CTAAXTGGGG-3’(其中X是A、T或G，而且位于重链V区，两侧翼为V区基因序列和J区基因序列)识别为对应于DHQ52序列5’-CTAACTGGG-3’。同样，例如可将位于V区内的多肽序列-DAFDI-、-DYFDY-或-GAFDI-(这些序列在氨基末端一侧翼为由转基因V基因序列编码的氨基酸序列，在羧基末端一侧翼为由转基因J基因序列编码的氨基酸序列)识别为D区序列。因此，由于体细胞突变和N区添加可在衍生于转基因D区的序列中产生突变，所以用下列定义作为确定是否存在可识别D区序列的标准。氨基酸序列或核苷酸序列可识别为D区序列如果(1)该序列位于V区内，而且其两侧翼一侧翼为V基因序列(核苷酸序列或推测的氨基酸序列)，另一侧翼为J基因序列(核苷酸序列或推测的氨基酸序列)和(2)该序列基本上相同或相似于已知的D基因序列(核苷酸序列或编码的氨基酸序列)。本文所用术语“基本相同”指多肽序列或核酸序列的特征，其中多肽序列与参考序列有至少50％的一致性，常常有至少约80％的序列一致性，有时有约90％以上的序列一致性，而核酸序列与参考序列有至少70％的序列一致性。除去总共占不到参考序列35％的小缺失或增加，计算出该序列一致性的百分数。参考序列可以是较大序列如整个D基因的子序列；但如果是多核苷酸，参考序列至少应有8个核苷酸长，如果是多肽，至少应有3个氨基酸长。通常，参考序列至少是8-12个核苷酸或至少3-4个氨基酸，优选参考序列是12-15个核苷酸或更多，或至少5个氨基酸。术语“基本相似”指多肽序列的特征，其中多肽序列与参考序列有至少80％的相似性。通过记录相同氨基酸或位置保守的相似氨基酸取代来计算序列相似性百分比。位置保守的氨基酸取代是由单个核苷酸取代产生的；第一个氨基酸由第二个氨基酸取代，其中第一个氨基酸的密码子与第二个氨基酸的密码子只因一个核苷酸取代而不同。因此，例如序列-Lys-Glu-Arg-Val-与序列-Asn-Asp-Ser-Val-基本相似，因为通过只导入3个取代突变，在4个源密码子中的3个进行单个核苷酸取代，就可将序列-AAA-GAA-AGA-GUU-突变成-AAC-GAC-AGC-GUU-。参考序列可以是较大序列如整个D基因的子序列；但参考序列至少有4个氨基酸长。通常，参考序列至少有5个氨基酸，优选参考序列有6个氨基酸长或更多。初级库产生编码重和轻链免疫球蛋白基因DNA的过程主要发生在正在发育的B细胞中。在连接各免疫球蛋白基因片段前，在初级B细胞的前体中，发现大部分V、D、J和恒定(C)基因片段是V、D、J和C基因片段簇。通常重或轻链的所有基因片段位于一个染色体上相当接近的位置上。在各免疫球蛋白基因片段重组前，将所述基因组DNA称为“未重排的”基因组DNA。在B细胞分化的过程中，V、D、J(或在轻链基因的情况下只有V和J)的适宜的家族成员之一进行重组以形成功能重排的重和轻免疫球蛋白基因。所述功能重排是可变区片段重排，以便形成编码有功能可变区的DNA。该基因片段重排过程似乎是按序进行的。首先，产生重链D到J连接，然后产生重链V到DJ连接和轻链V到J连接。将编码轻和/或重链中有功能可变区的该起始形式的DNA称为“功能重排的DNA”或“重排的DNA”。在重链的情况下，将所述DNA称为“重排的重链DNA”，在轻链的情况下，将所述DNA称为“重排的轻链DNA”。用相似的语言来描述本发明转基因的功能重排。形成功能性重和轻链可变区的可变区基因片段的重组是由重组信号序列(RSS)介导的，该序列位于可发生重组的V、D和J片段侧翼。必需并足以进行同向重组的RSS含有一对称的七聚体、一个AT富集的九聚体和一个12或23个碱基对的间插序列区。在不同的座位和进行D-J(或V-J)重组的品种中，这些信号是保守的并且是功能上可交换的。参见Oettinger，etal.，(1990)，科学，248,1517-1523及其中引述的参考文献。七聚体含有序列CACAGTG或其类似物，其后是一不保守的序列的间隔区，接下来的九聚体含有序列ACAAAAACC和其类似物。这些序列是在J或V和D基因片段的下游发现的。紧接着种系D和J片段之前，又是两个重组信号序列，第一个是九聚体，然后是七聚体，两者由一非保守序列隔开。在VL、VH或D片段后的七聚体和九聚体序列与它们将与之重组的JL、D或JH片段前的序列互补。七聚体与九聚体之间的间隔序列有12个碱基对或22-24个碱基对长。除V、D和J片段的重排外，通过轻链V和J片段之间以及重链D和J片段之间的可变重组，也可在初级免疫球蛋白重和轻链中产生多样性。所述可变重组是通过在所述片段的被连接处发生变化而产生的。在轻链中的所述改变通常发生在V基因片段最后的密码子内以及在J片段开始的密码子内。同样的不精确连接也会在D和JH片段之间的重链染色体上发生，并可能延伸长达10个核苷酸。此外，可将不由基因组DNA编码的数个核苷酸插入在D和JH之间以及VH和D基因片段之间。这些核苷酸的添加称为N区多样性。在VJ和/或VDJ重排后，位于重排可变区下游的重排可变区和一个或多个恒定区基因片段的转录，产生一初级RNA转录物，将其适当剪接后，得到编码全长重或轻免疫球蛋白链的mRNA。所述重和轻链包含一个前导信号序列以使免疫球蛋白分泌和/或插入到B细胞的跨膜区。编码该信号序列的DNA被包含在用于形成重或轻免疫球蛋白链可变区之V片段的第一外显子内。适宜的调节序列也存在于所述mRNA中以控制mRNA的翻译，从而产生编码的重和轻免疫球蛋白多肽，在将其彼此适宜连接后，形成抗体分子。可变区基因片段中的所述重排以及所述连接过程中可能发生之可变重组的结果是产生了初级抗体库。通常，已经分化到该阶段的一种B细胞产生单一的初级抗体。在该分化过程中，抑制基因片段功能重排的细胞事件发生，所述基因片段不是功能重排的Ig基因中所含的那些片段。将二倍体B细胞保持所述单特异性的过程称为等位排斥。二级库为应答外源抗原从含有初级库的一组序列表达免疫球蛋白的B细胞克隆是立即可得的，由于简单VJ和VDJ连接所产生的有限的多样性，由所谓初级应答产生的抗体的亲合力相对较低。两种不同类型的B细胞产生这种初始反应形成初级抗体之细胞的前体和产生二级抗体的B细胞的前体(Lintonetal.，细胞，591049-1059(1989))。在应答特定的抗原时第一类B细胞成熟成分泌IgM的浆细胞。另一类B细胞通过进入T细胞依赖的成熟途径而对与抗原的最初接触作出反应。在抗原刺激的B细胞克隆的T细胞依赖性成熟作用中，细胞表面上的抗体结构以两种方式发生改变恒定区转换成非IgM亚型，通过多个的单氨基酸取代而修饰可变区的序列以产生亲合力较高的抗体分子。如前所述，重或轻Ig链的各可变区含有抗原结合结构域。通过氨基酸和核酸测序已经确定，二级反应过程中的体细胞突变可在包含三个互补决定区(CDR1、CDR2和CDR3)的整个V区内均可能发生，所述决定区也称为超变区1、2和3(Kabatetal.，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest(1991)U.S.DepartmentofHealthandHumanServices，Washington，DC，该文献引入本文作为参考)。CDR1和CDR2位于可变基因片段内，而CDR3主要是V和J基因片段或V、D和J基因片段重组的结果。不由CDR1、2或3组成的可变区的那些部分通常称为框架区，FR1、FR2、FR3和FR4。参见图1，在超突变过程中，重排的DNA产生突变以产生具有改变的Ig分子的新克隆。与外源抗原具有较高亲合力的那些克隆通过辅助T细胞选择性地扩增，使表达的抗体亲合力成熟。克隆选择通常会导致在CDR1、2和/或3区内含有新突变的克隆表达。但突变也会在这些区外发生，从而影响抗原结合结构域的特异性和亲合力。能够生产异源抗体的转基因非人动物本发明一个方面的转基因非人动物是通过将本发明的至少一种免疫球蛋白转基因(下文讨论的)导入到非人动物的受精卵或早期胚胎中而产生的。用于本发明的非人动物通常包含能够重排免疫球蛋白基因片段以产生初级抗体反应的任何哺乳动物。所述非人转基因动物包括，例如转基因猪、转基因大鼠、转基因兔、转基因牛以及其它转基因动物品种，特别是本领域已知的哺乳动物。特别优选的非人转基因动物是小鼠和啮齿类的其它成员。但，本发明不限于使用小鼠。反之，能够产生初级和二级抗体反应的任何非人哺乳动物均可使用。所述动物包括非人灵长类如猩猩、牛、绵羊和猪，啮齿类家族的其它成员如大鼠，以及兔和豚鼠。特别优选的动物是小鼠、大鼠、兔和豚鼠，最佳为小鼠。在本发明的一个实施方案中，可将来自人基因组的各种基因片段以未重排的形式用于重和轻链转基因中。在该实施方案中，将所述转基因导入到小鼠中。轻和/或重链转基因的未重排基因片段具有人独特的DNA序列，它们不同于小鼠基因组中的内源免疫球蛋白基因片段。它们在不由B细胞组成的种系和体细胞中很容易以未重排形式检测到，在B细胞中以重排形式很容易被检测到。在本发明的另一实施方案中，转基因包括重排的重和/或轻免疫球蛋白转基因。相应于功能性重排的VDJ或VJ片段的所述转基因的具体片段含有明显区别于小鼠内源免疫球蛋白基因片段的免疫球蛋白DNA序列。与由小鼠B细胞编码的氨基酸序列相比，在DNA序列中的这些差异也反映在由所述人免疫球蛋白转基因编码的氨基酸序列中。因此用抗体可以检测本发明转基因非人动物中的人免疫球蛋白氨基酸序列，所述抗体是对人免疫球蛋白基因片段编码之免疫球蛋白表位特异性的。含来自人或其它品种之未重排转基因的转基因B细胞，可功能性地重排适宜的基因片段以形成功能重排的轻和重链可变区。显而易见的是，由所述重排转基因编码的抗体含有的DNA和/或氨基酸序列与实施本发明所用的非人动物中的正常DNA和/或氨基酸序列是异源的。未重排的转基因如本文所用的，“未重排的免疫球蛋白重链转基因”含有编码至少一个可变基因片段、一个多样性基因片段、一个连接基因片段和一个恒定区基因片段的DNA。所述重链转基因的每个基因片段都衍生于编码免疫球蛋白重链基因片段的DNA，或具有与其相应的序列，所述重链基因片段来自与所述转基因被导入的非人动物不同的种。同样，如本文所用的，“未重排的免疫球蛋白轻链转基因”含有编码至少一个可变基因片段、一个连接基因片段和至少一个恒定区基因片段的DNA，其中所述轻链转基因的各基因片段衍生于编码免疫球蛋白轻链基因片段的DNA，或具有与其相应的序列，所述轻链基因片段来自与所述轻链转基因被导入的非人动物不同的种。本发明该方面的所述重和轻链转基因含有未重排形式的上述基因片段。因此，适宜的重组信号序列(RSS)被置于重链转基因的V、D和J片段之间以及轻链转基因的V和J片段之间。此外，所述转基因还包含适宜的RNA剪接信号以便将恒定区基因片段与VJ或VDJ重排的可变区相连。为了有利于在含有一个以上C区基因片段，如来自人基因组的Cμ和Cγ1的重链转基因内进行同种型转换，将下文解释的“转换区”插入到各恒定区基因片段的上游和可变区基因片段的下游以便在所述恒定区之间进行重组，使得免疫球蛋白发生类型转换，如从IgM转换成IgG。所述重和轻链免疫球蛋白转基因还含有位于可变区基因片段上游的包含启动子区的转录控制序列，它们通常含有TATA基元序列。可近似地将启动子区定义为当与下游序列可操作相连时，可使下游序列进行转录的DNA序列。启动子还需要其它相连的顺式作用序列存在以便产生有效的转录。此外，优选还可包括参与无效(Sterile)转录物转录的其它序列。在公开的文献中可发现参与无效转录物表达的其它序列的实例，所述文献包括Rothmanetal.，Intl.Immunol.2621-627(1990)；Reidetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA86840-844(1989)；Stavnezeretal.，_Proc.Natl.Acad.Sci.USA857704-7708(1988)；andMillsetal.，Nucl.AcidsRes.187305-7316(1991)，各文献均引入本文作为参考。这些序列通常包括紧接转换区上游的至少50bp，优选转换区上游的约至少200bp；更优选转换区上游约至少200-1000bp或更长的序列。适宜的序列在紧接着人Sγ1、Sγ2、Sγ3、Sγ4、Sα1、Sα2和Sε转换区的上游；优选紧接人Sγ1和Sγ3转换区上游的序列，其中Sγ1最为优选。另外，或者结合鼠Ig转换序列一起使用；一般最好使用与转基因非人动物相同种的Ig转换序列。此外，在紧邻转基因转换序列的上游优选包含干扰素(IFN)可诱导转录调节元件如IFN-可诱导增强子。除启动子外，可使用主要在B谱系细胞中发挥功能的其它调节序列。因此，例如采用优选位于轻链转基因的J和恒定区基因片段之间的轻链增强子序列，来增强转基因的表达，由此有利于等位排斥。在重链转基因的情况下，也使用调节增强子。用所述调节序列使转基因的转录和翻译达到最大程度以便诱导等位排斥并产生相对高水平的转基因表达。尽管已经对前述启动子和增强子调节控制序列进行了一般性描述，但所述调节序列可以是与非人动物异源的，从所述非人动物的基因组中得到异源转基因免疫球蛋白基因片段。或者，所述调节基因片段衍生于含重和轻转基因的非人动物或很相近品种基因组中的相应调节序列。在优选的实施方案中，基因片段衍生于人类。含所述重和轻转基因的转基因非人动物能够针对施用于该动物之特异性抗原产生Ig-介导的免疫反应。在所述动物体内产生能够生产异源人抗体的B细胞。无限增殖化并针对适宜的单克隆抗体(Mab)进行筛选后，提供了治疗性的人单克隆抗体源，如杂交瘤。当治疗性地施用于人时，所述人Mab具有显著降低的免疫原性。尽管优选的实施方案公开了含人基因片段的重和轻转基因的构建，但本发明不限于此。就此而言，应理解本文所述的教导很容易适用于来自人以外品种的免疫球蛋白基因片段。例如，除用本发明的抗体治疗人外，可将由适宜基因片段编码的治疗抗体用于产生用在兽类中的单克隆抗体。重排的转基因在另一实施方案中，转基因非人动物含有转基因动物种系中的至少一个功能重排的异源重链免疫球蛋白转基因。所述动物含有表达所述重排重链转基因的所有初级B细胞。当与抗原接触后，所述B细胞优选能够发生体细胞突变以形成与抗原具有高亲和力和对抗原具特异性的异源抗体。所述重排的转基因含有至少两个CH基因以及同种型转换所必需的相关序列。本发明还包括含有带重和轻链转基因之种系细胞的转基因动物，其中所述转基因之一含有重排的基因片段，另一个含有未重排的基因片段。在所述动物中，重链转基因应含有至少两个CH基因以及同种型转换所必需的相关序列。本发明还包括生产本发明转基因所用的合成的可变区基因片段库的方法。所述方法包括产生免疫球蛋白V片段DNA的种群，其中每个V片段DNA编码一个免疫球蛋白V片段，并在每个末端含有一个限制核酸内切酶切割识别位点。此后将免疫球蛋白V片段DNA种群串连起来以形成合成的免疫球蛋白V片段群。所述合成的可变区重链转基因应含有至少两个CH基因以及同种型转换所必需的相关序列。同种型转换在B淋巴细胞的发育中，细胞最初生产具有结合特异性的IgM，所述结合特异性是由产生重排的VH和VL区决定的。随后各B细胞和其子代细胞合成具有相同L和H链V区的抗体，但它们可转换H链的同种型。μ和δ恒定区的使用主要是由不同的剪接决定的，这样可以在单一细胞中共表达IgM和IgD。在基因重排缺失了Cμ和Cδ外显子后，其它重链同种型(γα和ε)只天然表达。称为同种型转换的该基因重排过程通常是通过位于各重链基因上游的所谓转换片段(除δ外)之间的重组而进行的。各转换片段为2-10kb长，并主要由短重复序列组成。重组的精确位置随各类型的转换而不同。研究表明转换可能是与细胞CH序列的丢失有关，所述研究是利用溶液杂交动力学或采用cDNA衍生的CH探针的Southern印迹进行的。μ基因的转换(S)区，Sμ位于编码序列5’的约1-2kb处，并由许多串联重复的(GAGCT)n(GGGGT)序列组成，其中n通常为2到5，但最多可达17。(参见T.Nikaidoetal.，Nature292845-848(1981))。在其它CH基因的5’也发现了类似的跨数千个碱基对的内部重复转换序列。Sα区已被测序并发现其由串联重复的80-bp同源单位组成，而鼠Sγ2a、Sγ2b和Sγ3均含有彼此很相似的重复的49-bp同源单位。(参见P.Szureketal.，J.Immunol135620-626(1985)andT.Nikaidoetal.，J.Biol.Chem.2577322-7329(1982)，所述文献引入本文作为参考)。所有已测序的S区均包含出现率很高的五聚体GAGCT和GGGGT，它们是Sμ基因的基本重复元件(T.Nikaidoetal.，J.Biol.Chem.2577322-7329(1982)，所述文献引入本文作为参考)；在其它S区，这些五聚体不象在Sμ中那样精确地串联重复，但它们夹在较大的重复单位中间。Sγ1区有另外的较高级的结构两个同向重复序列，两侧翼各有两个49-bp串联重复序列簇。(参见M.R.Mowattetal.，J.Immunol.1362674-2683(1986)，该文献引入本文作为参考)。已发现人H链基因的转换区与小鼠H链基因的转换区很相似。实际上，发现人与小鼠CH基因5’克隆之间的相似性只限于S区，这证明了这些区在生物学上是很重要的。μ和α基因之间的转换重组产生了混合的Sμ-Sα序列。在总是发生重组的Sμ或在任何其它S区中，通常都没有特异性位点。通常，与V-J重组的酶机制不同，转换机制显然容纳了种系S前体的重复同源区的不同排列，然后在排列内的不同位置将序列连接。(参见T.H.Rabbitsetal.，NucleicAcidsRes.94509-4524(1981)andJ.Ravetchetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA776734-6738(1980)，该文献引入本文作为参考)。尚不了解转换成特定同种型的选择性激活机制的确切内容。尽管内源性因素如淋巴因子和细胞因子可能会上调节同种型-特异性重组酶，但也可能是相同的酶促机制催化向所有同种型的转换，而且特异性依赖于将这种机制靶导向特异的转换区。已经表明T细胞衍生的淋巴因子IL-4和IFNγ特异性地促进某些同种型的表达在小鼠中，IL-4降低IgM、IgG2a、IgG2b和IgG3的表达，提高IgE和IgG1的表达；而IFNγ选择性地刺激IgG2a的表达并对IL-4-诱导的IgE和IgG1表达的增加有拮抗作用(Coffmanetal.，J.Immunol.136949(1986)andSnapperetal.，Science236944(1987)，所述文献引入本文作为参考)。IL-4和IL-5的组合可促进IgA的表达(Coffmanetal.，J.Immunol.1393685(1987))。说明T细胞对转换所起作用的大部分试验并未排除这样一种可能性，即在发生特定转换重组的细胞中观察到的增加可能反映了对转换前或定型前细胞的选择；但最可能的解释是淋巴因子实际上促进了转换重组。类型转换的诱导似乎是与无效转录物有关，所述转录物起始于转换片段的上游(Lutzkeretal.，Mol.Cell.Biol.81849(1988)；Stavnezeretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA857704(1988)；EsserandRadbruch，EMBOJ.8483(1989)；Bertonetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA862829(2989)；Rothmanetal.，Int.Immunol.2621(1990)，各文献均引入本文作为参考)。例如，观察到的IL-4对γ1无效转录物的诱导作用和IFN-γ的抑制作用分别与IL-4促进培养B细胞中向γ1的转换以及IFN-γ抑制γ1表达有关。因此，包含影响无效转录物转录的调节序列也可以影响同种型的转换率。例如，增加特定无效转录物的转录通常会提高涉及相邻转换序列的同种型转换重组的频率。出于以上原因，优选在用于同种型转换的各转换区上游的约1-2kb处，转基因包含转录调节序列。这些转录调节序列优选包括启动子和增强子元件，更优选包含与转换区天然相连(即在种系构型中存在的)的5’侧翼区(即上游)。该5’侧翼区通常约至少50个核苷酸长，优选约至少200个核苷酸，最佳为至少500-1000个核苷酸。尽管可将来自一个转换区的5’侧翼序列与用于转基因构建的不同转换区相连(例如，可将来自人Sγ1转换序列的5’侧翼区移植到Sα1转换序列的上游；将鼠Sγ1侧翼区移到与人γ1转换序列相邻处；或将鼠Sγ1转换序列移到人γ1编码区上)，在一些实施方案中，优选插入在转基因构建体中的各转换区含有5’侧翼区，该侧翼区在天然种系构型的上游。单克隆抗体可用本领域熟知的各种技术生产单克隆抗体。总之，将来自用目标抗原免疫之动物的脾细胞无限增殖化，通常是通过与骨髓瘤细胞融合而达到的(参见，KohlerandMilstein，Eur.J.Immunol.6511-519(1976))。无限增殖化的其它方法包括用E-B病毒、癌基因或反转录病毒转化或本领域熟知的其它技术。从单一无限增殖细胞产生的克隆中筛选生产对所需抗原具特异性和亲和力的抗体，通过各种技术，包括注射到脊椎动物宿主的腹腔中，可提高所述细胞的单克隆抗体产率。这些领域有用的各种技术的有关讨论参见例如HarlowandLane，抗体实验室手册，冷泉港，纽约(1988)，所述技术包括免疫接种动物以生产免疫球蛋白；生产单克隆抗体；标记免疫球蛋白以用作探针；免疫亲和纯化；以及免疫检测。转基因初级库A.人免疫球蛋白座位转基因功能的一个重要要求是产生初级抗体库，所述成分必需足够多以引发对各种抗原的二级免疫反应。重排的重链基因由一个肽外显子、一个可变区外显子和串联排列的多-结构域恒定区组成，每个组分均是由数个外显子编码的。每个恒定区基因编码不同类型免疫球蛋白的恒定部分。在B细胞发育的过程中，缺失与V区邻近的恒定区，从而表达新的重链。对各类型的重链，RNA剪接的不同方式会产生跨膜和分泌的免疫球蛋白。估计人重链座位由近200个2Mb的V基因片段(目前的数据认为存在约50-100个V基因片段)、约40kb的近30个D基因片段、3kb内的6个J片段簇和约300kb以上的9个恒定区基因片段组成。整个座位占据14号染色体长臂远端的约2.5Mb。B.基因片段转基因1.重链转基因在优选的实施方案中，免疫球蛋白重和轻链转基因含有来自人的未重排的基因组DNA。在重链的情况下，优选的转基因含有长度为670-830kb的NotI片段。该片段的长度是不确定的，因为尚未精确确定3’的限制位点。但已知其位于α1和ψα基因片段之间。该片段含有已知VH家族的所有6个成员、D和J基因片段，以及μ、δ、γ3、γ1和α1恒定区(Bermanetal.，EMBOJ.7727-738(1988)，该文献引入本文作为参考)。含所述转基因的转基因小鼠品系正确地表达B细胞发育所需的重链(IgM)，和至少一种转换的重链(IgG1)，以及足够大量的可变区库以引发针对大部分抗原的二级反应。2.轻链转基因可同样构建含有来自人轻链座位所有必需基因片段和调节序列的基因组片段。按实施例和题目为“能够生产异源抗体的转基因非人动物”(1990年8月29日申请，U.S.S.N07/574748)的未决申请中的描述构建所述转基因。C.通过体内重组在细胞内产生的转基因无需分离在一个DNA片段上的所有或部分重链座位。因此例如可在转基因(transgenesis)过程中，在非人动物体内形成来自人免疫球蛋白重链座位的670-830kbNotI片段。所述体内转基因构建是通过将两个或多个重叠DNA片段导入到非人动物的胚胎核内而产生的。DNA片段的重叠部分含有基本上同源的DNA序列。在与包含在胚胎核内的重组酶接触后，重叠的DNA片段以适宜的方向进行同源重组以形成670-830kbNotI重链片段。可将体内转基因构建用于形成任何数量的免疫球蛋白转基因，这是因为用目前的技术很难或不可能进行如此大小的操作。因此体内转基因构建可用于产生比用YAC载体操作产生的DNA片段大的免疫球蛋白转基因(MurrayandSzostak，Nature305189-193)。可将所述转基因构建用于将基本上整个的免疫球蛋白座位导入非人动物中，所述免疫球蛋白座位来自与转基因非人动物不同的种。除形成基因组免疫球蛋白转基因外，还可将体内同源重组用于形成实施例中所述的“小座位”转基因。在利用体内转基因构建体的优选实施方案中，各重叠的DNA片段优选含有重叠的基本上同源的DNA序列，该序列位于一个DNA片段的一个末端和第二个DNA片段的一个末端之间。DNA片段的所述重叠部分优选含有约500bp-约2000bp，最佳为1.0kb-2.0kb。在普通转让的题目为“通过DNA片段的同源重组而使DNA在细胞内产生”(1990年8月29日申请，U.S.S.N.07/574,747)的美国专利申请中也描述了在体内形成转基因的重叠DNA片段的同源重组。D.小座位转基因如本文所用的，术语“免疫球蛋白小座位”指通常不到约150kb，一般在约25-200kb之间，含至少一种下列组分的DNA序列(可在较长的序列内)功能可变(V)基因片段、功能连接(J)区片段、至少一个功能恒定(C)区基因片段，而且如果是重链小座位，还可以含有功能多样性(D)区片段，以便所述DNA序列含有至少一种实质性的不连续(如相对于基因组DNA序列而言，通常至少约2-5kb，优选10-25kb或更长)。轻链小座位转基因至少25kb长，通常为50-60kb。重链转基因通常约70-80kb，优选至少约60kb，并含有两个与转换区可操作相连的恒定区。此外，小座位的个体元件优选是种系构型的，并能够在转基因动物的前B细胞中进行基因重排以便表达具有各种抗原特异性的功能抗体分子，所述各种抗原特异性全部是由小座位元件编码的。另外，含有至少两个CH基因和必需转换序列的重链小座位通常能够进行同种型转换，以便产生不同免疫球蛋白类型的功能抗体分子。所述同种型转换可在转基因非人动物体内的B细胞中发生，或发生在从转基因非人动物中取出的B细胞谱系的培养细胞中。在另一优选实施方案中，免疫球蛋白重链转基因含有一个或多个各种VH、D和JH基因片段以及两个或多个CH基因。至少将每种适宜类型的基因片段中的一个插入到小座位转基因中。就重链转基因的CH片段而言，优选转基因含有至少一个μ基因片段和至少一个其它恒定区基因片段，优选γ基因片段，最佳为γ3或γ1。这种优先选择会在编码的免疫球蛋白的IgG与IgM形式之间进行类型转换并生产可分泌的高亲和力非IgM免疫球蛋白。也可以使用其它恒定区基因片段如编码用于IgD、IgA和IgE生产的那些。本领域专业人员还可以构建这样的转基因，即其中重链CH基因出现的顺序不同于作为CH基因供体之品种种系中的天然空间顺序的转基因。另外，本领域专业人员可以选择来自品种内多个个体的CH基因(如同种异体的CH基因)并将所述基因插入到转基因中，作为能够进行同种型转换的额外的CH基因；然后在一些实施方案中，所得的转基因非人动物可生产各种类型的抗体，包括转基因CH基因所得自的品种所代表的所有同种异型。另外，本领域专业人员可从不同品种中选择CH基因以将其插入到转基因中。各CH基因包括功能转换序列，尽管所用的转换序列不必是那些与CH基因天然相邻的那些序列。种间CH基因组合会产生可生产各种类型抗体的转基因非人动物，所述抗体对应于来自各个种的CH基因。含种间CH转基因的转基因非人动物可作为构建杂交瘤的B细胞源以生产兽用单克隆抗体。人中的重链J区片段含有6个功能J片段和3个DNA为3kb长的假基因簇。已知其相对紧密的大小和分离这些片段以及μ基因和一个23kbSFiI/SpeI片段上δ基因5’部分的能力(Sado，etal.，Biochem.Biophys.Res.Comm.154264271(1988)，该文献引入本文作为参考)，优选将所有J区基因片段均用于小座位构建体。由于该片段包括μ和δ基因之间的区域，因此它可能含有μ表达所需的所有顺式连接的3’调节元件。此外，由于该片段包括整个J区，所以它含有重链增强子和μ转换区(Millsetal.，Nature306809(1983)；YancopoulosandAlt，Ann.Rev.Immunol.4339-368(1986)，所述文献引入本文作为参考)。该片段还含有引发VDJ连接以形成初级B细胞的转录起始位点(YancopoulosandAlt，Cell40271-281(1985)，该文献引入本文作为参考)。或者，可用包含部分D区的36kbBssHII/SpeI1片段代替23kbSfiI/SpeI1片段。用所述片段增加5’侧翼序列的量以促进有效的D到J连接。人D区由4个同源的9kb亚区组成，所述亚区是串联的(Siebenlist，etal，(1981)Nature，294,631-635)。各亚区含有最多达10个D片段。已将这些片段中的一些作了图谱分析并列在图4中。可用两种不同的方法产生小座位D区。第一种方法是只使用位于短连续区之DNA上的那些D片段，该DNA包含一个或两个重复的D亚区。候选物是含12个D片段的一个15kb片段。该DNA由2个连续的EcoRI片段组成，并已将其完全测序(Ichihara，etal.，(1988)，EMBOJ.，7，4141-4150)。12个D片段足以满足初级库。但由于D区分散的性质，因此另一种方法是将数个不连续的含D-片段的片段连接在一起，以产生片段数量较多的小片段DNA。例如通过确定是否存在侧翼九聚体和七聚体序列(同上文)并参考有关文献可鉴定出其它的D-片段基因。用至少一个，优选一个以上的V基因片段来构建重链小座位转基因。按未决申请U.S.S.N07/574748(1990年8月29日申请)、PCT/US91/06185(1991年8月28日)和U.S.S.N07/810279(1991年12月17日申请)(所述文献均引入本文作为参考)所述，可分离带有或不带有侧翼序列的重排的或未重排的V片段。按未决申请U.S.S.N07/574748(1990年8月29日申请)、PCT/US91/06185(1991年8月28日)中所述，可分离带有或不带有侧翼序列的重排的或未重排的V片段、D片段、J片段和C基因。可从人λ或κ免疫球蛋白座位相似地构建小座位轻链转基因。因此例如可从多个DNA片段构建例如约75kb编码V、D、J和恒定区序列的免疫球蛋白重链小座位转基因构建体，所述每个序列均与人基因序列基本同源。优选将所述序列与转录调节序列可操作相连并使所述序列能进行重排。用两个或多个适宜排列的恒定区序列(如μ和γ)和转换区，也可进行转换重组。如未决申请U.S.S.N07/574748(1990年8月29日申请)中所述，从多个与人DNA基本上同源并能进行重排的DNA序列可构建举证性的轻链转基因构建体。E.能够进行同种型转换的转基因构建体理论上，要进行类型转换的转基因构建体应包括调节无效转录物所需的所有顺式作用序列。天然转换区和上游启动子以及调节序列(如IFN-可诱导的元件)是优选包含在能够进行同种型转换的转基因构建体中的顺式作用序列。应将转换区(优选人1γ转换区)相邻上游的至少50个碱基对，优选约至少200个碱基对，最佳至少500-1000个碱基对或更长的序列与转换序列优选人γ1转换序列可操作相连。此外，可将转换区与天然不和特定转换区相连的CH基因的上游相连(并与之相邻)。例如，但不是为了限制，可将人γ1转换区与人α2CH基因的上游相连，或可将鼠γ1转换区与人CH基因相连。在转基因小鼠中达到非典型同种型转换(如δ相关的缺失)的其它方法涉及包含在人μ基因侧翼的400bp同向重复序列(σμ和εμ)(Yasuietal.，Eur.J.Immunol.191399(1989))。这两个序列间的同源重组使只产生IgD的B细胞中的μ基因缺失了。可用下列结构式表示重链转基因(VH)x-(D)y-(JH)z-(SD)m-(C1)n-[(T)-(SA)p-(C2)]q其中VH是重链可变区基因片段，D是重链D(多样性)区基因片段，JH是重链J(连接)区基因片段，SD是能够参与与Sa受体区的片段重组以便同种型转换发生的供体区片段，C1是B细胞发育中所用的编码同种型的重链恒定区基因片段(如μ和δ)，T是含至少一个启动子的顺式作用转录调节区片段，SA是能够参与与所选SD供体区片段进行重组以便进行同种型转换的受体区片段，C2是编码除μ以外同种型(如γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、ε)的重链恒定区基因片段。x、y、z、m、n、p和q是整数。x是1-100，n是0-10，y是1-50，p是1-10，z是1-50，q是0-50，m是0-10。通常当转基因能够进行同种型转换时，q必须至少是1，m至少是1，n至少是1，m大于或等于n。VH、D、JH、SD、C1、T、SA和C2片段可以来自各种品种，优选哺乳动物，最好是人和鼠种系DNA。VH片段可来自各种品种，但优选来自在人种系中天然存在的VH片段，如VH251。通常包括约2个VH片段，优选包括约4个VH片段，最佳至少包含约10个VH片段。通常至少包含一个D片段，尽管优选至少包含10个D片段，而且一些实施方案中包括10个以上的D片段。一些优选的实施方案包含人D片段。通常将至少一个JH片段插入到转基因中，尽管转基因优选包含约6个JH片段，而某些优选实施方案包括约6个以上的JH片段。一些优选的实施方案包含人JH片段，而在更为优选的实施方案中包含6个人JH片段，而不包含非人JH片段。SD片段是能够参与与转基因的SA片段重组的供体区。对于典型的同种型转换，SD和SA是象Sμ、Sγ1、Sγ2、Sγ3、Sγ4、Sα、Sα2、Sε这样的转换区。优选转换区是鼠或人的，更优选SD是人或鼠的Sμ，以及SA是人的或鼠Sγ1。对于非典型同种型转换(如δ相关的缺失)，SD和SA优选是在人μ基因侧翼的400bp同向重复序列。C1片段通常是μ或δ基因，优选μ基因，更优选人或鼠μ基因。T片段通常包含与转换区天然相邻的(即种系)S’侧翼序列。T片段通常为至少约50个核苷酸，优选约至少200个核苷酸，更优选约至少500-1000个核苷酸。优选T片段是种系构型中与人或鼠转换区上游紧邻的5’侧翼序列。对于本领域专业人员显而易见的是，T片段可包含在动物种系中不天然存在的顺式作用转录调节序列(如病毒增强子和启动子，如在SV40、腺病毒和其它感染真核细胞的病毒中发现的那些)。C2片段通常是γ1、γ2、γ3、γ4、α1、α2、εCH基因，优选这些同种型的人CH基因，更优选人γ1或γ3基因。也可使用鼠γ2a和γ2b，作为各品种下游(即转换的)同种型基因。若重链转基因含有免疫球蛋白重链小座位，则转基因的全长通常为150kb或少一些。总之，转基因不是天然重链Ig座位。因此例如，可以缺失非必需区或用其它品种的相应区进行取代。F.确定Ig转基因中功能同种型转换的方法可以用本领域已知的任何方法确定转基因非人动物中同种型转换出现的频率。优选的实施方案包括下列内容，单独或组合使用1.检测mRNA转录物，所述转录物含有与至少一个转基因下游CH基因而不是δ同源的序列以及与转基因VH-DH-JH重排的基因同源的相邻序列；所述缺失可通过Northern杂交、S1核酸酶保护检测、PCR扩增、cDNA克隆或其它方法来检测。2.在转基因动物血清或从转基因动物B细胞制备的杂交瘤细胞培养物的上清液中检测由下游CH基因编码的免疫球蛋白，其中可通过免疫化学方法表明所述蛋白质含有功能可变区；3.在来自转基因动物B细胞的DNA或杂交瘤细胞的基因组DNA中检测DNA重排与转基因中同种型转换的出现是否一致，所述检测可通过Southern印迹杂交、PCR扩增，基因组克隆或其它方法来完成；或4.鉴定同种型转换的其它标志，如无效转录物的生产、与转换有关的特征酶(如“转换重组酶”)的生产、或其它可检测、测量或通过目前技术可观察到的其它特征。由于各转基因品系可代表转基因整合的不同位点，以及转基因插入片段可能不同的串联排列，而且由于转基因和侧翼DNA序列各自不同的构型会影响基因表达，因此优选鉴定并使用表达高水平人免疫球蛋白(特别是IgG同种型)并含有最少拷贝的转基因的小鼠品系。单拷贝的转基因可使出现不完全等位基因表达的情况降之最少。通常将转基因整合到宿主染色体DNA中，最经常的是插入到种系DNA中，并通过随后培育种系转基因种畜动物来扩增。但是，实施者可按情况或需要使用本领域已知或随后开发出的其它载体和转基因方法。内源非人重链恒定区基因可发生反式转换，并产生嵌合重链和含有所述嵌合人/小鼠重链的抗体。所述抗体可能适用于本文所述的某些用途，也可能是不令人满意的。G.内源免疫球蛋白座位的功能性破坏通过抑制转基因非人动物中内源免疫球蛋白基因的重排，预期成功重排的免疫球蛋白重和轻链转基因的表达会具有显性效果。但是另一种产生没有内源抗体的非人动物的方法使内源免疫球蛋白座位突变。利用胚胎干细胞技术和同源重组，可以很容易地除去内源免疫球蛋白库。下面描述对小鼠免疫球蛋白座位的功能性破坏。但公开的载体和方法很容易经改变而适用于其它非人动物。总之，该技术包括通过同源重组使能够分化成生殖细胞组织的多潜能细胞系中的基因失活。将含有改变的、小鼠免疫球蛋白基因拷贝的DNA构建体导入到胚胎干细胞核中。在细胞的一部分中，导入的DNA与内源小鼠基因拷贝重组(用不同的拷贝代替之)。将含新的遗传工程损伤的细胞注射到宿主小鼠胚胎中，然后将该胚胎再植入到雌性受体中。有些胚胎发育成嵌合小鼠，这些小鼠具有完全衍生于突变细胞系的生殖细胞。因此，通过繁殖嵌合小鼠，可以得到含导入的遗传损伤的新小鼠品系(见Capecchi(1989)，Science，244，1288-1292中的综述)。由于小鼠λ座位只占免疫球蛋白的5％，所以重链和/或κ轻链座位的失活就足够了。有3种方法来破坏这些中的每个座位，缺失J区、缺失J-C内含子增强子以及通过导入终止密码子而破坏恒定区编码序列。就DNA构建体的设计而言，最后这种方法是最直接的。除去μ基因破坏了B细胞的成熟，由此防止通过类型转换而转换成任何有功能的重链片段。下面列出使这些座位失效的方法。为了破坏小鼠μ和κ基因，以Jaenisch和其同事(Zijlstra，etal.(1989)，Nature，342,435-438)用于成功地破坏小鼠β2微球蛋白基因的设计为基础，使用靶向载体。将来自质粒pMCIneo的新霉素抗性基因(neo)插入到靶基因的编码区。pMCIneo插入片段使用杂合病毒启动子/增强子序列以驱动neo表达。该启动子在胚胎干细胞中有活性。因此，可用neo作为失效构建体整合的选择性标记。将HSV胸苷激酶(tk)基因加到构建体的一端，作为抗随机插入的阴性选择性标记(Zijlstra，etal.同上文)。破坏重链座位的一种优选方法是除去J区。该区在小鼠中相当小，只有1.3kb。为了构建基因的靶向载体，分离15kbKpnI片段，该片段含有小鼠基因组文库中的所有分泌的A恒定区。用来自pMCIneo的1.1kb插入片段取代1.3kb的J区。然后将HSVtk基因加到KpnI片段的5’末端。通过同源重组，该构建体的正确整合，会导致用neo基因取代小鼠JH区。采用以neo基因为基础的引物和与D区KpnI位点5’末端的小鼠序列同源的引物，通过PCR筛选重组体。或者，通过破坏μ基因的编码区使重链座位失效。该方法也使用前述方法中所用的相同的15kbKpnI片段。将来自pMCIneo的1.1kb插入片段插入到外显子II中特有的BamHI位点，然后，将HSVtk基因加到KpnI3’末端。然后筛选在neo插入片段任一侧翼的、除去tk基因的双交换。通过PCR扩增，从筛选的克隆池中检测这些结果。一个PCR引入衍生于neo序列，另一分来自靶向载体外的小鼠序列。在实施例中说明了小鼠免疫球蛋白的功能性破坏。G.内源免疫球蛋白座位的抑制表达除内源Ig座位的功能性破坏外，抑制是防止内源Ig座位表达的另一种方法。可用从一种或多种整合转基因产生的反义RNA，通过反义寡核苷酸，和/或通过施用一种或多种对内源Ig链具特异性的抗血清来抑制内源Ig基因。反义多核苷酸可用反义RNA转基因使特定的基因部分或完全不能表达(Pepineta1.，(1991)Nature355725；Helene.，C.andToulme，J.(1990)BiochimicaBiophys.Acta104999；Stout，J.andCaskey，T.(1990)Somat.CellMol.Genet.16369；Muniretal.，(1990)Somat.CellMol.Genet.16383，各文献均引入本文作为参考)。“反义多核苷酸”是有下列性质的多核苷酸(1)与全部或部分参考序列，如内源IgCH或CL区的序列互补，和(2)与靶序列如染色体基因座位或IgmRNA特异性杂交。所述互补反义多核苷酸可包含核苷酸取代、增加、缺失或转座，只要还保留了与相关靶序列特异性杂交的所述多核苷酸的功能特性。互补的反义多核苷酸包括可与各种mRNA特异性杂交并防止mRNA转录和/或RNA加工和/或所编码多肽翻译的可溶性反义RNA或DNA寡核苷酸(Chingetal.Proc.Natl.Acad.Sci.USA8610006-10010(1989)；Broderetal.，Ann.Int.Med.113604-618(1990)；Loreauetal.，FEBSLetters27453-56(1990)；Holcenbergetal.，WO91/11535；U.S.S.N.07/530165(“新的人CRIPTO基因”)；WO91/09865；WO91/04753；WO90/13641；和EP386563，所述文献均引入本文作为参考)。反义序列是与至少一种至少约15个连续核苷酸长，通常至少20-30个核苷酸长，且优选30个以上核苷酸长的免疫球蛋白基因序列互补的多核苷酸序列。但在某些实施方案中，与互补的免疫球蛋白基因序列相比，反义序列可以有取代、增加或缺失，只要还保留了与相关靶序列可特异性杂交的反义多核苷酸特性。通常反义序列与在DNA重排后编码或可以编码免疫球蛋白链的内源免疫球蛋白基因序列互补。在一些情况下，对应于免疫球蛋白基因序列的有义序列可以发挥功能以便抑制表达，特别是通过干扰转录来抑制表达。因此反义多核苷酸抑制所编码多肽的生产。就此而言，抑制一种或多种内源Ig座位之转录和/或翻译的反义多核苷酸可使非人动物的能力和/或特异性发生变化，以生产由内源Ig座位编码的免疫球蛋白链。可在转染的细胞或转基因细胞(例如用于重建个体或转基因非人动物的全部或部分造血干细胞群的转基因多潜能造血干细胞)中，可从异源表达盒生产反义多核苷酸。或者，反义多核苷酸可包括在体外培养基中或在体内循环系统或组织液中被施用到外环境的可溶性寡核苷酸。已经表明在外环境中存在的可溶性反义多核苷酸可接近胞质并抑制特定种类mRNA的翻译。在一些实施方案中，反义多核苷酸含有甲基膦酸酯部分，或者也可以用硫代磷酸酯或邻甲基核糖核苷酸，也可用嵌合寡核苷酸(Dagleetal.，(1990)NucleicAcidsRes.184751)。对于某些应用，反义寡核苷酸可含有多酰胺核酸(Nielsenetal.，(1991)Science2541497)。与反义多核苷酸有有关的一般方法，参见反义RNA和DNA(1988)，D.A.Melton，Ed.，冷泉港实验室，冷泉港(NY)。用与一种或多种序列互补的反义多核苷酸抑制转录、RNA加工和/或相应mRNA的翻译，以此降低所编码多肽的数量。所述反义多核苷酸可通过抑制体内一种或多种内源Ig链的形成而提供治疗作用。无论是作为可溶性的反义寡核苷酸，还是作为从反义转基因转录出的反义RNA，都可以对本发明的反义多核苷酸进行筛选以便在体内生理条件下优先与内源Ig序列杂交。最典型的是，所选的反义多核苷酸不会与由本发明重或轻链转基因编码的异源Ig序列杂交(即反义寡核苷酸对转基因Ig表达的抑制不会超过约25-35％)。抗血清抑制通过用抗一种或多种内源Ig链的抗血清注射小鼠来部分或完全抑制内源Ig链的表达(Weissetal.，(1984)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)81211，该文献引入本文作为参考)。对抗血清进行筛选以便其只与一种或多种内源(如小鼠)Ig链发生特异性反应，而与由本发明Ig转基因编码的异源Ig链的交叉反应最小或没有。因此，按照Weiss等人确立的方案(出处同上)，施用所选的抗血清将抑制内源Ig链的表达，但可以表达由本发明转基因编码的异源Ig链。用于抗体的适宜的抗体源包括(1)单克隆抗体，如与鼠μ、γ、κ或λ链特异性结合但不与由本发明的人Ig转基因编码的人免疫球蛋白链反应的单克隆抗体；(2)所述单克隆抗体的混合物，以便所述混合物与一种内源Ig链上的多个表位、多个内源Ig链(如鼠μ和鼠γ)或多表位和多链或内源免疫球蛋白结合(3)多克隆抗血清或其混合物，通常所述抗血清是单特异性的，用于结合一种内源Ig链(鼠μ、鼠γ、鼠κ或鼠λ)或多种内源Ig链，最优选的是所述抗血清与由本发明转基因编码的人免疫球蛋白链只有微不足道的结合；和/或(4)与一种或多种内源Ig链结合的多克隆抗血清和单克隆抗体的混合物，最优选的是与由本发明转基因编码的人免疫球蛋白链只有微不足道的结合。通常多克隆抗体是优选的，而且该基本上单特异性的多克隆抗体最好是由抗人免疫球蛋白抗血清生产的，即通过用衍生于非人动物(如鼠)的抗体预吸附和/或例如通过在含固定的人Ig(其中富集抗血清中具有所需抗人Ig结合的馏分；通常用低pH或离液序列高的盐溶液洗脱结合的馏分)的亲和树脂上对抗血清或其纯化的馏分进行亲和色谱来制备。可以用细胞分离和/或补体固定来增加抗体-针对的细胞的消耗，所述细胞是表达内源(鼠)免疫球蛋白链的淋巴细胞。在一个实施方案中，例如用抗体在间接体内消除表达鼠Ig的外植的造血细胞和/或从含人Ig转基因的转基因小鼠中得到的B谱系淋巴细胞。因此从含人Ig转基因(优选同时含人重链转基因和人轻链转基因)的转基因非人动物中移植造血细胞和/或B谱系淋巴细胞，并将植出的细胞与具有下列性质的抗体一起保温(1)与内源免疫球蛋白(如鼠μ和/或κ)结合，和(2)基本上不与由转基因编码的人免疫球蛋白链结合。为了清楚起见，将所述抗体称为“抑制抗体”。移植出的细胞群选择性地消耗与抑制抗体结合的细胞，所述消耗可通过各种方法完成，如(1)物理分离以从未结合的细胞中除去抑制抗体结合的细胞(如可将抑制抗体与固体支持物或磁珠结合以固定并除去与抑制抗体结合的细胞)，(2)通过抗体依赖性的细胞杀死作用来杀死抑制抗体结合的细胞(如通过ADCC，通过补体固定、或通过与抑制抗体结合的毒素)，和(3)由抑制抗体诱导的克隆无反应性等。通常，用于产生内源Ig链的抗体抑制的抗体能够固定补体。通常优选对所述抗体进行筛选以便使之与用于间接体内/体外消耗的方便补体源，如兔或豚鼠补体很好地进行反应。对于体内消耗，通常优选抑制剂抗体在非人转基因动物中具有效应子功能；因此具有鼠效应子功能(如ADCC和补体固定)的抑制抗体通常可优选用于转基因小鼠。另一种情况是，将与预定内源免疫球蛋白链特异性结合的抑制抗体用于间接体内/体外消耗表达内源免疫球蛋白的淋巴细胞。将来自含人免疫球蛋白转基因的转基因非人动物的细胞外植体(如淋巴细胞样品)与抑制抗体结合，与抑制抗体特异性结合的细胞(如通过固定、补体固定等)就被消耗掉了，因此，产生一细胞亚群，表达内源(非人)免疫球蛋白的细胞(如表达鼠Ig的淋巴细胞)则被消耗掉了。将所得的消耗过的淋巴细胞种群(T细胞，人Ig阳性B细胞等)转移到免疫相容的(即MHC相容的)相同种的非人动物中，该动物基本上不能生产内源抗体(如SCID小鼠、RAG-1或RAG-2失效小鼠)。然后可用抗原免疫该重建的动物(小鼠)(或用用于免疫供体动物的抗原再免疫接种，外植物是从所述供体动物中得到的)以得到高亲和力(亲和力成熟的)抗体和生产所述抗体的B细胞。可用所述B细胞通过常规细胞融合产生并筛选杂交瘤。可将抗体抑制作用与其它内源Ig失活/抑制方法(如JH失效、CH失效、D区删除、反义抑制、补偿的移码失活)结合使用。完全的内源Ig座位失活在某些实施方案中，需要产生内源Ig座位的完全失活以便不会形成含人可变区和非人(如鼠)恒定区的杂合免疫球蛋白链(如通过转基因和内源Ig序列之间的反式转换)。携带内源重链等位基因的小鼠(该小鼠在JH区发生功能性破坏)，只是经常表现为反式转换，通常其中由转基因编码的重排的人可变区(VDJ)表达为与内源鼠恒定区相连的融合蛋白，尽管其它反式转换连接也是可能的。为了克服这一潜在的问题，通常需要用各种方法使内源重链座位完全失活，所述方法包括但不限于(1)通过同源重组来进行功能性破坏和/或消耗掉至少一个优选所有内源重链恒定区基因，(2)使至少一个优选所有内源重链恒定区基因发生突变以编码一终止密码子(或移码)，从而产生截短的或移码产物(如果是反式转换的话)，以及对于本领域专业人员是显而易见的其它方法和策略。可以用各种方法来缺失主要或全部重链恒定区基因和/或D区基因，所述方法包括通过同源重组特别是“hit-and-run”型的靶向载体而进行连续缺失等。同样，常常优选的是功能性地破坏和/或缺失至少一个内源轻链座位(如κ)以除去内源轻链恒定区基因。通常，需要使用移码的转基因，其中异源转基因在J片段含有移码而在一种或多种(优选所有的)转基因恒定区基因的起始区(即氨基末端的编码区)含有补偿移码(即，重新产生原始的解读框架)。反式转换内源IgH座位恒定基因(不含有补偿移码)会产生截短的或错义产物，所述产物会导致应被缺失或不选择的反式转换B细胞的产生，因此抑制反式转换表型。也可用反义抑制和抗体抑制来使内源Ig基因产物的表达(如鼠重和轻链序列)和/或反式转换的抗体(如人可变/鼠恒定嵌合抗体)基本上完全功能性地失活。可以用失活和抑制策略的各种组合来基本上实现内源(如鼠)Ig链表达的完全抑制。反式转换在某些方案中，可以生产反式转换的免疫球蛋白。例如，所述反式转换的重链可以是嵌合(非鼠(人)可变区和鼠恒定区)的。可以将含所述嵌合反式转换免疫球蛋白的抗体用于需要具有非人(如鼠)恒定区的各种应用中(如抑制在宿主中的效应子功能，用于存在鼠免疫决定簇的情况，如用于结合不与人恒定区结合的二级抗体)。例如，就针对特定抗原而言，与鼠可变区库相比，人可变区库可能更有利。可能在进化过程中，已经对人VH、D、JH、VL和JL基因编码免疫球蛋白的能力进行了选择，所述免疫球蛋白可结合进化上重要的某些抗原；给鼠库提供进化选择压力的抗原不同于给人库提供进化压力的那些抗原。可能存在其它库上的优点，当与鼠恒定区(如反式转换的鼠)同种型结合时，使人可变区库更有利。鼠恒定区的存在可比人恒定区有利。例如与人可变区相连的鼠γ恒定区通过反式转换可提供具有鼠效应子功能(如ADCC、鼠补体固定)的抗体，以便与预定抗原(如人IL-2受体)反应的所述嵌合抗体(优选单克隆)可用小鼠疾病模型来检测，如移植-宿主疾病的小鼠模型，在该模型中小鼠中的T淋巴细胞表达功能性人IL-2受体。随后可分离人可变区编码序列(如通过PCR扩增或自来源(杂交瘤克隆)进行cDNA克隆)并与编码所需人恒定区的序列剪接在一起以编码更适用于人治疗用途的人序列抗体，对所述抗体而言，优选使免疫原性最小。可在宿主细胞中表达含有所得全长人编码序列的多核苷酸(如在哺乳动物中从表达载体开始表达)并将其纯化用于药物制剂。对于某些应用，可直接用嵌合抗体而无需用人恒定区取代鼠恒定区。反式转换的嵌合抗体的其它改变和用途对于本领域专业人员是显而易见的。本发明提供了含B淋巴细胞的转基因非人动物，所述B淋巴细胞表达嵌合抗体，所述抗体通常是人重链转基因和内源鼠重链恒定区基因之间的反式转换而产生的。所述嵌合抗体含有人可变区序列和鼠恒定区，通常是鼠转换的(即非μ、非δ)同种型。如果编码人可变区和人恒定区基因的人重链和其轻链转基因均被整合，则能够产生与预定抗原反应之嵌合抗体的转基因非人动物也能生产全部的人抗体序列。最典型的是，所述动物是功能性破坏的重链座位和/或轻链座位纯合的，但保留了一个或多个能够进行反式转换的内源重链恒定区基因(如γ、α、ε)并通常保留顺式连接的增强子。用预定抗原(通常与佐剂结合)免疫接种所述小鼠，产生含有可检测量嵌合抗体的免疫反应，所述嵌合抗体含有由与鼠恒定区序列相连的人可变区序列组成的重链。通常所述免疫动物的血清会含有浓度约至少为1μg/ml、经常约至少10μg/ml、常常至少30μg/ml或高达50-100μg/ml或更多的嵌合抗体。含有包含嵌合人可变/小鼠恒定区重链之抗体的抗血清通常也含有包含人的变/人恒定区(完全的人序列)重链的抗体。嵌合反式转换的抗体通常含有(1)由人可变区和鼠恒定区(通常是鼠γ)组成的嵌合重链，和(2)人转基因编码的轻链(通常κ)或鼠轻链(通常κ失效背景中的λ)。所述嵌合反式转换的抗体通常与预定的抗原(如免疫原)结合，亲和力为约至少1×107M-1，优选亲和力为约至少5×107M-1，更优选亲和力为至少1×108M-1-1×109M-1或更高。通常预定的抗原是人蛋白质，如人细胞表面抗原(如CD4、CD8、IL-2受体、EGF受体、PDGF受体)，其它人生物大分子(如凝血调节蛋白、蛋白C、碳水化合物抗原、sialylLewis抗原、L-选择蛋白)或非人疾病相关的大分子(如细菌LPS、病毒颗粒衣壳蛋白或包膜糖蛋白)等。本发明提供了含基因组的转基因非人动物，所述基因组含有(1)纯合的功能性破坏了的内源重链座位，所述座位含有至少一个能够反式转换的鼠恒定区基因(如与功能性转换重组序列并通常与功能性增强子顺式连接的恒定区基因)，(2)能够进行重排以编码并表达功能性人重链可变区并能够反式转换的(如，含有顺式连接的RSS)人重链转基因；可选择性地含有(3)能够进行重排以编码功能性人轻链可变区并表达人轻链序列的人轻链(如，κ)转基因；还可选择性地含有(4)纯合的功能性破坏了的内源轻链座位(κ，优选κ和λ)；并可选择性地含有(5)含有包含嵌合重链之抗体的血清，所述嵌合重链由人转基因编码的人可变区序列和内源鼠重链恒定区基因编码的鼠恒定区序列(如，γ1、γ2a、γ2b、γ3)组成。所述转基因小鼠还可含有含嵌合抗体的血清，所述嵌合抗体与预定的人抗原(如CD4、CD8、CEA)结合，亲和力为约至少1×104M-1，优选亲和力为约至少5×104M-1，更优选亲和力为至少1×107M-1至1×109M-1或更高。通常可制备所产单克隆抗体的亲和力至少为8×107M-1的杂交瘤。含由鼠恒定区和人可变区组成的重链的、并经常能够与非人抗原结合的嵌合抗体也可存在于血清或从杂交瘤分泌的抗体中。在一些改变中，需要产生转基因小鼠，所述转基因小鼠保留了完整重链恒定区基因的内源小鼠重链座位已经失活了，并含有能够进行反式转换的人重链转基因，另外可选择性地含有人轻链转基因，所述轻链转基因可选择性地含有一个或多个失活的内源小鼠轻链座位。所述小鼠通过反式转换可有利于生产B细胞，所述B细胞能够表达含全部人重链的抗体以及含嵌合(人可变/小鼠恒定区)重链的抗体。所述小鼠的血清应含有包含全部人重链的抗体和包含嵌合(人可变/小鼠恒定区)重链的抗体，所述重链优选与完整人轻链组合。可从所述小鼠的B细胞产生杂交瘤。通常，可通过反式转换生产所述嵌合抗体，其中编码人可变区(如由体内生产性V-D-J重排编码的)与人恒定区(通常是人μ)的人转基因，与非转基因免疫球蛋白恒定基因转换序列(RSS)进行转换重组，由此将转基因编码的人可变区与不由所述转基因编码的重链恒定区(通常是内源鼠免疫球蛋白重链恒定区或由第二转基因编码的异源(如人)重链恒定区)可操作相连。而顺式转换指通过转基因内RSS元件的重组而进行的同种型转换，反式转换指转基因RSS与转基因外RSS元件(常常位于与含所述转基因之染色体不同的染色体上)之间的重组。反式转换通常发生于被表达转基因重链恒定区基因的RSS与内源鼠恒定区基因(非μ同种型，通常是γ)的RSS或在第二转基因(通常整合在另外的染色体上)中所含的人恒定区基因的RSS之间。当反式转换发生于被表达转基因重链恒定区基因(如μ)的RSS与第二转基因上所含的人重链恒定区基因的RSS之间时，会生产出基本上含有完整人序列的非嵌合抗体。例如但并非限制，可将编码人重链恒定区(如γ1)的多核苷酸和可操作相连的RSS(如γ1RSS)导入(如转染进)从转基因小鼠B细胞(或B细胞种群)产生的杂交瘤细胞中，所述B细胞表达含转基因编码的人μ链的抗体。可凭所得的杂交瘤细胞是否存在导入的多核苷酸和/或表达含重链的反式转换的抗体而对杂交瘤进行筛选，所述重链带有人μ链可变区(个体型/抗原反应性)和由导入的多核苷酸序列编码的恒定区(如人γ1)。在转基因编码的人μ链的RSS与编码下游同种型(如γ1)的导入的多核苷酸RSS之间的反式转换重组可产生反式转换的抗体。本发明还提供了生产所述嵌合反式转换之抗体的方法，所述方法包括用预定抗原免疫接种转基因小鼠的步骤，所述转基因小鼠的基因组含有(1)纯合的功能性破坏了的内源重链座位，所述座位含有至少一个能够反式转换的鼠恒定区基因(如，γ2a、γ2b、γ1、γ3)，(2)能够进行重排以编码有功能的人重链可变区并表达人重链序列而且能够进行同种型转换(和/或反式转换)的人重链转基因；可选择性地含有(3)能够进行重排以编码有功能的人轻链(如，κ)可变区并表达人轻链序列的人轻链(如，κ)转基因；还可选择性地含有(4)纯合的功能性破坏了的内源轻链(κ，优选κ和λ)座位；并可选择性地含有(5)含有包含嵌合重链之抗体的血清，所述嵌合重链由人转基因编码的人可变区序列和内源鼠重链恒定区基因编码的鼠恒定区序列(如，γ1、γ2a、γ2b、γ3)组成。亲和力标记转换同种型的筛选有利的是，反式转换(和顺式转换)与体细胞突变有关。体细胞突变扩大了由B细胞克隆子代编码的抗体的亲和性范围。例如由进行了转换(反式或顺式)的杂交瘤细胞生产的抗体，其抗原结合亲和性的范围大于在未进行转换的杂交瘤细胞中的抗体的。因此，可从表达第一抗体的杂交瘤细胞群(通常是克隆的)(所述细胞群表达含一重链的第一抗体，所述重链含有在多肽中与第一人重链恒定区(如μ)相连的人重链可变区)中筛选杂交瘤细胞克隆变体，所述变体表达含有在多肽中所述第一人重链可变区与第二重链恒定区(如人γ、α或ε恒定区)相连的重链的抗体。可通过产生体外顺式转换的自然克隆变异、通过施用促进同种型转换的试剂如T细胞衍生的淋巴因子(如IL-4和IFNγ)诱导类型转换(反式或顺式)、通过导入含功能性RSS和异源(如人)重链恒定区基因的多核苷酸作为反式转换的底物或通过上述方法的结合等可生产所述克隆变体。通常将含人下游同种型恒定区(如γ1、γ3等)和可操作连接的RSS的多核苷酸导入杂交瘤细胞以促进通过反式转换机制的同种型转换。类型转换和亲和力成熟发生在由本发明转基因动物产生的B细胞的同一种群中。因此可将鉴定类型转换的B细胞(或从其衍生的杂交瘤)作为得到高亲和力单克隆抗体的筛选步骤。可以用各种方法促进类型转换如顺式转换(基因内转换)、反式转换或两者。例如可将含有μ和γ恒定区基因以及相关RSS元件和转换调节元件(如无效转录物启动子)的单个连续人基因组片段用作转基因。但是，所需单个连续人基因组片段的某些部分可能很难有效地克隆，例如由于当在克隆宿主中复制时不稳定等问题；具体地说，证明δ与γ3之间的区域很难有效克隆，特别是含μ基因、γ3基因、V基因、D基因片段和J基因片段的连接片段。例如不连续的人转基因(小基因)由人μ基因、人γ3基因、人V基因、人D基因片段和人J基因片段组成，其中可带有一个或多个间插序列(内含子)或其它非必需序列(如一个或多个V、D和/或J片段和/或一个或多个非μ恒定区基因)的缺失。与含有免疫球蛋白有效表达和转换所必需的所有元件的单个连续基因组DNA片段相比，所述小基因有一些优点。例如所述小基因不需分离大的DNA片段，所述大DNA片段可能含有很难克隆的序列(如不稳定的序列、毒序列等)。此外含进行顺式或反式转换所必需的同种型转换元件(如人γ无效转录物启动子)的小座位对于进行体内体细胞突变和类型转换也有利。由于许多真核DNA序列很难克隆，因此删除非必需序列是有利的。在一种改变中，从衍生于转基因小鼠B细胞的杂交瘤池中，通过筛选得到生产具有高亲和力(如至少1×107M-1，优选至少1×108M-1，更优选至少1×109M-1或更高)之抗体的杂交瘤克隆，所述转基因小鼠含有能够进行同种型转换(见上文)并基本上没有内源鼠重链座位(能够进行生产性(框架内)V-D-J重排)的人重链转基因，所述杂交瘤表达含重链的抗体，所述重链含有在多肽中与人(或小鼠)非μ重链恒定区相连的人重链可变区；将所述抗体称为“转换的抗体”，因为它们含有作为体内顺式转换和/或反式转换或细胞培养结果的“转换的重链”。生产所述转换抗体的杂交瘤通常可进行体细胞突变，所述杂交瘤池通常具有很宽的抗原结合亲和性，从中可筛选分泌高亲和力抗体的杂交瘤。通常通过包括两个步骤的方法，可筛选分泌人序列抗体的杂交瘤，所述人序列抗体具有与预定抗原的主要结合亲和力(大于1×107M-1-1×108M-1)，而且其中所述人序列抗体含有人免疫球蛋白可变区。一个步骤是鉴定并分离能分泌含有转换的重链免疫球蛋白的杂交瘤细胞(如通过将杂交瘤细胞与固定的免疫球蛋白结合，所述固定的免疫球蛋白与转换的重链特异性结合，并基本上不与未转换的同种型(如μ)结合)。另一步骤是鉴定以主要结合亲和力与预定抗原结合的杂交瘤细胞(如通过杂交瘤克隆上清液的ELISA、使用标记抗原的FACS分析等)。通常，在鉴定与预定抗原结合的杂交瘤细胞前，进行分泌转换抗体的杂交瘤的筛选。分离表达与预定抗原具有主要结合亲和力的转换抗体的杂交瘤细胞，然后在本领域已知的适宜生长条件下培养(通常为单个选择的克隆)。可选择的，所述方法还可包括在适宜于表达单克隆抗体的条件下培养所选克隆的步骤；收集所述单克隆抗体并可将其用于治疗、预防和/或诊断目的。通常，所选的杂交瘤克隆可作为DNA或RNA源，用于分离编码与预定抗原结合的(或能使其与之结合的)免疫球蛋白(如可变区)的免疫球蛋白序列。随后，可(如通过PCR扩增或从源(如杂交瘤克隆)进行cDNA克隆)分离人可变区编码序列，然后与编码所需人恒定区的序列剪接在一起以编码更适用于人治疗用途的人序列抗体，在所述治疗用途中优选抗体的免疫原性最小。可将含有所得全长人编码序列的多核苷酸在宿主细胞(如来自哺乳动物细胞中的表达载体)中表达，然后纯化用于药物制剂。异增强子能够编码人免疫球蛋白(如重链)的异源转基因最好含有顺式连接的增强子，所述增强子不是衍生于小鼠基因组，和/或不是与所述异源转基因的外显子以顺式天然相连。例如，人κ转基因(如κ小座位)最好含有人Vκ基因、人Jκ基因、人Cκ基因和一异增强子，通常所述异增强子含有人重链内含的增强子和/或鼠重链内含子增强子，通常它们位于Jκ基因和Cκ基因之间，或位于Cκ基因下游。例如可将小鼠重链J-μ内含子增强子(Banerjietal.，(1983)Cell33729)分离在质粒pKVe20.9kbXBaI片段上(参见下文)。可将人重链J-μ内含子增强子(Haydayetal，(1984)Nature307334)分离为1.4kbMluI/HindIII片段(见下文)。将有转录活性的异增强子，如主要由与小鼠J-μ内含子增强子顺式相连的人J-μ内含子增强子组成的结合异增强子加到转基因中，这样可以高水平地表达所述转基因，特别是在所述转基因编码轻链如人κ的情况下。同样，最好将大鼠3’增强子包含在能够编码人重链的小座位构建体中。具体的优选实施方案本发明优选的实施方案是含至少一种、通常2-10、有时25-50或更多拷贝的实施例12所述转基因(pHC1或pHC2)的动物，所述动物是用含单拷贝的实施例5、6、8或14中所述轻链转基因的动物和实施例10所述JH缺失动物繁殖的后代繁殖的。将动物培育至这三个特征均纯合。所述动物具有下列基因型单拷贝(每个单倍体的染色体组)的人重链未重排的小座位(实施例12中所述的)、单拷贝(每个单倍体的染色体组)重排的人κ链构建体(实施例14所述的)、并在除去所有功能性JH片段的各内源小鼠重链座位上有缺失(实施例10所述)。用JH片段缺失(实施例10)纯合的小鼠繁殖所述动物以产生JH缺失纯合和人重链和轻链构建体半合的后代。将所得动物用抗原注射并用其生产抗这些抗原的人单克隆抗体。就人重和轻链而言，从所述动物中分离的B细胞是单特异性的，因为它们只含各基因的一个拷贝。此外，就人或小鼠重链而言，它们是单特异性的，因为由于按实施例9和12所述缺失了JH区，所以两个内源小鼠重链拷贝均是非功能性的。另外，就人或小鼠轻链而言，B细胞的主要馏份也是单特异性的，因为单拷贝的重排的人κ轻链基因的表达从等位基因和同种型上，在B细胞的主要馏份中排除了内源小鼠κ和λ链基因的重排。优选实施方案的转基因小鼠可生产含有库的大部分的免疫球蛋白，理想的是基本上与天然小鼠的相似。因此，例如在内源Ig基因已失活的实施方案中，总的免疫球蛋白水平为约0.1-10mg/ml血清，优选0.5-5mg/ml，理想的至少约1.0mg/ml。在已经将能够使IgM转换成IgG的转基因导入到转基因小鼠中后，成年小鼠血清IgG与IgM的比例优选为约10∶1。当然，在未成熟的小鼠中，IgG与IgM的比例要低些。通常，约10％，优选40-80％以上的脾和淋巴结B细胞仅仅表达人IgG蛋白质。该库理想的是接近非转基因小鼠的，通常至少高达约10％，优选25-50％或更多。通常，主要根据导入到小鼠基因组中的不同V、J和D区的数量，可生产至少约一千个不同的免疫球蛋白(理想的是IgG)，优选104-106或更多。这些免疫球蛋白通常识别一半或更多的高抗原性蛋白质，包括但不限于鸽子细胞色素C、鸡溶菌酶、商陆促分裂原、牛血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白、流感血凝素、葡萄球菌蛋白A、精鲸肌红蛋白、流感神经氨酸酶和λ阻遏物蛋白。其中一些免疫球蛋白与预选抗原的亲和力至少为约107M-1，优选108M-1-109M-1或更高。在一些实施方案中，优选产生具有预定库的小鼠，以对预定抗原的抗体反应所代表的V基因进行有限的筛选。具有预定库的重链转基因可含有例如人VH基因，该基因在人中对预定抗原的抗体反应中被优先使用。或者，由于各种原因(如编码针对预定抗原的高亲和力V区的可能性低；进行体细胞突变和亲和力加强的倾向低；或对某些人是致免疫的)，可从确定的库中除去一些VH基因。由于来自与转基因动物不同的生物种，因此在含各重或轻链基因片段的转基因重排之前，如通过杂交或DNA测序可很容易地鉴定出所述基因片段。可用预定抗原如跨膜蛋白、细胞表面大分子或其它需要人抗体的抗原(如TNF、LPS等)免疫接种本发明的转基因小鼠。所述小鼠将生产B细胞，所述B细胞经转基因内转换重组(顺式转换)进行了类型转换并表达与预定抗原反应的免疫球蛋白。所述免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中重和轻链多肽由人转基因序列编码，所述转基因序列可包含通过体细胞突变和V区重组连接而产生的序列以及种系编码的序列；尽管由于体细胞突变和不同的V-J和V-D-J重组连接，可能存在其它非种系序列，但可以认为这些人序列免疫球蛋白基本等同于由人VL或VH基因片段和人JL或JH片段编码的多肽序列。就所述人序列抗体而言，各链的可变区通常至少80％由人种系V、J(在重链的情况下，还包括D片段)编码；通常至少85％的可变区由转基因上的人种系序列编码；经常90％或95％或更多的可变区由转基因上的人种系序列编码。但是，由于通过体细胞突变和VJ以及VDJ连接而导入了非种系序列，因此人序列抗体通常含有一些不由小鼠种系中的人转基因内的人V、D或J基因片段编码的可变区序列(而在恒定区序列中不常见)。通常，所述非种系序列(或各个核苷酸位置)在CDR中或靠近CDR处成簇，或是在已知体细胞突变成簇的区中。与预定抗原结合的人序列抗体可产生于同种型转换，以便产生含人序列γ链(如γ1、γ2a、γ2b或γ3)和人序列轻链(如κ)的人抗体。所述同种型转换的人序列抗体经常在可变区中含有一个或多个体细胞突变，体细胞突变经常在CDR的约10个残基处或之内，这是亲和力成熟和由于抗原特别是随后二级(或随后)抗原攻击而选择B细胞的结果。这些高亲和力人序列抗体的结合亲和力至少为1×109M-1，一般亲和力为约至少5×109M-1，通常亲和力为至少1×1010M-1，有时为5×1010M-1至1×1011M-1或更高。可将所述高亲和力人序列抗体制备成与人抗原如CD4等人大分子(如人跨膜或细胞表面蛋白或其它细胞表面抗原)有高结合亲和力。可将来自所述小鼠的B细胞用于产生表达高亲和力(大于2×109M-1)的单克隆人序列抗体的杂交瘤，该人序列抗体可以抗各种抗原，包括人蛋白质如CD4等。可用这些杂交瘤生产含有免疫球蛋白的组合物，所述免疫球蛋白与预定人抗原的亲和力常数(Ka)为至少2×109M-1，其中所述免疫球蛋白由下列成分组成具有下列组成的人序列轻链(1)含有多肽序列的轻链可变区，所述多肽序列基本上等同于由人VL基因片段和JL片段编码的多肽序列，和(2)含有多肽序列的轻链恒定区，所述多肽序列基本上等同于人CL基因片段编码的多肽序列；和有下列组成的人序列重链(1)含有多肽序列的重链可变区，所述多肽序列基本上等同于由人VH基因片段、或D区以及人JH片段编码的多肽序列；和(2)含有多肽序列的恒定区，所述多肽序列基本上等同于人CH基因片段编码的多肽序列。通常人序列重链和人序列轻链分别由人重链转基因和人轻链转基因编码，所述转基因被分别整合到小鼠细胞基因组中。但是，两个链可由一个转基因编码，或一个或两个链由多个转基因编码，如由从含VH排列的YAC的V基因片段衍生的人重链转基因(如HC2)编码，所述VH排列不被整合在与小鼠种系中人重链转基因相同的座位上。在一实施方案中，组合物含有免疫球蛋白，所述免疫球蛋白含有具有κ恒定区的人序列轻链和具有γ恒定区的人序列重链。所述小鼠(和从其衍生的杂交瘤)是免疫球蛋白的来源，所述免疫球蛋白与预定人抗原的亲和力常数(Ka)为至少1×1010M-1，其中所述免疫球蛋白由下列成分组成有下列组成的人序列轻链(1)含有多肽序列的轻链可变区，所述多肽序列基本上等同于人VL基因片段和JL片段编码的多肽序列，和(2)含有多肽序列的轻链恒定区，所述多肽序列基本上等同于人CL基因片段编码的多肽序列；和有下列组成的人序列重链(1)含有多肽序列的重链可变区，所述多肽序列基本上等同于人VH基因片段、或D区以及人JH片段编码的多肽序列；和(2)含有多肽序列的恒定区，所述多肽序列基本上等同于人CH基因片段编码的多肽序列。本发明提供了具有下列基因型的转基因小鼠一对纯合的功能性破坏了的内源重链等位基因、一对纯合的功能性破坏了的内源轻链等位基因、至少一个拷贝的异源免疫球蛋白轻链转基因和至少一个拷贝的异源免疫球蛋白重链转基因，其中所述动物在用人抗原免疫后产生抗体反应，其中所述抗体反应含有与预定人抗原的亲和力常数(Ka)为至少2×109M-1的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋自由下列成分组成有下列组成的人序列轻链(1)含有多肽序列的轻链可变区，所述多肽序列基本上等同于人VL基因片段和JL片段编码的多肽序列，和(2)含有多肽序列的轻链恒定区，所述多肽序列基本上等同于人CL基因片段编码的多肽序列；和有下列组成的人序列重链(1)含有多肽序列的重链可变区，所述多肽序列基本上等同于人VH基因片段、或D区以及人JH片段编码的多肽序列；和(2)含有多肽序列的恒定区，所述多肽序列基本上等同于人CH基因片段编码的多肽序列。所述转基因小鼠可生产人序列免疫球蛋白，所述免疫球蛋白与至少一种人体细胞上的人表面或跨膜蛋白质结合，其中所述免疫球蛋白与所述人表面或跨膜蛋白质结合的亲和力常数(Ka)为1.5×109M-1-1.8×1010M-1。所述表面或跨膜蛋白质的一个实例是CD4，尽管根据需要也可以使用其它蛋白质。通过扩展转基因小鼠中人可变区基因片段库的方法，促进了抗预定抗原的高亲和力人序列抗体的发展，所述转基因小鼠具有含有整合的人免疫球蛋白转基因的基因组，所述方法包括将含有V区基因片段的V基因转基因导入到基因组中，所述V基因转基因不存在于所述被整合的人免疫球蛋白转基因中。通常V区转基因是酵母人工染色体，该染色体含有部分人VH或VL(Vκ)基因片段排列，所述排列可能在人基因组中天然存在或可通过重组方法分别剪接在一起，所述排列可含有无序的或删除的V基因片段。通常在YAC中含有至少5个或更多的功能性V基因片段。在该改变中，可通过V库扩展法生产转基因小鼠，其中所述小鼠表达免疫球蛋白链，所述免疫球蛋白链含有由V区转基因上的V区基因片段编码的可变区序列和由人Ig转基因编码的C区。通过V库扩展法，可以产生具有至少5个不同V基因的转基因小鼠；小鼠可含至少24个V基因或更多。当然有些V基因片段可能是无功能的(如假基因等)；如果需要可以保留这些片段或通过本领域专业人员已知的重组方法将其选择性地缺失。在小鼠种系经过遗传工程处理使之含有带扩展V片段库的有功能的YAC后，所述V片段库基本上不存在于含J和C基因片段的人Ig转基因中，将所述特征繁殖并培育到其它遗传背景中，包括将具有扩展的V片段库的功能性YAC培育到含有不同人Ig转基因的小鼠种系中的背景。可将具有扩展的V片段库的多功能性YAC培育到种系中以便与人Ig转基因(或多个人Ig转基因)一起发挥作用。尽管本文称为YAC转基因，但整合到基因组中的所述转基因基本上不含酵母序列，如酵母自我复制所需的序列；在酵母中复制后，不再需要的话(即在导入小鼠ES细胞或小鼠前受精卵之前)，也可将所述序列通过遗传工程方法(如限制消化和脉冲场凝胶电泳或其它适宜的方法)除去。本发明还提供了扩增人序列免疫球蛋白表达之特征的方法，该方法包括培育具有人Ig转基因，或也含有具有扩展的V片段库的功能性YAC的转基因小鼠。VH和VL基因片段均可在YAC上。实践者可将转基因小鼠培育到任何所需的背景中，包括含其它人转基因的背景，所述人转基因含有人Ig转基因和/或编码其它人淋巴细胞蛋白的转基因。本发明还提供了由转基因小鼠生产的高亲和力人序列免疫球蛋白，所述转基因小鼠含有扩展的V区库的YAC转基因。尽管前文描述了本发明转基因动物的优选实施方案，但本文公开的内容，更具体地说，由实施例中描述的转基因定义了其它实施方案。可定义四种转基因动物I.含未重排重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。II.含未重排重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。III含重排重链和未重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。IV含重排重链和重排的轻链免疫球蛋白转基因的转基因动物。在这几种转基因动物中，优选的顺序是II＞I＞III＞IV，其中通过同源重组(或其它方法)已经使内源轻链基因(或至少κ)失效，以及I＞II＞III＞IV，其中内源轻链基因未被失效并必须通过等位排斥而显性化。如上文所讨论的，本发明提供了用于治疗人疾病的人序列单克隆抗体。单克隆抗体的治疗用途参见如LarrickandBourla，JournalofBiologicalResponseModefiers，5379-393，该文献引入本文作为参考。人单克隆抗体的用途包括治疗自身免疫性疾病、癌、感染性疾病、移植排斥、血液病如凝集紊乱和其它疾病。可将本发明的抗体通过蛋白质传递药物领域已知的任何方法施用给患者。抗体特别适用于胃肠道外给药(即皮下、肌肉内或静脉内给药)。本发明的药物组合物也适用于通过其它药物传递方法施用(参见如Langer，Science，2491527-1533(1990))。用于胃肠道外给药的药物组合物通常含有单克隆抗体溶解于可药用载体优选含水载体中的溶液。可以使用各种含水载体，如水、缓冲液、0.4％盐水、0.3％甘油等。这些溶液是无菌的并通常不含颗粒物质。可通过常规的熟知的消毒技术将这些组合物消毒。所述组合物可含有接近生理条件所需的可药用添加成分，如pH调节剂和缓冲剂、张力调节剂等，例如醋酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。根据所选的具体给药方式，抗体在这些制剂中的浓度可在很宽的范围内变化，即从不到约0.5％，通常至少约0.1％-1.5％或2.0％(重量)，而且主要以液体体积、粘度来选择制剂中的抗体浓度。制备胃肠道外给药的组合物的实际方法是本领域专业人员已知的，并在例如Remington’sPharmaceuticalSciences17thEd.MackPublishingCompany，Easton，Pennsylvania(1985)(该文献引入本文作为参考)中有更详细的描述。可以施用含本发明抗体或其混合物的组合物以用于预防和/或治疗。在治疗应用中，以足以治愈或至少部分抑制其感染和其并发症的量，将组合物施用给患者。将足以达到该目的的量定义为“治疗有效量”。有效达到该目的的量通常为约0.05mg/kg体重-约5mg/kg体重，优选约0.2mg/kg-体重至1.5mg/kg体重。在某些情况下，需要修饰本发明的免疫球蛋白分子以改变其生物活性。例如可将免疫球蛋白与其它化疗药物直接或间接结合。可结合各种化疗药物作为靶。例如可结合的抗炎药包括免疫调节剂、血小板激活因子(PAF)拮抗剂、环氧合酶抑制剂、脂质氧合酶抑制剂和白细胞三烯拮抗剂。一些优选的结合基包括环孢菌素A、消炎痛、naproxen、FK-506、酶酚酸等。同样，抗氧化剂如过氧化物歧化酶也可用于治疗再灌注损伤。同样，抗癌剂如柔毛霉素、阿霉素、长春花硷、博莱霉素等也可使用。还可将本发明的抗体用于将两亲物质(amphipaths)(如脂质体)导向患者体内位点。在这些制剂中，待传递的药物被作为脂质体的一部分掺入，在该脂质体中包埋了人单克隆抗体。本发明的人序列单克隆抗体是有用的，部分是因为它们特异性地结合它们所针对的预定抗原。当预定抗原是人抗原(即人蛋白质或其片段)时，如果本发明的人免疫球蛋白也与非人动物中的同源抗原结合，则本发明的抗体就是有利的，所述非人动物特别是指常用于药物试验(如生物活性、药物动力学和安全性的临床前试验)的动物。这些动物包括小鼠、兔、大鼠、狗、猪，特别是非人灵长类如猩猩、类人猿和猴(如恒河猴和cynomolgus猴)。在试验动物中识别抗原的能力对于确定特异性结合对免疫球蛋白生物分布的影响是特别有用的。同源抗原是有下列性质的抗原(i)结构(如氨基酸序列)基本上类似于人抗原(即动物同源蛋白质的氨基酸序列与人蛋白质通常有约50％的一致性，优选至少约70％的一致性，最佳为至少约80％或更高的一致性)；(ii)与人抗原有基本相同的功能；和(iii)通常在与人抗原相同的细胞部分上发现。人和动物同源抗原通常(但不总是)有相同的名称。同源抗原的实例包括人微管蛋白和小鼠微管蛋白、人CD4和恒河猴CD4以及人IgG和大鼠IgG。另一方面，本发明提供了结合抗原的人单克隆抗体，所述单克隆抗体含有至少一条由人工基因编码的多肽。人工基因包括在体外通过化学或酶促方法合成的编码多肽的核酸片段和人工基因的子代(通过复制)，即全部合成的核酸，所述化学或酶促方法不需要细胞衍生的模板核酸链(如从细菌细胞和免疫或杂交瘤细胞达到的核酸模板)。尽管在遗传工程中，用短的合成核酸作为引物、接头等是常规的，但还可以通过化学和/或酶促方法产生完全合成的长为30、50或更多碱基的编码蛋白质的核酸。本发明的人工基因可包括合成的核酸区和细胞衍生的核酸区。人工基因的合成核酸区通常至少约50个碱基，一般至少约100个碱基，常常至少约200个碱基，经常的是至少约250个碱基，且通常超过300个碱基或400个碱基。通常合成的核酸区编码可变基因片段或其部分，如CDR区，恒定区通常由细胞衍生的核酸编码。用编码多肽的人工基因，可方便地表达免疫球蛋白多肽(即免疫球蛋白重链和免疫球蛋白轻链)。通常人工基因与转录启动子序列，如衍生于免疫球蛋白基因或病毒(如SV40、CMV、HIV、RSV)的启动子序列或杂种启动子可操作相连。还可将人工基因与其它序列如聚腺苷酸化序列和内含子相连。表达免疫球蛋白多肽的一种方法包括将编码免疫球蛋白多肽一个区(如可变区或其片段)的合成核酸插入到载体中，所述载体编码免疫球蛋白链的剩余片段或部分(如μ、γ、γ2、γ3、γ4、δ、ε、α1、α2)，以及启动子(如CMV(细胞肥大病毒)启动子)、聚腺苷酸化或其它序列。构建所述载体以便在导入细胞后，载体序列的细胞转录和翻译产生免疫球蛋白多肽。用人工基因可构建有功能的人序列免疫球蛋白重和轻链基因以及多肽，并用其生产具有所需特异性(如与预定抗原的结合特异性)的免疫球蛋白。这可通过构建人工基因来完成，所述人工基因编码与细胞或杂交瘤表达的多肽基本相似的免疫球蛋白多肽，所述细胞或杂交瘤来自用预定抗原免疫的转基因动物。因此，本发明提供了编码免疫球蛋白多肽的人工基因以及用人工基因生产人序列免疫球蛋白的方法。根据该方法，将转基因动物(如具有一对纯合的功能性破坏了的内源重链等位基因、一对纯合的功能性破坏了的内源轻链等位基因、至少一个拷贝的人免疫球蛋白轻链转基因和至少一个拷贝的人免疫球蛋白重链转基因的转基因小鼠)用预定的抗原如人抗原免疫接种。然后从发生免疫球蛋白基因重排的一个细胞或细胞群中收集或分离核酸，优选mRNA，确定编码免疫球蛋白重和/或轻链(特别是V片段)的核酸序列或其部分。用该序列资料作为人工基因序列的基础。序列确定通常需要分离所需基因或cDNA的至少一部分，如重排的人转基因的一部分或编码免疫球蛋白多肽的相应cDNA的一部分。通常这要求克隆编码人免疫球蛋白多肽的DNA，或优选mRNA(即cDNA)。用标准技术(参见Sambrooketal.，(1989)分子克隆实验室手册，1-3卷，冷泉港出版社，该文献引入本文作为参考)完成克隆。例如通过polyA+mRNA，优选膜相关mRNA的反转录来构建cDNA文库，然后用对人免疫球蛋白多肽基因序列特异的探针筛选所述文库。但在优选的实施方案中，用聚合酶链反应(PCR)扩增编码所需免疫球蛋白基因片段(如轻链可变片段)的cDNA(或全长cDNA的一部分)。由于本领域专业人员很容易得到人免疫球蛋白多肽基因的序列，因此可很容易设计出特异性地与人免疫球蛋白基因或其片段杂交的探针或扩增该人免疫球蛋白基因或其片段用的PCR引物。参见例如Tayloretal.，Nuc.Acids.Res.，206287(1992)，该文献引入本文作为参考。此外，转基因小鼠的人转基因序列通常对实施者而言是已知的，因此可以选择与转基因的适宜区杂交的引物序列。很容易将扩增的序列克隆到任何适宜的载体，如表达载体、小基因载体或噬菌体展示载体中。应理解所用的具体克隆方法并不重要，只要它可以确定所需免疫球蛋白多肽某一部分的序列即可。如本文所述，将经克隆、扩增、标记的或不同于背景以便所需核酸的序列可被测定的核酸看作是分离的核酸。用于克隆并测序的RNA的一个来源是通过获得转基因小鼠的B细胞并将B细胞与无限增殖细胞融合而得到的杂交瘤。使用杂交瘤的优点是很容易对杂交瘤进行筛选，并且杂交瘤生产所需的人单克隆抗体。或者可从被免疫动物的B细胞(或全脾)中分离RNA。当使用杂交瘤以外的来源时，还需要筛选编码具有特异性结合特征之免疫球蛋白或免疫球蛋白多肽的序列。用于所述筛选的一种方法是使用噬菌体展示技术。噬菌体展示描述于如Doweretal.，WO91/17271，McCaffertyetal.，WO92/01047，和CatonandKoprowski，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，876450-6454(1990)，所述文献均引入本文作为参考。在采用适宜噬菌体展示技术的一个实施方案中，分离来自被免疫的转基因小鼠的cDNA(如全脾cDNA)，用聚合酶链反应扩增cDNA序列，所述序列编码部分免疫球蛋白多肽的一部分，如CDR区，然后将扩增的序列插入到噬菌体载体中。用标准技术如淘选来鉴定编码所需肽，如具有所需结合特征的可变区肽的cDNA。然后确定经过扩增或克隆的核酸序列。通常确定编码免疫球蛋白多肽全部可变区的序列，但有时只确定部分可变区如CDR-编码区部分就足够了。通常测序的部分至少30个碱基长，优选对至少1/3或至少一半可变区的编码碱基进行测序。可对从cDNA文库分离的克隆进行测序，或使用PCR时，在亚克隆扩增序列后进行测序或对扩增的片段进行直接PCR测序。用标准技术(参见例如Sambrooketal.，(1989)分子克隆实验室手册，1-3卷，冷泉港出版社，以及Sanger，F.etal.，(1977)Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467，该文献引入本文作为参考)完成测序。将克隆的核酸序列与公开的人免疫球蛋白基因和cDNA序列进行比较，根据已测序的区域，本领域专业人员很容易确定(i)杂交瘤免疫球蛋白多肽(包括重链的同种型)的种系片段用法和(ii)重和轻链可变区序列，包括因N-区添加和体细胞突变而产生的序列。免疫球蛋白基因序列资料的一个来源是国家生物技术信息中心，国家药物库，国家健康研究所，Bethesda，Md。在另一实施方案中，通过直接蛋白质测序来确定所需免疫球蛋白的氨基酸序列。可构建一人工基因，所述人工基因含有等同于或基本上类似于至少部分表达免疫球蛋白之基因(即重排的转基因)的序列。同样，人工基因可编码等同于或基本相似于由重排转基因的已被测序部分编码的多肽的多肽。遗传密码的简并性使得相同的多肽可以由多个核酸序列编码。有时需要改变核酸序列，例如以导入限制位点、改变密码子的使用，以反映特定的表达系统，或除去糖基化位点。另外，可在杂交瘤序列中导入改变以改变免疫球蛋白的特征(如结合特征)。例如，可将改变导入特别是重和轻链可变区的CDR区中，以提高免疫球蛋白与预定抗原的亲和力。构建合成核酸的方法是熟知的。尽管全部都用化学合成是可能的，但通常用混合的化学-酶促合成法，其中将化学合成的寡核苷酸用于连接反应和/或聚合酶链反应以得到较长的多核苷酸。在最优选的实施方案中，用所选的重叠引物完成聚合酶链反应以便扩增的结果是含有人工基因所需之序列的DNA。可用固相或在溶液中合成本发明的寡核苷酸。通常固相合成是优选的。有关通过亚磷酸三酯、磷酸三酯和H-膦酸酯固相合成寡核苷酸的方法的详细描述非常多。参见例如Itakura，美国专利4401796；Caruthers等美国专利4458066和4500707；Beaucage等，TetrahedronLett.，221859-1862；Matteuccietal.，J.Amer.Chem.Soc.，1033185-3191(1981)；Caruthers等，GeneticEngineering，41-17(1982)；Jones，第2章，Atkinson等，第3章，和Sproat等，第4章，在Gait编的OligonucleotideSysthesisApracticalApproach，IRLPress，Washington，D.C.(1984)；Froehler等，TetrahedronLett.，27469-472(1986)；Froehler等，NucleicAcidsRes.，145399-5407(1986)；Sinha等，TetrahedronLett；245843-5846(1983)；andSinha等，NucleicAcidsRes.，124539-4557(1984)，所述文献均引入本文作为参考。可将人工基因导入细胞中，并表达以生产免疫球蛋白多肽。用于表达的细胞类型的选择取决于许多因素(如所需的蛋白质糖基化水平)，但优选能够分泌人免疫球蛋白的细胞。特别优选的细胞包括CHO细胞和骨髓瘤衍生的细胞如SP20和NS0细胞系。标准细胞培育是熟知的，并描述于Newman等，Biotechnology101455-1460(1992)；Bebbington等Biotechnology10169-175(1992)；Cockett等，Biotechnology，8662-667(1990)；Carter等，Biotechnology10163-167(1992)，各文献均引入本文作为参考。导入核酸如人工基因的方法是熟知的，包括转染(如通过电穿孔或脂质体介导)和转化。在Sambrook等(同上文)的书中全面描述了导入基因的表达系统。经常需要在同一细胞中表达两种免疫球蛋白多肽(即重链和轻链)，以便在体内生产免疫球蛋白(如IgG分子)。因此，有时需要将两种人工基因(即一个编码重链，一个编码轻链)导入细胞中。(可将两种人工基因导入同一个载体上)。或者，可将编码一种免疫球蛋白多肽的人工基因导入已经经过遗传工程加工而表达另一免疫球蛋白多肽的细胞中。显然，由于人工基因经转染导入其中的细胞的繁殖，人工基因全部的合成核酸部分都会作为复制和转录的模板。然而，如本文所用的，认为来源于合成核酸(即通过不需要细胞衍生的核酸模板链的化学或酶促方法，体外合成的编码多肽的核酸分子)的子代基因也是人工基因。因此，人工基因的合成部分与杂交瘤表达的转基因间的关系是一种其中只有信息联系(即序列信息)而没有直接的物理联系的关系。本发明还提供了用于治疗和诊断，特别是治疗人疾病的抗-CD4单克隆抗体。CD4是主要在胸腺细胞和T细胞中表达的细胞表面蛋白，它与T细胞功能和MHCII型抗原的识别有关。抗CD4的抗体可降低CD4细胞的活性，因此可降低不需要的自身免疫反应、炎性反应和移植器官的排斥。事实上，已经表明，施用抗-CD4单克隆抗体可防止(Wofsy，等，J.Exp.Med.，161378-391(1985).)或逆转(Wofsy，等，J.Immunol.，1383247-3253(1987)，Waldor等，Science，227415-417(1985))动物模型中的自身免疫疾病。给类风湿性关节炎患者施用鼠或嵌合抗-CD4单克隆抗体有显著的临床效果(Knox.，etal.，Blood，7720-30(1991)；Goldberyetal.，J.Autoimmunity，4617-630；Herzogetal.，Lancet，ii1461-1462；Horneff，etal.，ArthritisRheum.34129-140；Reiter，etal.，ArthritisRheum.34525-536；Wendingetal，J.Rheum.18325-327；VanderLubbeetal.，ArthritisRheum.381097-1106；VanderLubbeetal.，ArthritisRheum.361375-1379；Morelandetal.，ArthritisRheum.36307-318，andChoyetal，ArthritisandRheumatism，39(1)52-56(1996)；所有文献均引入本文作为参考)。另外，如上所述，已经表明嵌合抗一CD4单克隆抗体在患真菌样霉菌病的患者中有一些临床效果(Knoxetal.，(1991)Blood7720；该文献引入本文作文参考)。在Newman等的生物技术，101455-1460(1992)(该文献引入本文作为参考)中也讨论了抗CD4抗体。实验实施例方法和材料按照Hoganetal.，“操作小鼠胚胎实验室手册”(冷泉港实验室，该文献引入本文作为参考)的方法得到转基因小鼠。按照公开的方法(Teratocarcinomasandembryonicstemcellapracticalapproach，E.J.Robertson，ed.，IRLPress，Washington，D.C.，1987；Zjilstraetal.，Nature342435-438(1989)；andSchwartzbergetal.，Science246799-803(1989)，所述文献均引入本文作为参考)操作胚胎干细胞。按照J.Sambrooketal.，分子克隆实验室手册，第二版，1989，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.(该文献引入本文作为参考)所述完成DNA克隆步骤。按照制造商提供的说明，用AppliedBioSystems寡核苷酸合成仪合成寡核苷酸。按照“抗体实验室手册”，EdHarlowandDavidLane，冷泉港实验室(1988)(该文献引入本文作为参考)所述，操作杂交瘤细胞和抗体。实施例1基因组重链人Ig转基因本实施例描述人基因组重链免疫球蛋白转基因的克隆和显微注射，将所述转基因注射到鼠受精卵中。按Marzluff等(“TranscriptionandTranslationaPracticalApproach”，B.D.HammesandS.J.Higgins，eds.，pp.89-129，IRLPress，Oxford(1985))所述从新鲜人胎盘组织中分离核。将分离的核(或PBS洗涤的人精母细胞)包埋入低熔点的琼脂糖基质中，用EDTA和蛋白酶κ溶解以暴露高分子量的DNA，然后按M.FinneyinCurrentProtocolsinMolecularBiology(F.Ausubel，etal.，eds，JhonWiley&amp;Sons，Supp.4，1988，Section2.5.1)中所述在琼脂糖中用限制酶NotI消化。然后按照Anand等，Nucl.AcidsRes.173425-3433(1989)所述，用脉冲场凝胶电泳分级分离NotI消化的DNA。通过Southern杂交检测富集的NotI片段馏分以检测一个或多个由该片段编码的序列。所述序列包含重链D片段、J片段、μ和γ1恒定区以及所有6个VH家族的代表(尽管Berman等，(1988)同上文，从Hela细胞中将该片段定义为670kb片段，我们从人胎盘中发现该片段为830kb的精DNA)。合并含NotI片段的那些馏分，然后克隆到酵母细胞中pYACNN载体的NotI位点。通过用EcoRI消化pYAC-4Neo(Cooketal.，Nucl.AcidsRes.1611817(1988))然后在寡核苷酸5’-AATTGCGGCCGC-3’存在的条件下进行连接来制备质粒pYACNN。按Brownstein等Science2441348-1351(1989)和Green等，Prox.Natl.Acad.Sci.USA871213-1217(1990)(所述文献引入本文作为参考)所述分离含重链NotI片段的YAC克隆。按M.Finney(出处同上)所述，通过脉冲场凝胶电泳从高分子量酵母DNA中分离克隆的NotI插入片段。通过加入1mM精胺浓缩DNA，并直接微注射到前述单细胞胚胎核中。实施例2通过体内同源重组形成的基因组κ轻链人Ig转基因Lorenz等Nucl.AcidsRes.159667-9677(1987)(该文献引入本文作为参考)中描述了人κ轻链的图谱。分离含所有Cκ、3’增强子和所有J片段以及至少5个不同V片段的450kbXnoI-NotI片段，然后显微注射到实施例1所述的单细胞胚胎核中。实施例3通过体内同源重组形成的基因组κ轻链人Ig转基因按实施例1所述分离包含所有上述片段加至少20或更多V片段的750kbMluI-NotI片段，然后用BssHII消化以产生与400kb的片段。450kbXnoI-NotI片段和大约400kbMluI-NotI片段含有BssHII和XnoI限制性位点所确定的序列重叠。在显微注射到小鼠受精卵中后，这两个片段的同源重组得到含至少增加了15-20个V片段的转基因，所述V片段发现于450kbXnoI/NotI片段(实施例2)上。实施例4构建重链小座位A.构建pGP1和pGP2用EeoRI和StyI消化pBR322，然后与下列寡核苷酸连接以产生含图8所示限制性位点的147bp插入片段的pGP1。在图9中也列出了这些寡核苷酸的一般重叠。所示寡核苷酸是oligo-15′-CTTGAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGCATACTGCGGCC-3′oligo-25′-GCAATGGCCTGGATCCATGGCGCGCTAGCATCGATATCTAGAGCTCGAGCA-3′oligo-35′-TGCAGATCTGAATTCCCGGGTACCAAGCTTACGCGTACTAGTGCGGCCGCT-3′oligo-45′-AATTAGCGGCCGCACTAGTACGCGTAAGCTTGGTACCCGGGAATT-3′oligo-55′-CAGATCTGCATGCTCGAGCTCTAGATATCGATGCTAGCGCGCCATGGATCC-3′oligo-65′-AGGCCATTGCGGCCGCAGTATGCAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCT-3′该质粒含一个大型多接头，该多接头侧翼为稀少的NotI切割位点以构建可从载体序列中分离的大插入片段以便进行显微注射。该质粒是以pBR322为基础的，pBR322与pUC为基础的质粒相比，拷贝数相对较少(pGP1保留了靠近复制原点的pBR322拷贝数控制区)。低拷贝数降低了插入片段的潜在毒性。另外，pGP1含有衍生于trpA(Christieetal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA784180(1981))的强转录终止序列，该序列插入在氨苄青霉素抗性基因与多接头之间。这样通过抑制从氨苄青霉素启动子开始的连读转录而进一步降低了与某些插入片段有关的毒性。质粒pGP2衍生于pGP1，以便将另一限制性位点(SfiI)导入多接头。用MluI和SpeI消化pGP1以切割质粒多接头部分的识别序列。将下列衔接子寡核苷酸连接到由此消化的pGP1中以形成pGP2。5′CGCGTGGCCGCAATGGCCA3′5′CTAGTGGCCATTGCGGCCA3′除含有位于MluI和SpeI位点之间的另一SfiI位点外，pGP2等同于pGP1。这样可以用SfiI和NotI完全切割插入片段。B.构建pRE3(大鼠3’增强子)在重链构建体中包含位于大鼠恒定区下游的增强子序列。分离并克隆Petterson等Nature344165-168(1990)(本文引用作为参考)所述的重链区3’增强子。用下列寡核苷酸PCR扩增大鼠IGH3’增强子序列5′CAGGATCCAGATATCAGTACCTGAAACAGGGCTTGC3′5′GAGCATGCACAGGACCTGGAGCACACACAGCCTTCC3′用BamHI和SphI消化由此形成的编码3’增强子的双链DNA，然后克隆到BamHI/SphI切割的pGP2以产生pRE3(大鼠增强子3’)。C.克隆人J-μ区通过组合分离自λ噬菌体插入片段的两个或多个片段来克隆该区的实质部分。见图9。用寡核苷酸GGACTGTGTCCCTGTGTGATGCTTTTGATGTCTGGGGCCAAG从人基因组DNA文库中分离包含所有人J片段的6.3kbBamHI/HindIII片段(Matsudaetal.，EMBOJ.71047-1051(1988)；Ravetechetal.，Cell27583-591(1981)，所述文献引入本文作为参考)。用寡核苷酸CACCAAGTTGACCTGCCTGGTCACAGACCTGACCACCTATGA相似地分离相邻的10kbHindIII/BamII片段，该片段含有增强子、转换和编码外显子的恒定区(Yasuietal.，Eur.J.Immunol.191399-1403(1989))。用克隆pMUM插入片段(pMUM是用寡核苷酸CCTGTGGACCACCGCCTCCACCTTCATCGTCCTCTTCCTCCTmu膜外显子1从人基因组DNA文库中分离的4kbEcoRI/HindIII片段)作探针相似地分离相邻3’1.5kbBamHI片段，然后克隆到pUC19中。用BamHI和BglII消化pGP1，然后用牛肠碱性磷酸酶处理。将图9中的片段(a)和(b)克隆到消化的pGP1中。然后分离正向克隆以便用BamHI/Bgl融合破坏5’BamHI位点。将其鉴定为pMU(参见图10)。用BamHI消化pMU，并插入从图9中的片段(c)。用HindIII消化来检查方向。所得的质粒pHIG1(图10)含有编码J和Cμ片段的18kb插入片段。D.克隆Cμ区用BamHI和HindIII消化pGP1，然后用牛肠碱性磷酸酶处理(图14)。将图14所处理的片段(b)和图14的片段(c)克隆到BamHI/HindIII切割的pGP1中。用HindIII消化来检查片段c的合适方向以形成pCON1，pCON1含有编码Cμ区的12kb插入片段。而pHIG1在其18kb的插入片段中含有J片段、转换和μ序列，该插入片段在多接头中含有SfiI3’和SpeI5’位点，多接头侧翼为NotI位点，用于重排VDJ片段。pCON1相同，但区别是它没有J区并只含有一12kb插入片段。下文将描述用pCON1构建含重排VDJ片段的片段。E.γ-1恒定区的克隆(pREG2)图16中描述了人γ-1区的克隆。Yamamura等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA832152-2156(1986)报道了从转基因构建体表达人膜结合的γ-1，所述构建体已经被部分整合缺失。其结果表明3’BamHI位点描述了一个序列，该序列包含跨膜重排和转换拷贝的γ基因，该基因含有不到5kb的V-C内含子。因此，在未重排、未转换的基因中，全长转换区被包含在第一γ-1恒定外显子5’端的不到5kb的序列中。因此，它被包含在5’5.3kbHindIII片段(Ellisonetal.，NucleicAcidsRes.104071-4079(1982)该文献引入本文作为参考)中。Takahashi等，Cell29671-679(1982)(该文献引入本文作为参考)还报道该片段含有转换序列，而且该片段与7.7kbHindIII-BamHI片段一起必须包含我们用于转基因构建体所需的所有序列。内含子序列是在具体基因内含子中的，至少15个连续核苷酸的核苷酸序列。用下列γ-1第三外显子(CH3)特异性的寡核苷酸鉴定并分离含γ-1区的噬菌体克隆。5′TGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGG3′将7.7kbHindIII-BglII片段(图11中的片段(a))克隆到HindIII/BglII切割的pRE3中以形成pREG1。将上游5.3kbHindIII片段(图11中的片段(b))克隆到HindIII消化的pREG1以形成pREG2。用BamHI/SpeI消化证实正确的方向。F.组合Cγ和Cμ前述质粒pHIG1含有人J片段和Cμ恒定区外显子。为了提供含Cμ恒定区基因片段的转基因，用SfiI消化pHIG1(图10)。用SfiI消化质粒pREG2以产生含人Cγ外显子和大鼠3’增强子序列的13.5kb插入片段。组合这些序列以产生质粒pHIG3’(图12)，在31.5kb的插入片段中，该质粒含人J片段、人Cμ恒定区、人Cγ1恒定区和大鼠3’增强子。通过用SfiI消化pCON1并将其与用SfiI消化pREG2所得的含人Cγ区和大鼠3’增强子的SfiI片段组合，构建编码人Cμ和Cγ1，而不编码J片段的第二质粒。所得质粒pCON(图12)含有26kbNoyI/SpeI插入片段，该插入片段含有人Cμ、人Cγ1和大鼠3’增强子序列。G.克隆D片段图13中描述了用于克隆人D片段的策略。用多样性区序列特异性探针从含D片段的人基因组文库中鉴定并分离噬菌体克隆(Ichiharaetal.，EMBOJ.74141-4150(1988))。用下列寡核苷酸DXP15′-TGGTATTACTATGGTTCGGGGAGTTATTATAACCACAGTGTC-3′DXP45′-GCCTGAAATGGAGCCTCAGGGCACAGTGGGCACGGACACTGT-3′DN45′-GCAGGGAGGACATGTTTAGGATCTGAGGCCGCACCTGACACC-3′用寡核苷酸DXP1从鉴定的噬菌体克隆中分离含DLR1、DXP1、DXP′1和DA1的5.2kbXhoI片段(图13中片段(b))。用寡核苷酸DXP4从鉴定的噬菌体克隆中分离含DXP4、DA4和DK4的3.2kbXbaI片段(图13中片段(c))。组合图13中的片段(b)、(c)和(d)，然后克隆到pGP1的XbaI/XhoI位点以形成含10.6kb插入片段的pHIG2。依次完成该克隆。首先用牛肠碱性磷酸酶处理图13中的5.2kb片段(b)和图13中的2.2kb片段(d)，然后克隆到用XhoI和XbaI消化的pGP1中。用5.2kb和2.2kb插入片段筛选所得的克隆。正如用BamHI消化确定的，试验阳性的带5.2kb和2.2kb插入片段的克隆，其中一半以适当的方向含有5.2kb插入片段。然后将图13中的3.2kbXbaI片段克隆到含片段(b)和(d)的该中间质粒以形成pHIG2。该质粒含有克隆到多接头中的多样性片段，所述多接头含有特有的5‘SfiI和特有的3’SpeI位p105序列(1)点。整个多接头两侧翼为NotI位点。H.构建重链小座位下文描述含一个或多个V片段的人重链小座位的构建。用下列寡核苷酸分离未重排的V片段，该片段对应于Newkirk等(J.Clin.Invest.811511-1518(1988)，该文献引入本文作为参考)的杂交瘤中所含的V片段5′-GATCCTGGTTTAGTTAAAGAGGATTTTATTCACCCCTGTGTC-3′确定未重排V片段的限制图谱以鉴定特有的限制位点，所述位点在消化后可提供约2kb的DNA片段，所述片段含有未重排的V片段以及5’和3’侧翼序列。5’引物将包含启动子和其它调节序列，而3’侧翼序列提供用于V-DJ连接所必需的重组序列。将所述约3.0kbV片段克隆到pGB2的多接头中以形成pVH1。SfiI消化pVH1，将所得的片段克隆到pHIG2的SfiI位点以形成pHIG5’。由于pHIG2只含有D片段，因此所得的pHIG5’质粒含有单个V片段以及D片段。pHIG5所含插入片段的大小是10.6kb加V插入片段的大小。通过用NotI和SpeI消化切割来自pHIG5的插入片段，然后分离。用SpeI和NotI消化含J、Cμ和Cγ1片段的pHIG3’，分离含所述序列和大鼠3’增强子序列的3kb序列。组合这两个片段，然后连接到NotI消化的pGB1中以产生pHIG，pHIG含有编码V片段、9个D片段、6个功能性J片段、Cμ、Cγ1和大鼠3’增强子的插入片段。该片段的大小近似43kb加V插入片段的大小。I.通过同源重组构建重链小座位如上部分所述，在使用单个V片段时，pHIG的插入片段约43-45kb。该插入片段的大小在或接近很容易克隆到质粒载体中的限制。为了提供更多的V片段，下面描述重叠DNA片段的体内同源重组，所述DNA片段在受精卵或ES细胞内进行同源重组后，形成含大鼠3’增强子、人Cμ、人Cγ1、人J片段、人D片段和多个人V片段的转基因。用下列衔接子将含人J片段(参见图9中片段(a))的6.3kbBamHI/HindIII片段克隆到Mlu/SpeI消化的pHIG5’中5′GATCCAAGCAGT3′5′CTAGACTGCTTG3′5′CGCGTCGAACTA3′5′AGCTTAGTTCGA3′所得的质粒命名为pHIG5’O(重叠)。该质粒中所含的插入片段含有人V、D和J片段。当使用来自pVH1的单个V片段时，该插入片段的大小接近17kb加2kb。分离该插入片段并与含人J、Cμ、γ1和大鼠3’增强子序列的pHIG3’的插入片段组合。两个插入片段均含有人J片段，这样在两个DNA片段之间，提供了约6.3kb的重叠。当共注射到小鼠受精卵中时，发生体内同源重组，产生等同于pHIG中所含之插入片段的转基因。该方法可将多个V片段加入到在体内形成的转基因中。例如，不将单个V片段插入到pHIG5’中，而将包含在下列组成中的多个V片段克隆到pHIG2的SfiI位点以产生pHIG5’VN(1)分离的基因组DNA，(2)衍生于基因组DNA的连接的DNA，或(3)编码合成的V片段库的DNA。然后将图9的J片段(a)克隆到pHIG5’VN中，分离插入片段。该插入片段现在含有多个V片段以与分离自pHIG3’所含之插入片段上所含的J片段重叠的J片段。当共同导入小鼠受精卵核后，发生同源重组以体内产生转基因，所述转基因编码多个V片段和多个J片段、多个D片段、Cμ、Cγ1(均来自人)和大鼠3’增强子序列。实施例5构建轻链小座位A.构建pEμ1图16中描述了pEμ1的构建。用下列寡核苷酸从噬菌体克隆中分离在XbaI-EcoRI678bp片段上的小鼠重链增强子(Banerjietal.，Cell33729-740(1983))5′GAATGGGAGTGAGGCTCTCTCATACCCTATTCAGAACTGACT3′将该Eμ片段克隆到通过补平EcoRI位点，用EcoRV/XbaI消化的pGP1中。将所得质粒命名为pEmul。B.构建κ轻链小座位构建体含有至少一个人Vκ片段、所有5个人Jκ片段、人J-Cκ增强子、人κ恒定区外显子，而且理想的，人3’κ增强子(Meyeretal.，EMBOJ.81959-1964(1989))。小鼠中的κ增强子在Cκ下游9kb。但在人类中尚未鉴定出。另外，该构建体含有一个拷贝的小鼠重链J-Cμ增强子。从下列4个组成片段构建小座位(a)16kbSmaI片段，与小鼠座位类型，该片段含人Cκ外显子和3’人增强子；(b)5’相邻的5kbSmaI片段，该片段含所有5个J片段；(c)包含从pEμ1中分离的小鼠重链内含子增强子(包含该序列以在B细胞发育中尽可能早地诱导轻链构建体的表达。由于重链基因转录早于轻链基因，该重链增强子可能在比内含子κ增强子早的阶段有活性)；和(d)含一个或多个V片段的片段。按如下制备该构建体。用SmaI消化人胎盘DNA，然后在琼脂糖凝胶上通过电泳分级分离。同样，用BamHI消化人胎盘DNA，然后通过电泳分级分离。从SmaI消化的凝胶中分离16kb的馏分，从含用BamHI消化的DNA中分离11kb区。将16kbSmaI馏分克隆到已用XhoI消化，用Klenow片段DNA聚合酶处理以补平XhoI限制消化产物的λFIXII(Stratagene，LaJolla，Califomia)中。16kbSmaI馏分的连接破坏了SmaI位点和XhoI位点的完整。将11BamHI馏分克隆到克隆前用BamHI消化的λEMBL3(Stratagene，LaJolla，California)中。用下列Cκ特异性寡核苷酸检测来自各文库的克隆5′GAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTG3′将16kbXhoI插入片段亚克隆到XhoI切割的pEμ1中以便Cκ与SmaI位点相邻。将所得的质粒命名为pKap1。用上述Cκ特异性寡核苷酸检测λEMBL3/BamHI文库以鉴定一11kb的克隆。将5kbSmaI片段(图20的片段(b))亚克隆并随后插入用SmaI消化的pKap1中。将含正确方向的J片段、Cκ和Eμ增强子的那些质粒命名为pKap2。此后将一个或多个Vκ片段亚克隆到pKap2的MluI位点以产生质粒pKapH，该质粒编码人Vκ片段、人Jκ片段、人Cκ片段和人Eμ增强子。NotI消化pKapH切割该插入片段，然后用琼脂糖凝胶电泳纯化。将由此纯化的插入片段显微注射到前述小鼠受精卵的前核中。C.通过体内同源重组构建κ轻链小座位将11kbBamHI片段克隆到BamHI消化的pGP1中以便3’末端朝向SfiI位点。将所得的质粒命名为pKAPint。将一个或多个Vκ片段插入到pKAPintBamHI和SpeI位点之间的多接头中以形成pKapHV。通过用NotI消化切割pKapHV的插入片段，然后纯化。通过用NotI消化切割pKap2的插入片段，然后纯化。每个片段均含有同源区，即来自pKapHV的片段含有5kb的DNA序列，该DNA序列含有与得自pKap2的插入片段中所含的5kbSmaI片段基本上同源的Jκ片段。这样，这些插入片段在微注射到小鼠受精卵中时能够同源重组以形成编码Vκ、Jκ和Cκ的转基因。实施例6分离对应于免疫球蛋白κ轻链基因之重排和表达拷贝的基因组克隆本实施例描述从表达所需免疫球蛋白的培养细胞中克隆免疫球蛋白κ轻链基因。所述细胞可含有给定免疫球蛋白基因的多个等位基因。例如，杂交瘤可含有4个拷贝的κ轻链基因，两个拷贝来自融合的配对细胞系，两个拷贝来自表达所需免疫球蛋白的源B细胞。这4个拷贝之中，只有一个编码所需的免疫球蛋白，尽管事实上，其中的一些可能被重排过。本实施例中所述的方法可以选择性地克隆κ轻链的表达拷贝。A.双链cDNA将来自杂交瘤或淋巴瘤的细胞或其它合成带κ轻链的IgM的细胞表面或分泌形式或两种形式的细胞系用于分离polyA+RNA。然后用反转录酶(有关常规方法参见Goodspeedetal.，(1989)Gene761；Dunnetal.，(1989)J.Biol.Chem.26413057)将该RNA用于合成寡核苷酸dT引发的cDNA。然后分离单链cDNA，用多核苷酸末端转移酶将G残基加到3’末端。然后纯化G结尾的单链cDNA，并用作用下列寡核苷酸为引物的第二条链合成的模板(用DNA聚合酶催化的)5′-GAGGTACACTGACATACTGGCATGCCCCCCCCCCCC-3′分离双链cDNA，并用于确定mRNA5’末端的核苷酸序列，所述mRNA编码所表达免疫球蛋白分子的重和轻链。然后分离这些表达基因的基因组克隆。在下文部分B中说明了克隆所表达轻链基因的方法。B.轻链将部分A中所述的双链cDNA变性，并用作第三轮DNA合成的模板，该合成使用下列寡核苷酸引物5＇-GTACGCCATATCAGCTGGATGAAGTCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCA-3′该引物含有κ轻链信使(TCATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGCA)的恒定区部分以及特有序列特异性的序列，该序列可作为PCR扩增新合成的DNA链(GTACGCCATATCAGCTGGATGAAG)的模板。用下列两个寡核苷酸引物，通过PCR扩增所述序列5′-GAGGTACACTGACATACTGGCATG-3′5′-GTACGCCATATCAGCTGGATGAAG-3′然后通过凝胶电泳纯化PCR扩增的序列，并用作双脱氧测序反应的模板，该反应用下列寡核苷酸作为引物5′-GAGGTACACTGACATACTGGCATG-3′然后将序列的前42个核苷酸用于合成特有的探针，用该探针分离转录出免疫球蛋白信使的基因。下文将该DNA的合成的42个核苷酸的片段称为o-κ。进行DNASouthern印迹，从表达Ig的细胞系中分离并用包括SmaI的数种限制核酸内切酶逐个并成对组合消化，然后用32-P标记的特有寡核苷酸o-κ进行检测。在重排V片段的上游鉴定了一个特有的限制核酸内切酶位点。然后用SmaI和第二种酶(如果在V片段内有SmaI，就用BamHI或KpnI)切割来自Ig-表达细胞系的DNA。用T4DNA聚合酶处理任何所得的非平整末端以得到有平整末端的DNA分子。然后加入编码接头的限制位点(根据片段中不存在的位点，来选择BamHI.、EcoRI或XhoI)，并用相应的接头酶切割以得到带有BamHI.、EcoRI或XhoI的末端。然后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA进行大小分级分离，接着将含有覆盖所表达V片段之DNA片段的馏份克隆到λEMBL3或λFIX(Stratagene，LaJolla，California)中。用特有的探针o-κ分离含V片段的克隆。从阳性克隆中分离DNA，然后亚克隆到pKap1的多接头中。将所得克隆称为pRKL。实施例7分离对应于免疫球蛋白μ重链基因之重排的表达拷贝的基因组克隆本实施例描述从表达所需免疫球蛋白的培养细胞中克隆免疫球蛋白μ重链基因。本实施例中所述的方法可以选择性地克隆μ重链基因的表达拷贝。按本文前述制备并分离双链cDNA。将双链cDNA变性并用作第三轮DNA合成的模板，该合成使用下列寡核苷酸引物5′-GTACGCCATATCAGCTGGATGAAGACAGGAGACGAGGGGGAAAAGGGTTGGGGCGGATGC-3′该引物含有μ重链信使(ACAGGAGACGAGGGGGAAAAGGGTTGGGGCGGATGC)的恒定区部分以及特有序列特异性的序列，该序列可作为PCR扩增新合成的DNA链(GTACGCCATATCAGCTGGATGAAG)的引物。用下列两个寡核苷酸引物，通过PCR扩增所述序列5′-GAGGTACACTGACATACTGGCATG-3′5′-GTACTCCATATCAGCTGGATGAAG-3′然后通过凝胶电泳纯化PCR扩增的序列，并用作双脱氧测序反应的模板，该反应用下列寡核苷酸作为引物5′-GAGGTACACTGACATACTGGCATG-3′然后将序列的前42个核苷酸用于合成特有的探针，用该探针分离转录出免疫球蛋白信使的基因。下文将该DNA的合成的42个核苷酸的片段称为o-mu。进行DNASouthern印迹，从表达Ig的细胞系中分离并用包括MluI(MluI是一种很稀少的切割酶，它在J片段和muCH1之间裂解)的数种限制核酸内切酶逐个并成对组合消化，然后用32-P标记的特有寡核苷酸o-mu进行检测。在重排V片段的上游鉴定了一个特有的限制核酸内切酶位点。然后用MluI和第二种酶切割来自Ig-表达细胞系的DNA。然后将MluI或SpeI衔接子接头连接到末端上，并切割以便将上游位点转变成MluI或SpeI。然后，通过琼脂糖凝胶电泳将DNA进行大小分级分离，接着将含有覆盖所表达V片段之DNA片段的馏份直接克隆到质粒pGP1中。用特有的探针o-mu分离含V片段的克隆，然后将插入片段亚克隆到MluI或MluI/SpeI切割的质粒pCON2中。将所得的质粒称为pRMGH。实施例8构建人κ小座位转基因轻链小座位用κ轻链特异性寡核苷酸探针筛选人基因组DNA噬菌体文库并分离覆盖Jκ-C区的克隆。将含Jκ1的5.7kbClaI/XhoI片段和含Jκ2-5和Cκ的13kbXhoI片段克隆到pGP1d中，然后用于产生质粒pKcor。该质粒含Jκ1-5，κ内含子增强子和Cκ以及4.5kb5’和9kb3’侧翼序列。它还含有一个特有的用于克隆Vκ片段的5’XhoI位点和用于插入其它顺式作用调节序列的特有3’SalI位点。Vκ基因用Vκ轻链特异性的寡核苷酸探针筛选人基因组DNA噬菌体文库，分离含人Vκ片段的的克隆。用DNA序列分析确定功能性V片段。这些克隆含有TATA盒、编码前导和可变肽(包含2个半胱氨酸残基)的开放阅读框架、剪接序列和重组七聚体-12bp间隔区及九聚体序列。作出这三个克隆的图谱并测序。其中两个克隆，65.5和65.8似乎是有功能的，它们含有TATA盒、编码前导和可变肽(包含2个半胱氨酸残基)的开放阅读框架、剪接序列和重组七聚体-12bp间隔区及九聚体序列。第三个克隆65.4可能编码VκI假基因，因为该克隆含有不标准的重组七聚体。用有功能的克隆之一，Vk65-8(编码VkIII家族基因)构建轻链小座位构建体。pKC1通过将含Vκ65.8的7.5kbXhoI/SalI片段插入到pKcor的5’XhoI位点来产生κ轻链小座位转基因pKC1(图32)。在注射前通过用NotI消化来分离转基因插入片段。将纯化的插入片段微注射到受精(C57BL/6×CBA)F2小鼠胚胎的前核中，然后将活胚胎转移到Hogan等(inMethodsofManipulatingtheMouseEmbryo，1986，冷泉港实验室，纽约)所述的假孕雌性小鼠中。通过尾DNA的Southern印迹分析分析从注射胚胎发育的小鼠是否存在转基因序列。根据含已知数量的克隆DNA的对照标准，通过带强度来估计转基因拷贝数。从这些动物中分离血清并按HarlowandLane(在抗体实验室手册，1988，冷泉港实验室(纽约)中)所述的ELISA，分析是否存在编码人Igκ蛋白质的转基因。用人Igκ特异性(克隆6E1，#0173，AMAC，Inc.，WestbiookME)，人IgM(克隆AF6，#0285，AMAC，Inc.，Wastbrook，ME)和人IgG1(克隆JL512，#0280，AMAC，Inc.，WestbiookME)的小鼠单克隆抗体包被微滴定板上的孔。将系列稀释的血清样品加到孔中，然后用亲合力分离的碱性磷酸酶结合的山羊抗人Ig(多价)(已被预吸附以便使之与小鼠免疫球蛋白的交叉反应最小)检测是否存在特异性免疫球蛋白。图35说明8个小鼠(I.D.#676，674，673，670，666，665，664，和496)血清的ELISA试验结果。前7个小鼠是从注射了pKC1转基因插入片段的胚胎发育的，第8个小鼠是从微注射了pHC1转基因(前述)的小鼠衍生的。从注射KC1胚胎发育的7只小鼠中，通过DNASouthern印迹分析，有两只((I.D.#666和664)不含有转基因插入片段，其它5只(I.D.#676，674，673，670和665)含有转基因。除一只外所有KC1转基因阳性动物均表达可检测水平的人Igκ蛋白，根据DNASouthern印迹分析，未表达的那只动物可能是由于基因镶嵌物。pHC1阳性的转基因小鼠表达人IgM和IgG1，但不表达Igκ，这说明了试验中所用试剂的特异性。pKC2通过将含Vκ65.5的8kbXhoI/SalI片段插入pKC1的5’XhoI位点产生κ轻链小座位转基因pKC2。在微注射前，通过NotI消化来分离含两个Vκ片段的所得转基因插入片段。pKVe2除该构建体包含Jκ5’的1.2kb序列并丢失了Vκ65.83’的4.5kb序列外，该构建体与pKC1相同。另外，它还含有0.9kbXbaI片段，该片段含有小鼠重链J-μ内含子增强子(Banerjietal.，Cell33729-740(1983))以及含插入在下游的人重链J-μ内含子增强子(Haydayetal.，Nature307334-340(1984))的1.4kbMluI/HindIII片段。用该构建体试验启始轻链小座位的早期重排以影响等位基因和同种型排斥的可行性。用不同的增强子，即小鼠或大鼠3’κ或重链增强子(MeyerandNeuberger，EMBOJ.81959-1964(1989)；Pettersonetal.，Nature344165-168(1990)，该文献引入本文作为参考)产生类似的构建体。重排的轻链转基因设计κ轻链表达盒以重建功能重排的轻链基因，来自人B细胞DNA的该基因已用PCR扩增。在图33中描述了方法。将PCR扩增的轻链基因克隆到载体pK5nx中，pK5nx含有从κ轻链基因65.5分离的3.7kb5’侧翼序列。然后将与5’转录序列融合的VJ片段克隆到载体pK31s的特有XhoI位点，pK31s含有Jκ2-4、Jκ内含子增强子、Cκ和9kb的下游序列。所得的质粒含有重建的功能重排的κ轻链转基因，可用NotI切割该转基因以便微注射到胚胎中。该质粒还在3’末端含有单一的SalI位点，以用于插入其它的顺式作用调节序列。用两个合成的寡核苷酸(o-130，o-131)从人脾基因组DNA扩增重排的κ轻链基因。寡核苷酸o-131(ggacccaga(g，c)ggaaccatggaa(g，a)(g，a，t，c))与VκIII家族轻链基因的5’区互补并覆盖前导序列的第一个ATC。寡核苷酸o-130(gtgcaatcaattctcgagtttgactacagac)与Jκ13’的约150bp序列互补并含有XhoI位点。这两个寡核苷酸扩增来自人脾DNA的0.7kbDNA片段，该片段对应于与Jκ1片段连接的重排的VκIII基因。用NcoI和XhoI消化PCR扩增的DNA，然后将单个PCR产物克隆到质粒pNN03中。确定了5个克隆的DNA序列，并鉴定了其中两个含有功能性VJ连接(开放阅读框架)。收集其它功能重排的轻链克隆。逐个将功能重排的克隆克隆到上述轻链表达盒(图33)中。可将用重排的轻链构建体产生的转基因小鼠与重链小座位转基因种交配，以产生表达各种全人抗体的小鼠品系，其中由重链提供初级库的多样性。轻链多样性的一个来源是体细胞突变。由于就轻链与不同重链、不同品系小鼠的结合能力而言，并不是所有的轻链都是相同的，因此可产生并检测含不同轻链构建体的轻链。与用未重排的轻链小座位相反，该方案的优点是一发生重链VDJ连接，就可以提高来自准备与重链配对之轻链的轻链等位基因和同种型排斥。该种组合会导致表达全人抗体的B细胞的频率增大，由此可有利于表达人Ig的杂交瘤的分离。通过琼脂糖凝胶电泳从载体序列中分离醇质粒pIGM1、pHC1、pIGG1、pKC1和pKC2的NotI插入片段。将纯化的插入片段微注射到受精(C57BL16xcBA)F2小鼠胚胎的前核中，然后将活胚胎转移到Hogan等(inMethodsofManipulatingtheMouseEmbryo，1986，冷泉港实验室，纽约)所述的假孕雌性小鼠中。实施例9通过同源重组使小鼠κ轻链基因失活本实施例描述通过在胚胎干(ES)细胞中的同源重组使小鼠内源κ基因座位失活，然后通过将带失活κ等位基因的靶ES细胞注射到早期小鼠胚胎(胚泡)中而将突变的基因导入小鼠种系中。该方法是用含DNA序列的载体，通过同源重组来缺失JK和CK，所述DNA序列与小鼠κ基因座位同源，其中4.5kb的基因座位片段，即覆盖JK基因和CK片段被缺失并用选择性标记neo取代该片段。构建κ靶载体质粒pGEM7(KJ1)含有新霉素抗性基因(neo)，在克隆载体pGEM7Zf(+)中小鼠磷酸甘油酸激酶(pgk)启动子(XbaI/TaqI片段；Adra等，(1987)基因6065)的转录控制下，用于药物选择转染的ES细胞。该质粒还含有neo基因的异源聚腺苷酸化位点，该位点衍生于小鼠pgk基因的3’区(PvuII/HindIII片段；Boer等，生化遗传学，28299-308(1990))。将该质粒用作构建κ靶载体的起始材料。第一步是插入与neo表达盒3’κ基因座位同源的序列。用Cκ基因座位特异性5′-GGCTGATGCTGCACCAACTGTATCCATCTTCCCACCATCCAG-3′和用Jκ5基因片段特异性的寡核苷酸探针5′-CTCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAACGTAAG-3′.从肝DNA衍生的基因组噬菌体文库中分离小鼠κ链序列(图20a)。从阳性噬菌体克隆中分离延伸到小鼠CK片段3’的8kbBglII/SacI片段，该片段分离在两个片段中，一个是1.2kbBglII/SacI片段，一个是6.8kbSacI片段，然后将其亚克隆到BglII/SacI消化的pGEM7(KJ1)中以产生质粒pNEO-K3’(图20b)。从阳性噬菌体克隆中也分离了延伸到JK区5’的1.2kbEcoRI/SphI片段。将SphI/XbaI/BglII/EcoRI衔接子连接到该片段的SphI位点，然后将所得EcoRI片段连接到EcoRI消化的pNEO-K3’中，与neo基因和下游3’κ序列一样的5’-3’方向，以产生pNEO-K5’3’(图20c)。然后按Mansour等，自然336348-352(1988)(该文献引入本文作为参考)所述，将单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因包含在构建体中以便富集带同源重组体的ES克隆。从质粒pGEM7(TK)得到HSVTK盒，该盒含有由小鼠pgk启动子和上述用于pGEM7(KJ1)的聚腺苷酸化序列夹在中间的HSVTK基因的结构序列。将pGEM7(TK)的EcoRI位点修饰成BamHI位点，然后将TK盒切割为BamHI/HindIII片段并亚克隆到pGP1b中以产生pGP1b-YK。在XhoI位点将该质粒线性化，然后将来自pNEO-K5’3’的XhoI片段(该片段含有neo基因，该基因两侧翼为Jκ的5’和Cκ的3’基因组序列)插入到pGP1b-TK中以产生靶载体J/CKI(图20d)。与J/CK1同源重组后，基因组κ基因座的推测结构示于图20e中。产生并分析含有靶失活的κ等位基因的ES细胞所用的ES细胞是在基本上按(Robertson，E.J.(1987)inTeratocarcinomasandEmbryonicStemCellAPracticalApproach.E.J.Robertson，ed.(OxfordLIRLPress)，p.71-112)所述的无有丝分裂活性的SNL76/7细胞饲养层(McMahonandBradley，Cell621073-1085(1990))上生长的AB-1系。其它适宜的ES细胞系包括但不限于E14细胞系(Hooperetal.，(1987)Nature326292-295)、D3细胞系(Doetschmanetal.，(1985)J.Embryol.Exp.Morph.8727-45)和CCE细胞系(Robertsonetal.，(1986)Nature323445-448)。是否能够成功地产生带特异性靶突变的ES小鼠细胞系取决于ES细胞的多潜能(即在注射到宿主胚泡后，其参与胚胎形成并有助于所得动物生殖细胞的能力)。任何给定ES细胞系的多潜能随培养时间和它所得到的管理而变化。多潜能的唯一确定性试验是确定用作靶的ES细胞的特异性种群是否可产生能够进行ES基因组种系转递的嵌合体。由于该原因，在基因导向前，将部分AB-1细胞的亲代种群注射到C57B1/6J胚泡中以确定所述细胞是否能够与广泛的ES细胞产生嵌合小鼠并是否大部分嵌合体可将ES基因组传递给子代。用NotI消化κ链失活的载体J/CK1，然后按照所述方法(Hastyetal.，Nature350243-246(1991))电穿孔到AB-1细胞中。将电穿孔的细胞铺在100mm平板上，密度为1-2×106细胞/平板。24小时后，将G418(200μg/ml活性组分)和FIAU(0.5μm)加到培养基中，使药物抗性克隆形成10-11天。将克隆捡出、胰蛋白酶消化、分成两部分，再增殖。然后将各克隆衍生出的一半细胞冷冻，另一半分析载体与靶序列之间的同源重组。用Southern印迹杂交完成DNA分析。按所述(Lairdetal.，Nucl.AcidsRes.194293(1991))从克隆中分离DNA，用XbaI消化并用图20e中报示的800bpEcoRI/XbaI片段作为探针A检测。该探针检测野生型基因座位中的3.7kbXbaI片段，和已与靶载体(图20a和e)同源重组过的基因座位中的1.8kb诊断带。用Southern印迹分析筛选的901个G418和FIAU抗性克隆中，7个有1.8kbXbaI带，该带是通常重组了一个κ基因的标志。再用BglII、SacI和PstI消化这7个克隆，以证实载体同源整合到一κ基因中。用诊断性800bpEcoRI/XbaI片段(探针A)检测时，野生型DNA的BglII、SacI和PstI消化产物分别产生4.1、5.4和7kb片段，而2.4、7.5和5.7片段分别表示存在靶κ等位基因(参见图20a和e)。用XbaI消化检测的所有7个阳性克隆有预期的BglII、SacI和PstI限制片段，表明在κ轻链进行了同源重组。另外，用neo特异性探针(探针B，图20e)对靶克隆的NsiI消化产物进行Southern印迹分析，只得到一个预测的4.2kb片段，表明各克隆只含有一个拷贝的靶载体。产生带失活κ链的小鼠将前节中所述的5个靶ES克隆融解，然后注射到所述的C57B1/6J胚泡(Bradley，A.(1987)inTeratocarcinomasandEmbryonicStemCellAPracticalApproach.E.J.Robertson，ed.(OxfordLIRLPress)，p.113-151)中，然后转移到假孕雌性小鼠的子宫中以产生嵌合小鼠，所述嵌合小鼠产生于输入了ES细胞之细胞与宿主胚泡的混合物。ES细胞对嵌合体的贡献程度可通过在黑色C57B1/6J背景下，衍生于ES细胞系的野灰色皮毛的量来肉眼评估。从注射靶克隆的胚泡产生的约一半的子代是嵌合的(即有野灰色和黑色)，其中大部分表明有大多数(70％或更多的)ES细胞对皮毛着色起了作用。AB1ES细胞是XY细胞系，大部分嵌合体(高百分比)由于雄性ES细胞在雌性胚胎中集落化的性别转换而是雄性的。将衍生于5个靶克隆的4个雄性嵌合体与C57B1/6J雌性交配，监测子代是否存在显性野灰色皮毛，这种颜色是ES基因组种系传递的标志。从这些克隆中的2个嵌合体始终产生野灰色子代。由于在注射的ES克隆中，只靶向一个拷贝的κ基因座位，各野灰色子代有50％的机会来遗传突变座位。用在鉴定靶ES克隆中所用的探针(探针A，图20e)，通过Southern印迹分析BglII消化来自尾活检的DNA，来筛选靶基因。正如所预期的，约50％的子代除4.1kb的野生型带外，还有2.4kb的杂文BglII带，这证实了靶κ基因座位的种系传递。为了产生突变纯合的小鼠，将杂合子一起交配，按上述确定子代的κ基因型。正如所预期的，从杂合子交配中产生了三种基因型带2个拷贝正常κ座位的野生型小鼠，带一个靶拷贝κ基因和一个NTκ基因的杂合子，以及κ突变纯合的小鼠。通过将Southern印迹与Jκ特异性探针(探针C，图20a)杂交，确定从后一种小鼠中缺失了κ序列。而观察到Jκ探针与杂合子和野生型同胞DNA样品的杂交，在纯合子中没有杂交信号，证明产生了新的小鼠品系，在该品系中，通过靶突变的结果，通过缺失而已使2个拷贝的κ基因座位失活。实施例10通过同源重组使小鼠重链基因失活本实施例描述了通过在胚胎干(ES)细胞中进行同源重组，而使内源鼠免疫球蛋白重链失活。该方法是通过与含重链序列的载体进行同源重组而缺失内源重链J片段，所述重链序列来自已经缺失了的JH区，并有选择性标记neo的基因取代。构建重链靶载体用下列JH4特异性的寡核苷酸探针，从衍生于D3ES细胞系(Gossleretal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，839065-9069(1986))的基因组噬菌体文库中分离含JH区的小鼠重链序列(图21a)5′-ACTATGCTATGGACTACTGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCG-3′从阳性噬菌体中克隆分离覆盖JH区的的3.5kb基因组SacI/StuI片段，然后亚克隆到SacI/SmaI消化的pUC18中。将所得的质粒命名为pUC18JH。用于转染ES细胞药物筛选的新霉素抗性基因(neo)衍生于修补过的质粒pGEM7(KJ1)。文献中的报道(Yenofskyetal.，(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA873435-3439)提供了数个常用于表达载体的neo编码序列的点突变的资料，所用的表达载体包括作为pGEM7(KJ1)所用之neo基因源的构建体pMClneo(ThomasandCappechi(1987)Cell51503-152)。所述突变降低了neo基因产物的活性，而且通过用来自野生型neo克隆的相应序列取代含突变的限制片段可进行修复。将制备的pGEM7(KJ1)中的HindIII位点通过加入合成的衔接子转变成SalI位点，通过XbaI/SalI消化来切割neo表达盒。然后通过用DNApolI的Klenow形式处理来补平neo片段末端，然后将neo片段亚克隆到pUC18JH的NaeI位点，产生质粒pUC18JH-neo(图21b)。用质粒pGP1b的衍生物再构建靶载体。用限制酶NotI消化pGP1b，然后与作为衔接子的下列寡核苷酸相连5′-GGCCGCTCGACGATAGCCTCGAGGCTATAAATCTAGAAGAATTCCAGCAAAGCTTTGGC-3′用称为pGMT的所得质粒构建小鼠免疫球蛋白重链靶构建体。然后按Mansouretal.，Nature336348-352(1988)所述，将单纯疱疹病毒(HSV)胸苷激酶(TK)基因包含在构建体中以便富集带同源重组体的ES克隆。通过用EcoRI和HindIII消化，从质粒pGEM7(TK)得到HSVTK基因。将TKDNA亚克隆在pGMT的EcoRI和HindIII位点之间，产生质粒pGMT-TK。为了得到与靶序列同源的更大的区域，通过XhoI对DNA的限制消化和，XbaI的部分消化，从阳性基因组噬菌体克隆中得到位于JH区5’的5.9kb基因组XbaI/XhoI片段。如图21a所述，该XbaI位点不在基因组DNA中，而是衍生于阳性噬菌体克隆中克隆的基因组重链插入片段侧翼的噬菌体序列。将该片段亚克隆到XbaI/XhoI消化的质粒pGMT-TK中，以产生质粒pGMT-TK-JH5’(图21d)。构建的最后步骤是从pUC18JH-neo中切割2.8kbEcoRI片段，该片段含有neo基因和JH3’侧翼的基因组序列。用Klenow聚合酶将该片段补平，然后亚克隆到pGMT-TK-JH5’的相似补平的XhoI位点。所得的构建体，JHKO1(图21e)含有JH基因座位侧翼的6.9kb基因组序列，覆盖JH区的2.3kb缺失，在该区中插入了neo基因。图21f说明在与靶构建体同源重组后，内源重链基因的结构。实施例11产生并分析靶ES细胞在基本上按所述(Robertson，E.J.(1987)inTeratocarcinomasandEmbryonicStemCellAPracticalApproach.E.J.Robertson，ed.(OxfordLIRLPress)，p.71-112)的无有丝分裂活性的SNL76/7细胞饲养层上生长AB-1ES细胞系(McMahonandBradley，Cell621073-1085(1990))。如前实施例所述，在用靶构建体JHKO1电穿孔ES细胞前，通过产生AB-1衍生的嵌合体来确定ES细胞的多潜能，AB-1衍生的嵌合体的产生表明能够通过种系传递ES基因组。用NotI消化重链失活的载体JHKO1，然后按所述方法(Hastyetal.，Nature350243-246(1991))电穿孔到AB-1细胞中。将电穿孔的细胞铺在100mm平板上，密度为1-2×106细胞/平板。24小时后，将G418(200μg/ml活性组分)和FIAU(0.5μm)加到培养基中，使药物抗性克隆形成8-10天。将克隆捡出、胰蛋白酶消化、分成两部分，再增殖。然后将各克隆衍生出的一半细胞冷冻，另一半分析载体与靶序列之间的同源重组。用Southern印迹杂交完成DNA分析。按所述(Lairdetal.，Nucl.AcidsRes.194293(1991))从克隆中分离DNA，用StuI消化并用图21f中的称为探针A的500bpEcoRI/StuI片段检测。该探针检测野生型基因座位中的4.7kbStuI片段，而3kb带是内源序列与靶载体(图21a和21f)同源重组过的诊断带。用Southern印迹杂交筛选的525个G418和FIAU双抗性克隆中，发现12个含有表示与靶载体重组过的3kb带。这些克隆表示在JH基因座位发生了预期的靶事件(如图21f所示)，再用HindIII、SpeI和HpaI消化来证实。探针A(见图21f)与HindIII、SpeI和HpaI消化的DNA的杂交分别产生了野生型基因座位的2.3kb、大于10kb和大于10kb带(见图21a)，而预期靶重链基因座位会分别产生5.3kb、3.8kb和1.9kb的带(见图21f)。用StuI消化检测的所有12个阳性克隆显示出都有靶JH基因的预期HindIII、SpeI和HpaI诊断带。另外，用neo特异性探针(探针B，图21f)经Southern印迹分析所有12个克隆的StuI消化产物只产生了一个预期的3kb片段，说明每个克隆只含有1个拷贝的靶载体。产生带JH缺失的小鼠将前节中所述的3个靶ES克隆融解，然后注射到所述的C57B1/6J胚泡(Bradley，A.(1987)inTeratocarcinomasandEmbryonicStemCellAPracticalApproach.E.J.Robertson，ed.(OxfordLIRLPress)，p.113-151)中，然后转移到假孕雌性小鼠的子宫中。ES细胞对嵌合体的贡献程度可通过在黑色C57B1/6J背景下，衍生于ES细胞系的野灰色皮毛的量来肉眼评估。从注射了两个靶克隆的胚泡产生的一半子代是嵌合的(即有野灰色和黑色)，第3个靶克隆没有产生任何嵌合动物。大部分嵌合体表明有大量大约(50％或更多的)ES细胞对皮毛颜色起了作用。由于AB1ES细胞是XY细胞系，大部分嵌合体是雄性的，由于雄性ES细胞在雌性胚胎中的集落化而产生性别转换。将雄性嵌合体与C57B1/6J雌性小鼠交配，然后监测子代是否存在显性野灰色皮毛，这种颜色是ES基因组种系传递的标志。这两个克隆的嵌合体始终产生野灰色子代。由于在注射的ES克隆中，只靶向一个拷贝的重链座位，各野灰色子代有50％的机会来遗传突变的座位。用在鉴定靶ES克隆中所用的探针(探针A，图21f)，通过Southern印迹分析StuI消化来自尾活检的DNA，来筛选靶基因。正如所预期的，约50％的野灰色子代除4.7kb的野生型带外，还有大约3kb的杂文StuI带，这证实了靶JH座位的种系传递。为了产生突变纯合的小鼠，将杂合子一起交配，按上述确定子代的重链基因型。正如所预期的，从杂合子交配中产生了三种基因型带2个拷贝正常JH座位的野生型小鼠，带一个拷贝靶基因和一个正常基因的杂合子，以及JH突变纯合的小鼠。通过StuI消化的DNA的Southern印迹与JH特异性探针(探针C，图21a)杂交，来确定后一种小鼠中是否缺失了JH序列。而观察到JH探针与杂合和野生型同胞的DNA样品中4.7kb片段杂交，在JH突变的纯合子中没有杂交信号，证明产生了新的小鼠品系，在该品系中，通过缺失JH序列而突变了所有两个拷贝的重链基因。实施例12重链小座位的转基因A.构建用于克隆大DNA序列的质粒载体1.pGP1a用EcoRI和StyI消化质粒pBR322，然后与下列寡核苷酸相连oligo-425′-caagagcccgcctaatgagcgggcttttttttgcatactgcggccgct-3′oligo-435′-aattagcggccgcagtatgcaaaaaaaagcccgctcattaggcgggct-3′所得的质粒称为pGP1a，用于克隆很大的DNA构建体，可用稀少的限制酶NotI切割该构建体。该质粒在衍生于trpA基因(Christie等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA784180(1981))强转录终止信号下游含有一个NotI限制性位点(相当于氨苄青霉素抗性基因，AmpR)。该终止信号通过消除从AmpR基因的连读转录而降低了插入到NotI位点的编码序列的潜在毒性。另外，与pUC质粒相比，该质粒是低拷贝的，因为它含有pBR322的拷贝数控制区。由于DNA复制低拷贝数还进一步降低了插入片段的潜在毒性并降低了对大插入片段的筛选。载体pGP1b、pGP1c、pGP1d和pGP1f衍生于pGP1a，含有不同的多接头克隆位点。下面给出多接头序列，pGP1aNotIGCGGCCGCpGP1bNotIXhoIClaIBamHIHindIIINotIGCggccgcctcgagatcactatcgattaattaaggatccagcagtaagcttgcGGCCGCpGI1cNotISmaIXhoISalIHindIIIBamHISacIINotIGCggccgcatcccgggtctcgaggtcgacaagctttcgaggatccgcGGCCGCpGP1dNotISalIHindIIIClaIBamHIXhoINotIGCggccgctgtcgacaagcttatcgatggatcctcgagtgcGGCCGCpGP1fNotISalIHindIIIEcoRIClaIKpnIBamHIXhoINotIGCggccgctgtcgacaagcttcgaattcagatcgatgtggtacctggatcctcgagtgcGGCCGC将所述各质粒用于构建可用NotI切割的大转基因插入片段，以便可在显微注射前，从载体序列中纯化出转基因DNA。2.pGP1b用NotI消化pGP1a，然后与下列寡核苷酸相连oligo-475′-ggccgcaagcttactgctggatccttaattaatcgatagtgatctcgaggc-3′oligo-485′-ggccgcctcgagatcactatcgattaattaaggatccagcagtaagcttgc-3′所得质粒pGP1b在NotI位点侧翼含有短多接头区。这有利于构建可用NotI消化的大插入片段。3.pGPe通过聚合酶链反应技术，用下列寡核苷酸从大鼠肝DNA中扩增免疫球蛋白重链3’增强子(S.Petterson，etal.，Nature344165-168(1990))oligo-445′-ctccaggatccagatatcagtacctgaaacagggcttgc-3′oligo-455′-ctcgagcatgcacaggacctggagcacacacagccttcc-3′用BamHI和SphI消化扩增的产物，然后克隆到BamHI/SphI消化的pNN03(pNN03是一个pUC衍生的质粒，该质粒含有多接头和下列限制位点，所述位点的顺序是NotI、BamHI、NcoI、ClaI、EcoRV、XbaI、SacI、XhoI、SphI、PstI、BglII、EcoRI、SmaI、KpnI、HindIII和NotI)中。用BamHI和HindIII消化所得质粒pRE3，将含大鼠Ig重链3’增强子的插入片段克隆到BamHI/HindIII消化的pGP1b中。所得的质粒pGPe(图22和表1)含有数个特有的限制位点，可向所述限制位点克隆序列，然后通过NotI消化所述序列与3’增强子一起切下。表1载体pGPe的序列AATTAGCggccgcctcgagatcactatcgattaattaaggatccagatatcagtacctgaaacagggctgctcacaacatctctctctctgtctctctgtctctgtgtgtgtgtctctctctgtctctgtctctctctgtctctctgtctctgtgtgtgtctctctctgtctctctctctgtctctctgtctctctgtctgtctctgtctctgtctctgtctctctctctctctctctctctctctctctctctctcacacacacacacacacacacacacacctgccgagtgactcactctgtgcagggttggccctcggggcacatgcaaatggatgtttgttccatgcagaaaaacatgtttctcattctctgagccaaaaatagcatcaatgattcccccaccctgcagctgcaggttcaccccacctggccaggttgaccagctttggggatggggctgggggttccatgacccctaacggtgacattgaattcagtgttttcccatttatcgacactgctggaatctgaccctaggagggaagacaggagataggcaaggtccaaacaccccagggaagtgggagagacaggaaggctgtgtgtgctccaggtcctgtgcatgctgcagatctgaattcccgggtaccaagcttgcGGCCGCAGTATGCAAAAAAAAGCCCGCTCATTAGGCGGGCTCTTGGCAGAACATATCCATCGCGTCCGCCATCTCCAGCAGCCGCACGCGGCGCATCTCGGGCAGCGTTGGGTCCTGGCCACGGGTGCGCATGATCGTGCTCCTGTCGTTGAGGACCCGGCTAGGCTGGCGGGGTTGCCTTACTGGTTAGCAGAATGAATCACCGATACGCGAGCGAACGTGAAGCGACTGCTGCTCAAAACGTCTGGCGACCTGAGCAACAACATGAATGGTCTTCGGTTTCCGTGTTTCGTAAAGTCTGGAAACGCGGAAGTCAGCGCCCTGCACCATTATGTTCCGGATCTGCATCGCAGGATGCTGCTGGCTACCCTGTGGAACACCTACATCTGTATTAACGAAGCGCTGGCATTGACCCTGAGTGATTTTTCTCTGGTCCCGCCGCATCCATACCGCCAGTTGTTTACCCTCACAACGTTCCAGTAACCGGGCATGTTCATCATCAGTAACCCGTATCGTCACGATCCTCTCTCGTTTCATCGGTATCATTACCCCCATGAACAGAAATTCCCCCTTACACGGAGGCATCAAGTGACCAAACAGGAAAAAACCGCCCTTAACATGGCCCGCTTTATCAGAAGCCAGACATTTTAACGCTCTGGAGAAACTCAACGAGCTGGACGCGGATGAACAGGCAGACATCTGTGAATCGCTTCACGACCACGCTGATGAGCTTTACCGCAGCTGCCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCGCAGCCATGACCCAGTCACGTAGCGATAGCGGAGTGTATACTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTCGGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCAGGTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTGCAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAACACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTGGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTGATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTTCAAGB.构建表达IgM的小座位转基因pIGM11.J-μ恒定区克隆的分离和pJM1的构建用人重链J区特异性的下列寡核苷酸筛选克隆到噬菌体载体λEMBL/SP6/T7(ClonetechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)中的人胎盘基因组DNA文库oligo-15′-ggactgtgtccctgtgtgatgcttttgatgtctggggccaag-3′然后分离噬菌体克隆λ1.3。从该克隆中分离6kbHindIII/KpnI片段，该片段含有所有6个J片段以及D片段DHQ52和重链J-μ内含子序列。用下列人特异性μ寡核苷酸筛选相同的文库oligo-25′-caccaagttgacctgcctggtcacagacctgaccacctatga-3′然后分离噬菌体克隆λ2.1。从该克隆中分离10.5kbHindIII/XhoI片段，该片段含有μ转换区和所有μ恒定区外显子。将这两个片段与KpnI/XhoI消化的pNN03相连以得到质粒pJM1。2.pJM2从噬菌体克隆λ2.1分离4kbXhoI片段，该片段含有pJM1下游的序列，包括与表达某种IgD的B细胞中，μ的δ相关缺失有关的所谓∑μ元件(Yasuietal.，Eur.J.Immunol.191399(1989)，该文献引入本文作为参考)。用DNA聚合酶I的Klenow片段处理该片段，然后与XhoI切割的、Klenow处理的pJM1相连。由于Klenow酶的不完全消化，所得的质粒pJM2(图23)丢失了内部的XhoI位点，但保留了3’XhoI位点。pJM2含有完整的人J区、重链J-μ内含子增强子、μ转换区和所有μ恒定区外显子以及两个与δ相关缺失有关的4.0kb同向重复序列，σμ和∑μ。3.D区克隆的分离和pDH1的构建用下列人D区特异性寡核苷酸oligo-45′-tggtattactatggttcggggagttattataaccacagtgtc-3′筛选人胚胎基因组文库的D区克隆。分离噬菌体克隆λ4.1和λ4.3。从噬菌体克隆λ4.1中分离5.5kbXhoI片段，该片段含有D元件DK1、DN1’DM1’(Ichiharaetal.，EMBOJ.74141(1988))。从噬菌体克隆λ4.3中分离相邻上游5.2kbXhoI片段，该片段含有D元件DLR1、DXP1和DXP′1和DA1。将这些D区XhoI片段克隆到质粒载体pSP72(Promega，Madison，WI)的SalI位点以便破坏连接这两个序列的XhoI位点。然后用XhoI和SmaI切割上游片段，用EcoRV和XhoI切割下游片段。将所得的各分离的片段与SalI消化的pSP72连在一起以得到质粒pDH1。pDH1含有10.6kb插入片段，该片段含有至少7个D片段并可用XhoI(15’)和EcoRV(3’)切割。4.pCOR1用Asp718(KpnI的一种isoschizomer)消化质粒pJM2，用DNA聚合酶I的Klenow片段补平悬垂端。用ClaI消化所得DNA，然后分离插入片段。将该插入片段与pDH1的XhoI/EcoRV插入片段和XhoI/ClaI消化的pGPe相连以得到pCOR1(图24)。5.pVH251将含两个人重链可变区片段VH251和VH105(Humphriesetal.，Nature331446(1988)，该文献引入本文作为参考)的10.3kb基因组HindIII片段亚克隆到pSP72中以得到质粒pVH251。6.pIGM1用XhoI部分消化质粒pCOR1，然后将pVH251的分离的XhoI/SalI插入片段克隆到上游XhoI位点以得到质粒pIGM1(图25)。pIGM1含有2个功能性人可变区、至少8个人D片段、所有6个人JH片段、人J-μ增强子、人σμ元件、人μ转换区、所有人μ编码外显子、和人∑μ元件，以及大鼠重链3’增强子，以便可从载体中，通过XotI消化将所有这些序列元件分离在一个片段上，然后微注射到小鼠胚胎前核中以产生转基因动物。C.构建表达IgM和IgG的小座位转基因pHC11.分离γ恒定区克隆用下列人IgG恒定区特异性的寡核苷酸筛选人基因组文库oligo-295′-cagcaggtgcacacccaatgcccatgagcccagacactggac-3′分离噬菌体克隆λ29.4和λ29.5。用含γ转换区的噬菌体克隆λ29.4的4bkHindIII片段检测克隆到噬菌体载体λFIXTMII(Stratagene，LaJolla，CA)中的人胚胎基因组DNA文库。分离噬菌体克隆λSg1.13。为了确定不同γ克隆的亚型，用这三个噬菌体克隆的亚克隆作为模板，下列寡核苷酸作为引物，完成双脱氧测序反应oligo-675′-tgagcccagacactggac-3′确定噬菌体克隆λ29.5和λSg1.13都是γ1的亚型。2.pγe1将含γ1编码区的噬菌体克隆λ29.5的7.8kbHindIII片段克隆到pUC18中。用XhoI消化所得质粒pLT1，用Klenow处理，然后再连接以破坏内部的XhoI位点。用HindIII消化所得的克隆pLT1xk，然后分离插入片段并克隆到pSP72中以产生质粒克隆pLT1xks。在多接头的XhoI位点和人序列衍生的BamHI位点消化pLT1xks产生含γ1恒定区编码外显子的7.6kb片段。将该7.6kbXhoI/BamHI片段与来自噬菌体克隆λ29.5的相邻下游4.5kbBamHI片段一起克隆到XhoI/BamHI消化的pGPe中以产生质粒克隆pγe1。pγe1含有所有γ1恒定区编码外显子、以及与大鼠重链3’增强子相连的5kb下游序列。3.pγe2从噬菌体克隆λSγ1.13中分离含γ1转换区和前转换无效转录物之第一外显子(P.Siderasetal.，(1989)InternationalImmunol.1631)的5.3kbHindIII片段，然后克隆到pSP72中以产生质粒克隆λSγ1s，pSP72含有与插入片段5’末端相邻的多接头XhoI位点。将pSγ1s的XhoI/SalI插入片段克隆到XhoI消化的pγe1中以产生质粒克隆pγe2(图26)。pγe2含有γ1恒定区的所有编码外显子和上游转换区、无效转录物外显子以及与大鼠重链3’增强子相连的5kb上游序列。该克隆在插入片段的5’末端含有单一的XhoI位点。通过用NotI消化，可从载体序列中切割出完整的插入片段以及XhoI位点和3’大鼠增强子。4.pHC1用XhoI消化质粒pIGM1，分离43kb的插入片段，并克隆到XhoI消化的pge2中以产生质粒pHC1(图25)。pHC1含有2个功能性人可变区片段、至少8个人D片段、所有6个人JH片段、人J-μ增强子、人σμ元件、人μ转换区、所有人μ编码处显子、人∑μ元件和人γ恒定区，包括相关的转换区和无效转录物相关外显子以及大鼠重链3’增强子，以便通过NotI消化可从载体序列中所有这些序列元件均分离在一个片段上，然后微注射到小鼠胚胎前核中以产生转基因动物。D.构建表达IgM和IgG的小座位转基因pHC21.分离人重链V区基因VH49.8用下列人VH1家族特异性寡核苷酸筛选人胚胎基因组DNA文库λFIXTMII(Stratagene，LaJolla，CA)oligo-495′-gttaaagaggattttattcacccctgtgtcctctccacaggtgtc-3′分离噬菌体克隆λ49.8，然后将含可变片段VH49.8的6.1kbXbaI片段亚克隆到pNN03中(以便多接头ClaI位点在VH49.8的下游，多接头XhoI位点在上游)以产生质粒pVH49.8。将该插入片段的800bp区测序，发现VH49.8有一开放阅读框架和完整的剪接和重组信号，由此说明该基因是功能性的(表2)。表2人VHI家族基因VH49.8的序列TTCCTCAGGCAGGATTTAGGGCTTGGTCTCTCAGCATCCCACACTTGTAC50AGCTGATGTGGCATCTGTGTTTTCTTTCTCATCCTAGATCAAGCTTTGAG100CTGTGAAATACCCTGCCTCATGAATATGCAAATAATCTGAGGTCTTCTGA150GATAAATATAGATATATTGGTGCCCTCAGAGCATCACATAACAACCAGAT200TCCTCCTCTAAAGAAGCCCCTGGGAGCACAGCTCATCACCATGGACTGGA250MetAspTrpTCCTGGAGGTTCCTCTTTGTGGTGGCAGCAGCTACAGgtaaggggcttcct300hrTrpArgPhlLeuPheValValAlaAlaAlaThragtcctaaggctgaggaagggatcctggtttattaaagaggattttatt350cacccctgtgtcctctccacagGTGTCCAGTCCCAGGTCCAGCTGGTGCA300GlyValGlnSerGlnValGlnLeuValGlGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGGTGAAGGTCTCCTGCA450nSerGlyAlaGluValLysLysProGlySerSerValLysValSeCysLAGGCTTCTCGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTATCAGCTGGGTGCGACAG500ysAlaSerGlyGlyThrPheSerSerTyrAlaIleSerTrpValArgGlnGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAAGGATCATCCCTATCCTTGG550AlaProGlyGlnGlyLeuGluTrpMetGlyArgIleIleProIleLeuGlTATAGCAAACTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGG600yIleAlaAsnTyrAlaGlnLysPheGlnGlyArgValThrIleThrAlaAACAASlCCACGAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAG650spLysSerThrSerThrAlaTyrMetGluLeuSerSerLeuArgScrGluAspThrAlaValTyrlyrCysAlaArgAGATGACAGGGTTTATTAGGTTTAAGGCTGTTTACAAAATGGGTTATATA800TTTGAGAAAAAA8122.pV2用SmaI和HindIII切割亚克隆到质粒pUC12中的、含人VHIV家族基因VH4-21(Sanzetal.，EMBOj.83741(1989))的4kbXbaI基因组片段，然后用聚合酶I的Klenow片段处理。然后将该平整末端片段克隆到ClaI消化的Klenow处理的pVH49.8中。所得质粒pV2含有以相同方向与VH4-21上游相连的人重链基因VH49.8，在插入片段的3’有一SalI位点，在5’末端有一XhoI位点。3.pSγ1-5’从噬菌体克隆λSg1.13中分离0.7kbXbaI/HindIII片段(代表在含质粒pγe2中片段的5.3kbγ转换区上游并与之相邻的序列)和含上游3.1kbXbaI片段的片段，然后克隆到HindIII/XbaI消化的pUC18载体中。所得质粒pSγ1-5’含有代表无效转录物起始位点上游的3.8kb插入序列，所述无效转录物是在转换成γ1同种型前的B细胞中发现的(P.siderasetal.，InternationalImmunol.1631(1989))。由于该转录物与同种型转换的启动有关，而上游顺式作用序列对于转录调节通常很重要，因此，要将这些序列包含在转基因构建体中以有利于改正无效转录物的表达以及转换相关的重组。4.pVGE1用SamI和HindIII切割pSγ1-5’插入片段，用Klenow酶处理，并与下列寡核苷酸接头相连p139-序列连接产物用SalI消化然后与SalI消化的pV2相连。所得质粒pVP含有3.8kbγ1转换5’侧翼序列，该序列与两个人重链可变基因片段VH49.8和VH4-21的下游相连(见表2)。通过用SalI部分消化、然后用XhoI完全消化来分离pVP插入片段，然后在琼脂糖凝胶上纯化15kb片段。然后将插入片段克隆到pγe2的XhoI位点以产生质粒克隆pVGE1(图27)。pVGE1在人γ1恒定基因和转换相关区上游含有两个人可变基因片段。可用位于可变和恒定区之间的单一SalI位点来克隆D、J和μ基因片段。将大鼠重链3’增强子与γ1基因的3’末端相连，NotI位点在完整插入片段侧翼。5.pHC2用SalI消化质粒克隆pVGE1，将pIGM1的XhoI插入片段克隆到其中。所得克隆pHC2(图25)含有4个功能性人可变区片段、至少8个人D片段、所有6个人JH片段、人J-μ增强子、人σμ元件、人μ转换区、所有人μ编码外显子、人∑μ元件和人γ恒定区，包括相关的转换区和无效转录物相关外显子以及无效转录物起始位点上游的4kb侧翼序列。将这些人序列与大鼠重链3’增强子相连以便通过NotI消化可从载体中所有这些序列均分离在一个片段上，然后微注射到小鼠胚胎前核中以产生转基因动物。可用在插入片段5’末端的单一XhoI位点克隆其它的人可变基因片段以扩大该重链小座位的重组多样性。E.转基因小鼠通过琼脂糖凝胶电泳从载体序列中分离质粒pIGM1和pHC1的NotI插入片段。将纯化的插入片段微注射到受精(C57BL/6×CBA)F2小鼠胚胎的前核中，然后将活胚胎转移到Hogan等(inMethodsofManipulatingtheMouseEmbryo，1986，冷泉港实验室，纽约)所述的假孕雌性小鼠中。通过尾DNA的Southern印迹分析确定从注射胚胎发育的小鼠是否存在转基因序列。根据含已知数量克隆DNA的标准对照，通过带强度估计转基因拷贝数。在3-8周龄，从这些动物中分离血清，然后按HarlowandLane(在抗体实验室手册，1988，冷泉港实验室(纽约)中)所述的ELISA，分析是否存在编码人IgM和人IgG1的转基因。用人IgM特异性的(克隆AF6，#0285，AMAC，Inc.Westbrook，ME)和IgG1特异性的(克隆JL512，#0280，AMAC，Inc.Westbrook，ME)小鼠单克隆抗体包被微滴定板孔。将系列稀释的血清样品加到各孔中，存在特异性免疫球蛋白的条件下，用分离的碱性磷酸酶结合的山羊抗人Ig(多价的)的亲合力来检测，所述性磷酸酶结合的山羊抗人Ig已被预吸附以使与小鼠免疫球蛋白的交叉反应最小。表3和图28表示用ELISA试验检测两种动物血清中是否存在人IgM和IgG1的结果，所述动物是从用质粒pHC1的转基因插入片段注射的胚胎发育来的。通过该试验表明所有对照非转基因小鼠对人IgM和IgG1的表达结果均是阴性的。含pIGM1NotI插入片段的两个品系的小鼠(品系#6和15)表达人IgM，但不表达人IgG1。我们试验了6个品系的小鼠，这些小鼠含有pHC1插入片段，我们发现其中的4个品系(品系#26、38、57和122)表达人IgM和人IgG1，而另两个品系的小鼠(品系#19和21)不表达可检测水平的人免疫球蛋白。不表达人免疫球蛋白的pHC1转基因小鼠是所谓Go小鼠，它们是直接从微注射的胚胎发育的，而且可能存在转基因镶嵌。Southern印迹分析表明这些小鼠中有许多每个细胞含有一个或数个拷贝的转基因。检测pIGM1转基因动物血清中的人IgM和pHC1转基因中的人IgM和IgG1，提供了在指导VDJ连接、转录和同种型转换中发挥正确功能的证据。Southern印迹分析表明，其中一个动物(#18)是转基因阴性的这表明没有可检测水平的人IgM和IgG1。如用Southern印迹分析确定的，第二种动物(#38)含有约5个拷贝的转基因，因此表明有可检测水平的人IgM和IgG1。从转基因注射胚胎发育而来的11个动物的ELISA结果在下列表中作了总结(表3)。表3用ELISA检测转基因动物血清中的人IgM和IgG1转基因的大约动物#注射的转基因拷贝数/细胞人IgM人IgG16pIGM11++-7pIGM10--9pIGM10--10pIGM10--12pIGM10--15pIGM110++-18pHC10--19pHC11--21pHC1＜1--26pHC12+++38pHC15+++表3表明了在血清中存在整合转基因DNA和存在转基因编码的免疫球蛋白之间的关系。发现两个含pHC1转基因的动物不表达可检测水平的人免疫球蛋白。这些是很低拷贝的动物并可能不含有完整拷贝的转基因，或所述动物可能有遗传镶嵌(通过估测动物#21，每个细胞＜1拷贝而表明的)，而且含转基因的细胞可能还未在造血细胞谱系中形成种群。或者，可将转基因整合到无助于其表达的基因组位置。检测pIGM1转基因动物血清中的人IgM和pHC1转基因动物中的人IgM和IgG，表明转基因序列在指导VDJ连接、转录和同种型转换中发挥了正确功能。F.cDNA克隆为了评估pHC1转基因在VDJ连接和类型转换中的功能性以及在B细胞发育中转基因编码的人B细胞受体和等位排斥中的参与情况、检查了衍生于转基因小鼠脾mRNA的免疫球蛋白cDNA克隆的结构。检测转基因编码的重链的总多样性、集中于D和J片段的使用、N区增加、CDR3长度分布以及导致功能性mRNA分子的连接点的频率。检测编码掺入VH105和VH251的IgM和IgG的转录物。从11周龄的雄性第二代谱系-57pHC1转基因小鼠中分离聚腺苷酸化的RNA。用该RNA合成oligo-dT引发的单链cDNA。然后用所得的cDNA作为4个不同PCR扩增的模板，所述PCR使用下列4种合成寡核苷酸为引物VH251特异性oligo-149ctagctcgagtccaaggaatctgtgccgaggtgcagctg(g，a，t，c)；VH105特异性o-150gttgctcgagtgaaaggtgtccaggtggaggtgcagctg(g，a，t，c)；人γ1特异性o-151ggcgctcgagttccacgacaccgtcaccggttc和人μ特异性o-152cctgctcgaggcagccaacggccacgctgctcg。反应1使用引物o-149和o-151以扩增VH251-γ1转录物，反应2使用o-149和o-152可扩增VH251-μ转录物，反应3使用o-150和o-151以扩增VH105-γ1转录物，反应4使用o-150和o-152以扩增VH105-μ转录物。从琼脂糖凝胶中分离所得的0.5kbPCR产物；μ转录物产物比γ转录物产物更丰富，这与相应的ELISA数据一致(图34)。用XhoI消化PCR产物，然后克隆到质粒pNN03中。从4个PCR扩增的小量制品的9个克隆中分离双链质粒DNA，然后进行双脱氧测序反应。两个克隆产生出不含D或J片段的缺失产物。这些不可能衍生于正常RNA剪接产物，可能是来源于PCR扩增过程中导入的缺失。一个DNA样品产生了两个不同克隆的混合物，另3个克隆产生出不可读的DNA序列(可能是由于DNA样品不够干净)。在表4中列出了来自其它30个克隆的VDJ连接点的DNA序列。每个序列都是单一的，这表明基因重排不是一个途径或表达转基因的B细胞的单个克隆是显性。不存在两个相似的序列这一事实还说明从一仅含2个V片段、10个D片段和6个J片段紧密小座位中，可表达出许多免疫球蛋白。在VDJ连接中使用了包含在转基因中的所有2个V片段、所有6个J片段和10个D片段中的7个。另外，将两个恒定区基因(μ和γ)均插入转录物中。在所完成的反应中VH105引物不是VH105特异性的。因此从反应3和4中得到的许多克隆都含有VH251转录物。另外，从连接的反应3PCR产物分离的克隆编码IgM而不是IgG；然而这可能反映被来自反应4的PCR产物污染因为DNA分离在同一凝胶上。最近由Yamada等(J.Exp.Med.173395-407(1991)，该文献引入本文作为参考)报道了一个相似的试验，其中从成人外周血淋巴细胞(PBL)扩增免疫球蛋白重链序列，然后确定VDJ连接点的DNA序列。我们将来自人PBL的数据与来自pHC1转基因小鼠的数据进行了比较。表4Vn-D-mJC1VH251DHQ52J3γ1TACTGTGCGAGACGGCTAAACTGGGGTTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCCTCCACCAAG2VH251DN1J4γ1TACTGTGCGAGACACCGTATAGCAGCAGCTGGCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG3VH251DN1J6γ1TACTGTGCGAGATATTACTACTACTACTACGGTATCGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG4VH251D？J6γ1TACTGTGCGAGACATTACGATATTTTGACTGGTCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG5VH251DXP′1J4γ1TACTGTGCGAGACGGAGGTACTATGGTTCGGGGAGTTATTATAACGTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG6VH251D？J3γ1TACTGTGCGAGACGGGGGGTGTCTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACGTCTCTTCAGCCTCCACCAAG7VH251DHQ52J3μTACTGTGCGAGAGCAACTGGCGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACGTCTCTTCAGGGAGTGCATCG8VH251DHQ52J6μTACTGTGCGAGATCGGCTAACTGGGGATCCTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC9VH251--J1μTACTGTGCGAGATACTTCCAGCACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCGTCC10VH251D1R2J4μTACTGTGCGAGACACGTAGCTAACTCTTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC11VH251DXP′1J4μTACTGTGCGAGACAAATTACTATGGTTCGGGGAGTTCCCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC12VH251D7J1μTACTGTGCGAGACAATACTTCCAGCACTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC13VH251DHQ52J6μTACTGTGCGAGACAAACTGGGGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC14VH251DXP′1J6γ1TACTGTGCGAGACATTACTATGGTTCGGGGAGTTATGACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC15VH251DXP′1J4μTACTGTGCGAGACAGGGAGTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG16VH105DXP′1J5μTACTGTGCGAGATTCTGGGAGACTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC17VH251DXP′1J4γ1TACTGTGCGAGACGGAGGTACTATGGTTCGGGGAGTTATTATAACGTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG18VH251DHQ52J4γ1TACTGTGCGAGACAAACCTGGGGAGGAGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG19VH251DK1J6γ1TACTGTGCGAGAGGATATAGTGGCTACGATAACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG20VH251DHQ52J4μTACTGTGCGAGACAAACTGGGGAGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC21VH251DK1J2γ1TACTGRGCGAGATATAGTGGCTACGATTACCTACTGGTACTTCGATCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG22VH251D1R2J6γ1TACTGRGCGAGAGCATCCCTCCCCTCCTTTGACTACTACGGTATGGAGGTCTCGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAG23VH251D1R2J4μTACTGTGCGAGACGGGGTGGGGTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC24VH105D？J6μTACTGTGTGCCGGTCGAAACTTTACTACTACTACTACGGTATGGACGTCTGGGGCCAAGGGACCACGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC25VH105DKP1J4μTACTGTGCGAGAGATATTTTGACTGGTAACGTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC26VH251DN1J3μTACTGTGCGAGACATGGTATAGCAGCAGCTGGTACTGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGGAGTGCATCC27VH105DHQ52J3μTACTGTGTGAGATCAACTGGGGTTGATGCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGGGAGTGCATCC28VH251DN1J4μTACTGTGCGGAAATAGCAGCAGCTGCCCTACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC29VH105DN1J4μTACTGTGTGTGTATAGCAGCAGCTGGTAAAGGAAACGGCTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCC30VH251DHQ52J4μTACTGTGCGAGACAAAACTGGGGTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGGGAGTGCATCCG.J片段选择表5比较了插入到pHC1转基因编码的转录物中的J片段与成人PBL免疫球蛋白转录物中J片段的分布情况。这两个分布图很相似，在这两个系统中，J4片段最多，然后是J6。J2在人PBL和转基因小鼠中都是最少的片段。表5J片段选择使用百分比(±％)J片段HC1转基因的人PBLJ171J23＜1J3179J44453J5315J62622100％00％H.D片段选择Yamada等分析的49％(82个中的40个)克隆插入了在pHC1转基因中包含的D片段。另11个克隆含有不是作者指定该任何已知D片段的序列。这11个未指定的克隆中，有2个克隆似乎衍生于pHC1构建体中的DIR2片段倒位。Yamada等(J.Exp.Med.173395-407(1991))未考虑这种机制，这种机制是由Ichihara等(EMBOJ.74141(1988))预测的，由Sanz(J.Immunol.1471720-1729(1991))观察到的。表5比较了pHC1转基因小鼠和Yamada等在人PBL转录物中观察到的D片段分布的情况。重编Yamada等的数据以包含DIR2使用，并排除了在pHC1转基因中没有的D片段。表6说明在转基因小鼠和人PBL中，D片段插入的分布情况非常相似。在转基因小鼠中还发现了高频率的两个显著人D片段，DXP′1和DN1。两种分布之间最不相似之处在于DHQ52在转基因小鼠中的频率比在人中的高。高频的DHQ52使人联想到在人胎儿肝中D片段的分布。Sanz已观察到14％的重链转录物含有DHQ52序列。如果从分析中除去未在pHC1中发现的D片段，Sanz分析的胎儿肝转录物中，有31％含有DHQ52。这与我们在pHC1转基因小鼠中观察到的27％非常相近。表6D片段选择使用百分比(±3％)D片段HC1转基因小鼠人PBLDLR1＜1＜1DXP136DXP′12519DA1＜112DK1712DN11222DIR274DM2＜12DLR234DHQ52262？1717100％100％I.VDJ连接点的功能性表7说明来自30个克隆的VDJ区的预测氨基酸序列，所述克隆是从pHC1转基因小鼠中分析的。翻译的序列表明就可变和J片段而言，30个VDJ中，有23个(70％)在框架中。表7V-D-J连接点的功能性FR3CDR3FR41VH251DHQ52J3γ1YCARRLTGVDAFDIWGQGTMVTMSSASTK2VH251DN1J4γ1YCqARHRIAAAGFDYWGQGTLVTVSSASTK3VH251D？J6γ1YCARYYYYYYGMDVWGQGTTVTVSSASTK4VH251DXP′1J6γ1YCARHYDILTGPTTTTVWTSGAKGPRSPSPQPPP5VH251DXP′1J4γ1YCARRRYYGSGSYYNVFDYWGQGTLVTVSSADTK6VH251D？J3γ1YCARRGVSDAFDIWGQGTMVTMSSADTK7VH251DHQ52J3μYCARATGAFDIWGQGTMVTVSSGSAS8VH251DHQ52J6μYCARSANWGSYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSAS9VH251-J1μYCARYFQHWGQGTLVTVSSGSAS10VH251DLR2J4μYCARHVANSFDYWGQGTLVTVSSGSAS11VH251DXP′1J4μYCARQITMVRGVPFDYWGQGTLVTVSSGSAS12VH251D？J1μYCARQYFQHWGQGTLVTVSSGSAS13VH251DHQ52J6μYCARQTGDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSAS14VH251DXP′1J6μYCARHYYGSGSYDYYYYGMDVWGQGTTVTVSSGSAS15VH251DXP′1J4γ1YCARQGVGPGNPGHRLLSLHQ16VH105DXP′1J5μYCVRFWETGSTPGAREPWSPSPQGVH17VH251DXP′1J4γ1YCARRRYYGSGSYYNVFDYWGQGTLVTVSSGSTK18VH251DHQ52J4γ1YCARQTWGGDYWGQGTLVTVSSGSTK19VH251DK1J6γ1YCARGYSGYDNYYYGIHVWGQGTTVTVSSGSTK20VH251DHQ52J4μYCARQTGEDYFDYWGQGTLVTVSSGSAS21VH251DK1J2γ1YCARYSGYDYLLVLRSLGPWHPGHCLLSLHR22VH251D1R2J6γ1YCARASLPSFDYYGMDVWGQGTTVTVSSGSTK23VH251D1R2J4μYCARRGGGLTTGAREPWSPSPQGVH24VH105D？J6μYCVPVETLLLLLRYGRLGPRDHGHRLLRECI25VH105DXP1J4μYCVRDILTGZRDYWGQGTLVTVSSGSAS26VH251DM1J3μYCARHGIAAAGTAFDIWGQGTMVTVSSGSAS27VH105DHQ52J3μYCVRSTGVDAFDIWGQGTMVTVSSGSAS28VH251DN1J4μYCAEIAAAALLZLLGPGNPGHRLLRECI29VH105DN1J4μYCVCIAAAGKGNGYWGQGTLVTVSSGSAS30VH251DHQ52J4μYCARQNWGDYWGQGTLVTVSSGSASJ.CDR3长度分布表8比较了pHC1转基因小鼠和人PBL的来自框架VDJ连接点的转录物的CDR3肽的长度。此外，人PBL数据来自Yamada等。这些图与转基因小鼠的图很相似，只是与从人PBL观察到的相比，略微偏向了较小的CDR3肽。CDR3在转基因小鼠中的平均长度为10.3个氨基酸。这与Sanz(J.Immunol.1471720-1729(1991))报道的真正人CDR3肽的平均大小基本相同。表8CDR3长度分布发生率(±3％)#CDR3中的氨基酸HC1转基因小鼠人PBL3-826149-12484113-18263719-23＜17＞23≤11100％100％实施例13重排的重链转基因A.分离重排的人重链VDJ片段用λ1.3的含人重链J-μ内含子增强子的1kbPacI/HindIII片段筛选克隆到噬菌体载体λEMBL3/SP6/T7(ClonetechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)中的2个人白细胞基因组DNA文库。检测阳性克隆与下列VH特异性寡核苷酸的混合物的杂交情况oligo-75′-tcagtgaaggtttcctgcaaggcatctggatacaccttcacc-3′oligo-85′-tccctgagactctcctgtgcagcctctggattcaccttcagt-3′分离与V和J-μ探针均杂交的克隆并确定重排VDJ片段的DNA序列。B.构建重排的人重链转基因将含功能性VJ片段(开放阅读框架和剪接信号)的片段亚克隆到质粒载体pSP72中以便质粒衍生的XhoI位点与插入序列的5’末端相邻。用XhoI和PacI(PacI，一种稀少的切割酶，识别靠近J-m内含子增强子的位点)消化含功能性VDJ片段的亚克隆，将插入片段克隆到XhoI/PacI消化的pHC2中以产生一转基因构建体，该构建体含有功能性VDJ片段、J-μ内含子增强子、μ转换元件、编码μ恒定区的外显子、γ1恒定区，包含无效转录物相关的序列、γ1转换和编码外显子。用NtoI切割该转基因构建体，然后微注射到小鼠胚胎前核中以产生上述转基因动物。实施例14轻链转基因A.构建质粒载体1.质粒载体pGP1c用NtoI消化质粒载体pGP1a，然后连入下列寡核苷酸oligo-815′-ggccgcatcccgggtctcgaggtcgacaagctttcgaggatccgc-3′oligo-825′-ggccgcggatcctcgaaagcttgtcgacctcgagacccgggatgc-3′所得质粒pGP1c含有带XmaI、XhoI、SalI、HindIII和BamHI限制位点的多接头，多接头侧翼为NotI位点。2.质粒载体pGP1d用NtoI消化质粒载体pGP1a，然后连入下列寡核苷酸oligo-875′-ggccgctgtcgacaagcttatcgatggatcctcgagtgc-3′oligo-885′-ggccgcactcgaggatccatcgataagcttgtcgacagc-3′所得质粒pGP1d含有带SalI、HindIII、ClaI、BamHI和XhoI限制位点的多接头，多接头侧翼为NotI位点。B.分离Jκ和Cκ克隆用人κ轻链J区特异性的寡核苷酸筛选克隆到噬菌体载体λEMBL3/SP6/T7(ClonetechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)中的人胎盘基因组DNA文库oligo-365′-caccttcggccaagggacacgactggagattaaacgtaagca-3′然后分离噬菌体克隆136.2和136.5。从136.2中分离包含Jκ1片段的7.4kbXhoI片段，然后亚克隆到质粒pNN03中以产生质粒克隆p36.2。从噬菌体克隆136.5中分离含Jκ2-5以及Cκ基因片段的13kbXhoI片段，然后亚克隆到质粒pNN03中以产生质粒克隆p36.5。这两个克隆覆盖了开始于Jκ1上游7.2kb、终止于Cκ下游9kb的区域。C.构建重排的轻链转基因1.用于表达重排的可变片段的pCK1(一种Cκ载体)将含Cκ基因的质粒克隆p36.5的13kbXhoI插入片段，和下游9kb序列一起克隆到质粒载体pGP1c的SalI位点，使插入片段的5’末端与质粒XhoI位点相邻。所得克隆pCK1可接受克隆的片段，该片段在单一的5’XhoI位点含有重排的VJκ片段。然后用NotI切割所述转基因，然后用凝胶电泳从载体序列中纯化。所得的转基因构建体含有人J-Cκ内含子增强子并可含有人3’κ增强子。2.pCK2，带重链增强子的用于表达重排的可变片段的Cκ载体将小鼠基因组DNA含小鼠重链J-μ内含子增强子的0.9kbXbaI片段(J.Banerjietal.，Cell33729-740(1983))亚克隆到pUC18中以产生质粒pJH22.1。用SphI将该质粒线性化，然后用Klenow酶补平末端。然后用HindIII消化Klenow处理的DNA，然后将噬菌体克隆λ1.3的1.4kbMluI/HindIII片段(前实施例)(含有人重链J-μ内含子增强子(Haydayetal.Nature307334-340(1984)))与其相连。所得的质粒pMHE1由共同连接到pUC18中的小鼠和人重链J-μ内含子增强子组成以便将其切割在一个BamHI/HindIII片段上。分离所述2.3kb片段，然后克隆到pGP1c中以产生pMHE2。用SalI消化pMHE2，然后将p36.5的13kb片段克隆在其中。所得质粒pCK2与pCK1相同，不同之处在于小鼠和人重链J-μ内含子增强子与转基因插入片段的3’末端融合。为了调节最终转基因的表达，用不同的增强子，即小鼠或大鼠3’κ或重链增强子(MeyerandNeuberger，EMBOJ.81959-1964(1989)；Pettersonetal.，Nature344165-168(1990))产生类似的构建体。3.分离重排的κ轻链可变片段用含p36.5之3.5kbXhoI/SmaI的人κ轻链J区筛选克隆到噬菌体载体λEMBL3/SP6/T7(ClonetechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)中的两个人白细胞基因组DNA文库。检测阳性克隆与下列Vκ特异性寡核苷酸的杂交oligo-655′-aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagc-3′分离与V和J探针均杂交的克隆，然后确定重排的VJκ片段的DNA序列。4.产生含重排的人轻链构建体的转基因小鼠将含功能VJ片段的片段(开放阅读框架和剪接信号)亚克隆到载体pCK1和pCK2的单一XhoI位点以产生重排的κ轻链转基因。通过用NotI消化从载体序列中分离转基因构建体。将琼脂糖凝胶纯化的插入片段微注射到小鼠胚胎前核中以产生转基因动物。将表达人κ链的动物与含重链小座位的转基因动物交配以产生表达所有人抗体的小鼠。由于不是所有的VJκ组合均可与各种不同重链VDJ组合形成稳定的重-轻链复合物，所以产生数种不同的轻链转基因构建体，每个构建体使用不同重排的VJκ克隆，然后将得自这些构建体的转基因小鼠与表达重链小座位的转基因的小鼠交配。从双转基因(重链和轻链构建体)动物中分离外周血、脾和淋巴结淋巴细胞。用人和小鼠重链和轻链免疫球蛋白特异性的荧光抗体染色(Pharmingen，Sadiego，CA)，然后用FACScan分析仪(BectonDickinson，SanJose，CA)通过流式细胞计数分析，重排的轻链转基因构建体在最大数量的B细胞表面上产生最高水平的人重/轻链复合物，但对免疫细胞室没有不利影响(用B和T细胞亚组特异性抗体通过流式细胞计数检测的)，就其产生人单克隆抗体的情况进行筛选。D.构建未重排的轻链小座位转基因1.pJCK1，用于构建小座位转基因的含Jκ、Cκ的载体用Klenow酶处理含p36.5XhoI插入片段的13kbCκ，然后克隆到HindIII消化、Klenow处理的质粒pGP1d中。筛选质粒克隆以便使插入片段的5’末端与载体衍生的ClaI位点相邻。用ClaI消化所得质粒p36.5-1d，然后进行Klenow处理。然后用Klenow处理含Jκ1的p36.2的7.4kbXhoI插入片段，然后克隆到ClaI，Klenow处理的p36.5-1d中。筛选其中p36.2插入片段与p36.5插入片段同方向的克隆。该克隆pJCK1(图34)含有完整的人Jκ区和Cκ，以及7.2kb的上游序列和9kb下游序列。该插入片段还含有人J-Cκ内含子增强子并可含有人3’κ增强子。该插入片段侧翼为用于克隆其它3’侧翼序列(如重链或轻链增强子)的单一3’SalI位点。一个单一的XhoI位点位于该插入片段的5’末端以用于克隆未重排的Vκ基因片段。单一的SalI和XhoI位点又在NotI位点侧翼，所述NotI位点用于从载体序列中分离完整的转基因构建体。2.分离未重排的Vκ基因片段并产生表达人Ig轻链蛋白质的转基因动物用Vκ特异性寡核苷酸oligo-65(上述讨论的)检测克隆到噬菌体载体λEMBL3/SP6/T7(ClonetechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)中的人胎盘基因组DNA文库。测序来自所得克隆的可变基因片段，筛选有功能的克隆。判断功能性的标准包括开放阅读框架、完整的剪接衔接子和供体序列以及完整的重组序列。将含有所选可变基因片段的DNA片段克隆到质粒pJCK1的单一XhoI位点以产生小座位构建体。用NotI消化所得的克隆，分离插入片段，然后注射到小鼠胚胎前核中以产生转基因动物。这些动物的转基因将在发育的B细胞中进行V到J连接。将表达人κ链的动物与含重链小座位的转基因动物交配以产生表达全长人抗体的小鼠。实施例15基因组重链人Ig转基因本实施例描述了人基因组重链免疫球蛋白转基因的克隆，然后通过微注射到受精卵或整合在ES细胞中而将所述转基因导入鼠种系。按Marzluff，W.F.etal，(1985)(TranscriptionandTranslationAPracticalApproach，B.D.HammesandS.J.Higgins，eds.，pp.89-129，IRLPress，Oxford)所述，从新鲜人胚胎组织中分离核。将分离的核(或PBS洗涤的人精母细胞)植入0.5％低熔点琼脂糖块中，然后用1mg/ml溶于500mMEDTA中的蛋白酶K、1％SDS溶解核，或用1mg/ml500溶于mMEDTA中的蛋白酶K、1％SDS、10mMDTT在50℃将精母细胞溶解18小时。通过在50℃，将琼脂糖块保温在40μg/mlPMSF的TE中30分钟而使蛋白酶K失活然后用TE剧烈洗涤。然后按M.Finney在CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.Ausubeletal.，eds.JohnWiley&amp;Sons，Supp.4，1988，如2.5.1节)所述用限制酶NotI消化在琼脂糖中的DNA。然后按Anandetal，Nuc.AcidsRes.173425-3433(1989)所述通过脉冲场凝胶电泳分级分离NotI消化的DNA。用Southern杂交检测富集NotI片段的馏分，以检测一个或多个由该片段编码的序列。所述序列包含重链D片段、J片段和γ1恒定区以及所有6个VH家族的代表(尽管Bermanetal.，(1988)，同上文从Hela细胞中将该片段鉴定为670kb，但我们从人胚胎和精子DNA中发现其为830kb)。将含该NotI片段的那些馏分连接到所述载体pYACNN(McCormicketal.，Technique265-71(1990))的NotI克隆位点。通过用EcoRI消化pYANneo，然后在存在寡核苷酸5’-AATTGCGGCCGC-3’的条件下连接而制备质粒pYACNN。按Traver等(Proc.Natl.Acad.Sci.USA865898-5902(1989))所述，分离含重链NotI片段的YAC克隆。按M.Finney(出处同上)所述，通过脉冲场凝胶电泳从高分子量酵母DNA中分离克隆的NotI插入片段。通过加入1mM精胺浓缩所述DNA，然后按前述直接微注射到单细胞胚胎的核中。或者，通过脉冲场凝胶电泳分离DNA，然后通过脂转染(gnirkeetal.EMBOJ.101629-1634(1991))导入ES细胞，或将YAC通过原生质球融合导入ES细胞中。实施例16不连续的基因组重链Ig转基因基本按实施例1所述，通过YAC克隆分离人基因组DNA的85kbSpeI片段，该片段含有VH6、D片段、J片段、μ恒定区与部分γ恒定区。按所述分离携带来自种系可变区片段(如上述670-830kbNotI片段上游的570kbNotI片段，该片段含有多拷贝的V1-V5)的YAC。(Bermanetal，(1988)同上文检测了两个57kbNotI片段，每个片段均含有多拷贝V片段)。按实施例1所述将这两个片段共注射到小鼠单细胞胚胎的核中。通常，两个不同DNA片段的共注射会导致这两个片段整合在染色体上的一个插入位点上。因此，约50％含至少一个拷贝的两个片段之一的所得转基因动物将含有插入含恒定区之片段上游的V片段。在这些动物中，约50％将会通过DNA倒位，约50％通过缺失而进行V到DJ的连接，这取决于570kbNotI片段相对于85kbSpeI片段的方向。从所得转基因动物中分离DNA，然后通过Southern印迹杂交发现含这两个转基因的那些动物(具体地说，含多个人V片段和人恒定区的那些动物)，再按标准技术检测这些动物表达人免疫球蛋白分子的能力。实施例17鉴定转基因B细胞中功能性重排的可变区序列用所需抗原免疫接种(参见HarlowandLane，抗体实验室手册，冷泉港，纽约(1988))有下列遗传特征的小鼠在缺失JH的内源重链座位(实施例10)是纯合的；单拷贝未重排的人重链小座位转基因是半合子的(实施例5和14)；单拷贝重排的人κ轻链转基因是半合子的(实施例6和14)。免疫接种后，取出脾，用脾细胞产生杂交瘤。用来自各个杂交瘤克隆的细胞制备基因组DNA，所述克隆分泌与所需抗原反应的抗体。用一些不同限制酶消化基因组DNA样品，所述限制酶识别特有的6个碱基对序列，然后在琼脂糖凝胶上分级分离。用Southern印迹杂交鉴定2-10kb范围的两个DNA片段，其中一个含有单拷贝重排的人重链VDJ序列，另一个含有单拷贝重排的人轻链VJ序列。在琼脂糖凝胶上对这两个片段进行大小分级分离，然后直接克隆到pUC18中。然后将克隆的插入片段分别亚克隆到含恒定区序列的重和轻链表达盒中。用质粒克隆pγe1(实施例12)作为重链表达盒，将重排的VDJ序列克隆到XhoI位点。用质粒克隆pCK1作为轻链表达盒将重排的VJ序列克隆到XhoI位点。用所得克隆一起转染SP0细胞以产生与所需抗原反应的抗体(Co.etal.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA882869(1991)，该文献引入本文作为参考)。或者，从上述克隆的杂交瘤细胞中分离mRNA，然后用于合成cDNA。通过PCR扩增并克隆表达的人重和轻链VDJ和VJ序列(Larricketal.，Biol.Technology，7934-938(1989))。确定这些克隆的核苷酸序列后，合成编码相同多肽的寡核苷酸，按Queenetal.Proc.Natl.Acad.Sci，USA845454-5458(1989)所述产生合成的表达载体。用复合抗原免疫接种转基因动物下列试验说明用复合抗原(如在人红细胞上的那些)可成功地免疫转基因动物，并具有与正常动物中所观察到的反应动力学相似的反应动力学。通常血细胞是适宜的免疫原，并在红和白细胞表面含有许多不同类型的抗原。用人血免疫收集来自单个供体的人血试管，然后用于免疫转基因动物，所述转基因动物含有功能性破坏的内源重链座位(JHD)并含有人重链小基因构建体(HC1)；将这些小鼠命名为品系112。洗涤血并重悬在50mlHanks中并稀释到1×108个细胞/ml，用28号针头和1cc针管，将0.2ml(2×107个细胞)进行腹膜内注射。每周用该免疫接种方法免疫，连续6周。从经过眼眶后取血，然后收集血清，随后检测特异性抗体来监测血清滴度。也在免疫前取血作为对照。在最后一次免疫后，在将这些动物杀死制备血清和杂交瘤前3天，通过尾静脉内进行一次1×107个细胞的免疫以提高杂交瘤的生产。表9动物小鼠#2343和2348具有所需的表型在重链失效背景下，含有人重链小基因转基因。杂交瘤的生产通过将小鼠脾细胞与融合配对体融合来制备杂交瘤，所述小鼠脾细胞来自已按前述(上文)免疫的约16周龄转基因小鼠(表9)，所述融合配对体由不分泌HAT敏感性骨髓瘤细胞系X63Ag8.653组成。培养杂交瘤克隆，然后鉴定含免疫球蛋白的杂交瘤上清液，所述免疫球蛋白具有血细胞抗原特异性结合亲和力。流式细胞计数用流式细胞计数检测血清和杂交瘤上清液。用4XHanks’平衡的盐溶液洗涤来自供体的红细胞，然后将50000个细胞放在1.1ml聚丙烯微试管中。在染色培养基(1×RPMI1640培养基，不含酚红或生物素(IrvineScientific)3％新生牛血清，0.1％叠氮化钠)中，将细胞与抗血清或来自杂交瘤的上清液在冰上一起保温30分钟。对照由具有其它基因型的同窝小鼠组成。通过在4℃用SorvallRT600B以1000rpm离心5-10分钟来洗涤细胞。将细胞洗涤两次，然后用荧光显色试剂检测细胞表面上的抗体。使用两种单克隆试剂进行检测。一种是FITC-标记的小鼠抗人μ重链抗体(Pharmagen，SanDiego，CA)，另一种是PE-标记的大鼠抗小鼠κ轻链(Becton-Dickenson，SanJose，CA)。这两种试剂得到了相似的结果。全血(红细胞和白细胞)和白细胞只用作靶细胞。这两组都有阳性结果。将转基因小鼠和同窝对照的血清与来自供体的红细胞或来自另一个体的白细胞一起保温，洗涤然后用抗人IgMFITC标记的抗体显色并用流式细胞计数分析。结果表明来自人小基因座位转基因之小鼠(小鼠2343和2348)的血清有人IgM反应性，而所有同窝动物(2344、2345、2346、2347)均没有。将正常小鼠血清(NS)和磷酸盐缓冲液(PBS)用作阴性对照。红细胞不受闸门控制而白细胞受控制以便只包括淋巴细胞。在x和y轴上画出品系以提供参考。用来自融合2348的100份上清液完成流式细胞计数。4个上清液与血细胞抗原有阳性反应。实施例18用反义RNA降低内源小鼠免疫球蛋白表达A.用于表达反义Ig序列的载体1.构建克隆载体pGP1h用XhoI和BamHI消化载体pGP1b(前述实施例中提到的)，然后与下列寡核苷酸相连5′-gatcctcgagaccaggtaccagatcttgtgaattcg-3′5′-tcgacgaattcacaagatctggtacctggtctcgag-3′以产生质粒pGP1h。该质粒含有包含下列限制位点的多接头NotI，EcoRI，BglII，Asp718，XhoI，BamHI，HindIII，NotI。构建pBCE1将pVH251(前述实施例中提到的)的0.8kbXbaI/BglII片段插入XbaI/BglII消化的载体pNN03中以产生质粒pVH251，该片段含有启动子前导序列外显子、第一内含子、和人VH-V家族免疫球蛋白可变基因片段的部分第二外显子。将含人生长激素基因(hGH；Seeburg，(1982)DNA1239-249)的编码外显子的2.2kbBamHI/EcoRIDNA片段克隆到BglII/EcoRI消化的pGP1h中。用BamHI消化所得质粒，将pVH251N的BamHI/BglII片段以与hGH基因相同的方向插入以产生质粒pVhgh。将含小鼠重链J-μ内含子增强子(Banerjietal.，(1983)Cell33729-740)的小鼠基因组DNA的0.9kbXbaI片段亚克隆到pUC18中以产生质粒pJH22.1。用SphI将该质粒线性化，然后用Klenow酶补平末端。用HindIII消化Klenow处理的DNA，然后将含人重链J-μ内含子增强子(Haydayetal.，(1984)Nature307334-340)的噬菌体克隆λ1.3(前述实施例)的1.4kbMluI(Klenow)/HindIII片段克隆到其中。所得质粒pMHE1由一起连接到pUC18中的小鼠和人重链J-μ内含子增强子组成以便可将其切割在一个BamHI/HindIII片段上。将pMHE1的BamHI/HindIII片段克隆到BamHI/HindIII切割的pVhgh中以产生B细胞表达载体pBCE1。在图36中描述的该载体含有单一的XhoI和Asp718克隆位点，以便将反义DNA片段克隆到其中。由上游重链启动子-增强子与下游hGH基因序列组合驱动这些反义序列的表达，下游基因序列除提供促进转基因构建体表达的内含子序列外，还提供聚腺苷酸化序列。可通过用NotI消化从载体序列中分离从pBCE1产生的反义转基因构建体。B.IgM反义转基因构建体。用下列两个寡核苷酸作为引物5′-cgcggtaccgagagtcagtccttcccaaatgtc-3′5′-cgcctcgagacagctggaatgggcacatgcaga-3′通过用小鼠脾cDNA作为底物的聚合酶链反应(PCR)扩增小鼠IgM恒定区序列。用Asp718和XhoI消化所得的0.3kbPCR产物，然后将其克隆到Asp718/XhoI消化的pBCE1中以产生反义转基因构建体pMAS1。纯化的pMAS1的NotI插入片段单独微注射到半天的小鼠胚胎前核中或与一种或多种其它转基因构建体一起微注射到所述前核中以产生转基因小鼠。该构建体在B细胞中表达RNA转录物，所述转录物与小鼠IgMmRNA杂交，由此下调小鼠IgM蛋白质的表达。含pMAS1和人重链转基因小座位如pHC1(通过共注射这两种构建体或繁殖单转基因小鼠产生的)的双转基因小鼠将在B细胞上表达人转基因编码的Ig受体，其中所述B细胞的百分比高于只含人重链小座位的转基因小鼠的。表达人与小鼠Ig受体的细胞比率部分取决于两个种群对促进B细胞分化和增殖的各种因素和细胞的竞争。由于Ig受体在B细胞发育中起着关键的作用，因此表达小鼠Ig受体的B细胞将无法与表达人受体的细胞竞争，所述表达小鼠Ig受体的B细胞在B细胞发育过程中在其表面上表达降低水平的IgM(由于小鼠Ig特异性反义下调)。C.Igκ反义转基因构建体。用下列两个寡核苷酸作为引物5′-cgcggtaccgctgatgctgcaccaactgtatcc-3′5′-cgcctcgagctaacactcattcctgttgaagct-3′通过用小鼠脾cDNA作为底物的聚合酶链反应(PCR)扩增小鼠Igκ恒定区序列。用Asp718和XhoI消化所得的0.3kbPCR产物，然后将其克隆到Asp718/XhoI消化的pBCE1中以产生反义转基因构建体pKAS1。纯化的pKAS1的NotI插入片段单独微注射到半天的小鼠胚胎前核中或与一种或多种其它转基因构建体一起微注射到所述前核中以产生转基因小鼠。该构建体在B细胞中表达RNA转录物，所述转录物与小鼠IgκmRNA杂交，由此按与pMAS1所述下调小鼠Igκ蛋白质的表达。实施例19本实施例说明在本发明转基因小鼠中的成功的免疫和免疫反应。小鼠的免疫按以前公开的方法(PracticalImmunology，L.HudsonandF.C.Hay，BlackwellScientific(Pubs.)，p.0，1980)，将每分子结合有400以上二硝基苯基的匙孔血蓝蛋白(Calbiochem，LaJolla，California)(KLH-DNP)进行铝沉淀。将在100uL磷酸盐缓冲液(PBS)中的400ug铝沉淀的KLH-DNP和100ug二甲基二十八烷基溴化铝腹膜内注射给各小鼠。6天后通过眼眶后窦取血，收集血清样品。分析血清中的人抗体反应性用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)评估抗体反应性和特异性。试验数种靶抗原以分析由免疫原诱导的抗体。用匙孔血蓝蛋白(Calbiochem)鉴定抗蛋白质组分的反应性、牛血清白蛋白-DNP对半抗原和/或修饰的氨基的反应性以及KLH-DNP抗全免疫原的反应性。与抗原结合的人抗体通过与小鼠免疫球蛋白没有交叉反应性的IgM和IgG亚型特异性酶结合物来检测。简单地说，用抗原包被PVC微滴定板，然后37℃与5ug/ml蛋白质PBS溶液干燥过夜。在室温，将用PBS、5％鸡血清、0.5％吐温20稀释的血清样品加到孔中保温1小时然后加入相同稀释度的抗人IgGFc和IgGF(ab’)-辣根过氧化物酶或抗人IgMFc-辣根过氧化物酶。室温下1小时后，通过加入ABTS底物(Sigma，St.Louis，Missouri)来评估酶活性，然后30分钟后在415-490nm读出数据。在转基因小鼠中参与免疫反应的人重链图37A-37D说明了3只同窝小鼠对用KLH-DNP免疫的反应。1296号小鼠携带人IgM和IgG未重排的转基因并是小鼠Ig重链失效纯合的。1299号小鼠携带未失效背景下的转基因，而小鼠1301不遗传这些基因中的任何一组。另一同窝1297小鼠携带人转基因并且是小鼠重链失效半合子的。包括了未免疫对照。结果说明人IgG和IgM反应是针对与蛋白质结合的半抗原形成的。人IgM还对KLH分子有反应，但人IgG在此时的水平不显著。在来自相同小鼠的预免疫血清样品中，人抗体对相同靶抗原的滴度不显著。实施例20本实施例说明用人抗原成功地进行了免疫并在本发明转基因小鼠中的免疫反应，还提供了数据以说明在人转基因可变区序列中发生了非随机突变。说明抗人糖蛋白抗原的人免疫球蛋白重链的抗体反应用于试验的转基因小鼠是功能性破坏鼠免疫球蛋白重链座位纯合的，通过在连接(J)区(同上文)导入转基因而使得不存在功能性内源(鼠)重链产生而得到了所述小鼠。转基因小鼠还含有至少一个完整的未重排的人重链小座位转基因(HC1，同上文)，包含一个功能VH基因(VH251)、人μ恒定区基因和人γ1恒定区基因。对表达人免疫球蛋白转基因产物(同上文)的转基因小鼠进行筛选，用人抗原进行免疫以说明转基因小鼠产生抗人抗原免疫接种的免疫反应的能力。用人抗原注射3只HC1-26品系小鼠和3只HC！-57品系小鼠(同上文)。在0天，将在铝中不溶的100ug纯化人癌胚抗原(CEA)与完全弗氏佐剂一起注射，然后在7、14、21和28天每周再注射在不完全弗氏佐剂中的铝沉淀的CEA。在注射CEA前每天通过眼眶后取血收集血清样品。合并来自各组各3只小鼠的等体积血清用于分析。通过ELISA检测确定与固定在微滴定孔中的人CEA结合的含人μ链免疫球蛋白和含人γ链免疫球蛋白的滴度。在图38和39中分别列出了含人μ链免疫球蛋白和含人γ链免疫球蛋白的ELISA结果。两个品系在7天末均检测到显著的人μ链Ig滴度并观察到直到21天仍在产生。对于人γ链Ig，显著的滴度延迟，品系HC1-57首先在14天，HC1-26品系在21天。在试验过程中，人γ链Ig滴度随时间提高。观察到的人μ链Ig反应，然后是一平台，以及随后继续产生的γ链反应是与亲和力成熟一起观察到图谱的特征。分析21天的样品表明没有与不相关抗原匙孔血蓝蛋白(KLC)的反应，这表明抗体反应以特异性的方式针对CEA。这些数据表明人未重排免疫球蛋白基因座位的转基因动物(1)可对人抗原(如人糖蛋白，CEA)产生反应，(2)可通过观察到的μ到γ类型转换而进行同种型转换(类型转换)，以及(3)在其体液免疫反应中表现出亲和力成熟的特征。总之，这些数据表明(1)人Ig转基因小鼠具有诱导异源抗体生产的能力以应答确定的抗原，(2)单个转基因重链可变区应答特定抗原的能力，(3)在初级和二级反应形成中的反应动力学在一段时期内是典型的，(4)从IgM到IgG的转基因类型转换，所述转基因编码体液免疫反应，和(5)转基因动物生产抗人抗原的人序列抗体的能力。说明在人重链转基因小座位中的体细胞突变将品系HC1-57转基因小鼠(含多拷贝的HC1转基因)与免疫球蛋白重链缺失小鼠进行交配以获得含HC1转基因并在内源小鼠重链的两个等位基因上(同上文)均发生破坏的小鼠。这些小鼠表达人μ和γ1重链以及小鼠κ和λ轻链(同上文)。通过在1.5个月的时间内，腹膜内重复注射，而使这些小鼠中的一只对人癌胚抗原超免疫。将该小鼠杀死，然后从脾、腹股沟和肠系膜淋巴结以及淋巴集结中分离淋巴细胞。合并细胞，然后分离总RNA。从RNA合成第一条cDNA链，然后用其作为PCR扩增的模板，PCR使用下列2个寡核苷酸引物1495′-ctagctcgagtccaaggagtctgtgccgaggtgcagctg(g/a/t/c)-3′1515′-ggcgctcgagttccacgacaccgtcaccggttc-3′这些引物特异性地扩增VH251/γ1cDNA序列。用XhoI消化扩增的序列，然后克隆到载体pNN03中。图40中列出了来自23个随机克隆之插入片段的DNA序列；标明了来自种系序列的序列变异体，点表示与种系序列相同的序列。将cDNA序列与VH251转基因的种系序列进行比较，表明其中3个克隆完全未被突变，而其它20个克隆含有体细胞突变。3个未突变序列之一衍生于框架外的VDJ连接。在特定位置观察到的体细胞突变的频率和分布方式与在人淋巴细胞中观察到的相似(Caietal.，(1992)J.Exp.Med.1761073，该文献引入本文作为参考)。体细胞突变的总频率为约1％；但是，在CDR1内，频率上升到约5％，这表明对氨基酸改变的选择，它会影响抗原结合。这表明了抗原驱动的人重链序列的亲和力成熟。实施例21本实施例描述了通过共导入两个不同的多核苷酸，而成功地形成转基因，所述两个不同的多核苷酸可重组形成完整的人轻链小座位转基因。通过共注射两个重叠的DNA片段而产生未重排的轻链小座位转基因1.分离未重排的功能性vk基因片段vk65.3、vk65.5、vk65.8和65.15用VK特异性寡核苷酸oligo-65(5’-aggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagc-3’)检测克隆到噬菌体载体λEMBL/SP6/T7(ClonetechLaboratories，Inc.，PaloAlto，CA)中的人胎盘基因组DNA文库。将含有来自阳性噬菌体克隆的VK片段的DNA片段亚克隆到质粒载体中。测序来自所得克隆的可变基因的片段，筛选有功能的克隆。判断功能性的标准包括开放阅读框架、完整的剪接受体和供体序列以及完整的重组序列。在图41-44中列出了用该方法从4个不同质粒克隆中分离的4个功能性VK基因片段(vk65.3、vk65.5、vk65.8个65.15)的PNA序列。下面描述4个质粒克隆p65.3f、p65.5g1、p65.8和p65.15f。(1a)p65.3f将噬菌体克隆λ65.3的3kbXbaI片段亚克隆到pUC19中以便载体衍生的SalI位点靠近插入片段的3’末端和载体衍生的BamHI位点5’。将该克隆的3kbBamHI/SalI插入片段亚克隆到pGP1f中以产生p65.3f。(1b)p65.5g1将噬菌体克隆λ65.5的6.8kbEcoRI片段亚克隆到pGP1f中以便载体衍生的XhoI位点靠近插入片段的5’末端和载体衍生的SalI位点3’。所得质粒命名为p65.5g1。(1c)p65.8将噬菌体克隆λ65.8的6.5kbHindIII片段亚克隆到pSP72中以产生p65.8。(1d)p65.15f将噬菌体克隆λ65.16的10kbEcoRI片段亚克隆到pUC18中以产生质粒p65.15.3。将质粒插入片段内的VK基因片段定位到4.6kbEcoRI/HindIII亚片段上，然后将其克隆到pGP1f中。所得克隆p65.15f含有分别位于插入片段5’和3’末端的单一XhoI和SalI位点。2.pKV4将p65.8的XhoI/SalI插入片段克隆到p65.15f中的XhoI位点以得到质粒pKV2。将p65.5g1的XhoI/SalI插入片段克隆到pKV2中的XhoI位点以得到质粒pKV3。将pKV3的XhoI/SalI插入片段克隆到p65.3f中的XhoI位点以得到质粒pKV4。该质粒含有一个21kbXhoI/SalI插入片段，该片段含有4个功能性VK基因片段。还可用NotI切割完整的插入片段。3.pKC1B(3a)pKcor将衍生于人基因组DNA噬菌体λ克隆的两个XhoI片段亚克隆到质粒载体中。首先用Klenow酶处理含13kbJK2-JK5/CK的片段，然后克隆到HindIII消化的Klenow处理的质粒pGP1d中。筛选一个质粒克隆(pK-31)以便插入片段的5’末端与载体衍生的ClaI位点相邻。将第二个XhoI片段(含JK1的7.4kbDNA)克隆到XhoI/SalI消化的pSP72中，以便通过与载体SalI位点相连来破坏插入片段3’的XhoI位点。所得克隆p36.2s含有衍生于JK1ClaI位点上游的4.5kb插入片段和一个衍生于ClaI位点下游的多接头，用该多接头代替JK1和JK2之间天然的XhoI位点。用ClaI消化该克隆以释放4.7kb片段，然后以5’-3’的正确方向将其克隆到ClaI消化的pK-31中，以得到一质粒，该质粒含有所有5个人的JK片段、人内含子增强子CK、4.5kb的5’侧翼序列和9kb3’侧翼序列。该质粒pKcor在插入片段的5’和3’侧翼分别包含单一的侧翼XhoI和SalI位点。(3b)pKcorB将含人3’κ增强子的4kbBamHI片段(Judde，J-G和Max，E.E.(1992)，分子细胞生物学，125206，本文引用作为参考。)克隆到pGP1f中以便5’末端与载体XhoI位点相邻。用XhoI切割所得质粒p24Bf，然后将pKcor的17.7kbXhoI/SalI片段以与增强子片段相同的方向克隆到其中。所得质粒pKcorB在插入片段的5’和3’末端分别含有单一的XhoI和SalI位点。(3c)pKC1B将pKcorB的Xhol/SalI插入片段克隆到p65.3的SalI位点以产生轻链小座位转基因质粒pKC1B。该质粒包含一个功能性人VK片段，所有5个人的JK片段、人内含子增强子，人CK、和人3’κ增强子。通过NotI消化分离完整的25kb插入片段。4.Co4将来自质粒pKC4和pKC1B的两个NotI插入片段以各在微注射缓冲液中2.5ug/ml的浓度混合，然后共注射到前述实施例中半天小鼠胚胎的前核中。所得的转基因动物含有其中共整合了两个片段的转基因插入片段(命名为Co4，图45中所示的重组产物)。pKC4插入片段的3’3kb与pKC1B插入片段的5’3kb相同。一些整合过程将代表在3kb共有序列上两个片段的同源重组。Co4座位指导人序列轻链库在转基因小鼠中的表达。实施例22本实施例说明成功地生产了分泌与特异性免疫原反应之单克隆抗体的鼠杂交瘤克隆，其中所述单克隆抗体含有由人Ig转基因编码的人免疫球蛋白链。产生掺入人重链转基因产物的单克隆抗体1.免疫含人重链转基因的小鼠用纯化的人CEA免疫含人重链编码转基因以及内源重链座位失效(即功能破坏)纯合(参见实施例20同上文)的小鼠，然后在适宜的免疫反应期后收集脾细胞。用常规技术(参见KohlerandMilstein，Eur.J.Immunol.6511-519(1976)；HarlowandLane，抗体实验室手册，冷泉港，纽约(1988))将鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合以得到杂交瘤。用于免疫接种的小鼠含有人未重排的重链小座位转基因，该转基因含有一个功能性VH基因(VH251)、人D和J片段、人μ恒定区和人γ1恒定区基因。将从其产生的转基因小鼠品系命名为HC1-57(同上文)。在0天，将在铝中不溶的100ug纯化人癌胚抗原(CEA)(CyrstalChem，Chicago，ILorScrippsLabs，SanDiego，CA)与完全弗氏佐剂一起注射，然后在7、14、21和28天每周再注射在不完全弗氏佐剂中的铝沉淀的CEA。在83天，再经静脉内施用20ug可溶的CEA，然后在92天施用在不完全弗氏佐剂中的50ug铝沉淀的CEA。在将脾细胞与骨髓瘤细胞融合前，确定血清样品中对CEA的人重链反应。在95天杀死动物，取出脾并用聚乙二醇与P3X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞(ATCCCRL1580，美国典型培养物收集中心)融合。两周后，筛选来自融合孔的上清液是否存在与CEA特异性反应的抗体，并用ELISA确定是否含有人重链μ或γ恒定区表位。简单地说，将纯化的人CEA以2.5ug/ml包被到PVC微滴定板上，与用PBS、0.5％吐温20、5％鸡血清以1∶4或1∶5稀释的培养物上清液保温。洗涤平板，然后加入人IgGFc特异性的辣根过氧化物酶-结合的山羊抗血清或人IgMFc5Mu特异性的兔抗血清(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)。在进一步洗涤，并加入ABTS底物后，确定是否存在与捕获抗体结合的结合物。发现两个不同的融合孔含有基本上与CEA结合的抗体。克隆后，通过ELISA发现这两个杂交瘤均是人μ和鼠κ链阳性。用相似的试验未检测到小鼠IgG或IgM。亚克隆两个不同的亲本杂交瘤得到两个克隆，命名为92-09A4F7-A5-2和92-09A-1D7-1-7-1。根据布达佩斯条约，将两个品系保存在ATCC专利保藏中心，保藏号分别为HB11307和HB11308。通过用ELISA检测与数种纯化靶蛋白质反应性来评估来自这些细胞系的培养物上清液的特异性。如图46所示，确定单克隆抗体与各种抗原的反应性的ELISA说明只有CEA和CEA相关抗原NCA-2有显著的反应性，这表明异杂种免疫球蛋白分子的可变区产生了有限的反应性。实施例23本实施例描述了例如通过反式转换，可将由人Ig小座位转基因编码的重排的人VDK基因转录为包含内源Ig恒定区基因以编码嵌合人/小鼠Ig链的转录物。鉴定编码嵌合人-小鼠重链的反式转换转录物从内源重链J片段缺失纯合的超免疫HC1品系57转基因小鼠中分离RNA(同上文)。按照Taylor等(1993)(NucleicAcidsRes.206287，该文献引入本文作为参考)所述合成cDNA，然后用下列两个引入通过PCR扩增o-149(人VH251)5′-CTAGCTCGAGTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTG(G，A，T，C)-3′o-249(小鼠γ)5′-GGcGCTCGAGCTGGACAGGG(A/C)TCCA(G/T)AGTTCCA-3′寡核苷酸-149是HC1-编码的可变基因片段VH251特异性的，而o-249以下列特异性顺序与小鼠和人γ序列均可杂交小鼠γ1＝小鼠γ2b＝小鼠γ3＞小鼠γ2a＞＞人γ1。确定从PCR产物产生的10个随机所选克隆的DNA序列，并在图47中列出。两个克隆含有人VDJ和小鼠γ1；4个克隆含有人VDJ和小鼠γ2b；另4个克隆含有人VDJ和小鼠γ3。这些结果表明在转基因B细胞馏份中，转基因编码的人VDJ通过类型转换或类似的重组方法重组到了内源鼠重链座位中。实施例24本实施例描述了筛选杂交瘤库的方法，以便将编码嵌合人/小鼠Ig链的克隆与编码并表达人Ig链的克隆区别开。例如，在从转基因小鼠(含有人Ig重链转基因和J区破坏之内源重链座位纯合的)制备的杂交瘤克隆库中，可鉴定编码反式转换的人VDJ-鼠恒定区重链的杂交瘤克隆并将其与表达人VDJ-人恒定区重链的杂交瘤克隆分开。筛选除去嵌合Ig链的杂交瘤筛选方法包括两个步骤，所述步骤可单独或组合完成(1)初步的ELISA为基础的筛选，和(2)候选杂交瘤的第二分子特征。优选将初步的ELISA为基础的筛选用于初步鉴定表达人VDJ和人恒定区的候选杂交瘤。用一组与小鼠μ、γ、κ和λ和人μ、γ和κ特异性反应的单克隆抗体检测与抗原(如用于在转基因小鼠中引发抗体反应的免疫原)有阳性反应的杂交瘤。只将人重和轻链阳性以及小鼠链阴性的杂交瘤鉴定为表达人免疫球蛋白链的候选杂交瘤。因此，候选杂交瘤具有与特异性抗原反应性并具有人恒定区特征表位。从候选杂交瘤中分离RNA，然后用于合成第一条cDNA链。然后用RNA连接酶(连接单链DNA)将第一条cDNA链与预测序列(oligo-X)的独特单链寡核苷酸相连。然后用两组寡核苷酸引物，通过PCR在两个反应中扩增连接的cDNA。H组(重链)包含与人μ或人γ1(取决于ELISA的结果)特异性退火的寡核苷酸以及与oligo-X序列退火的寡核苷酸。这防止了检测特定V片段(包括小鼠V片段)的偏差，所述V片段可能已被反式重排到人小座位中。第二组引物L组(轻链)包括与人κ特异性退火的寡核苷酸以及与oligo-X特异性退火的寡核苷酸。分子克隆PCR产物，然后确定数个DNA序列以便在人和鼠Ig序列进行序列比较的基础上，确定杂交瘤是否生产单一的人抗体。实施例25本实施例描述了生产含人轻链(κ)小座位的转基因小鼠。人κ小座位转基因小鼠KC1将13kb含来自噬菌体克隆(通过与κ特异性寡核苷酸杂交而从人基因组DNA噬菌体文库中分离的，如同上文)片段的XhoIJκ2-Kκ片段用Klenow酶处理，然后克隆到Klenow处理的pGP1d的HindIII位点以产生pK-31。这样破坏了插入片段的XhoI位点并将单一多接头衍生的XhoI位点放在与Jκ2相邻的5’末端。将单一多接头衍生的ClaI位点放在该XhoI位点和插入片段之间，而单一多接头衍生的SalI位点被放在插入片段的3’末端。再从人基因组DNA噬菌体克隆(通过与κ特异性寡核苷酸杂交而从人基因组DNA噬菌体文库中分离的，如同上文)中分离含Jκ1和上游序列的7.5kbXhoI片段。将所述7.5kbXhoI片段克隆到pSP72(PromegaMadison，Wisconsin)的SalI位点，由此破坏这两个XhoI位点，并将多接头ClaI位点放在Jκ13’。用ClaI消化所得克隆释放了含Jκ1和4.5kb上游序列的4.7kb片段。将所述4.7kb片段克隆到pK-31的ClaI位点以产生pKcor。其余的单一5’XhoI位点衍生于多接头序列。将含未重排的人VκIII基因片段65.8(质粒p65.8，实施例21)的6.5kbXhoI/SalIDNA片段克隆到pKcor的XhoI位点以产生质粒pKC1。将pKC1的NotI插入片段微注射到1/2天小鼠胚胎中以产生转基因小鼠。建立两个不同的pKC1衍生的转基因小鼠品系，然后用其与含重和轻链小座位的小鼠交配。用Southern杂交来评估这些品系，KC1-673和KC1-674，以确定是否分别含有约1和10-20拷贝转基因的整合物。KC1e用BamHI和HindIII消化质粒pMHE1(实施例13和18)以切割含小鼠和人重链J-μ内含子增强子的2.3kb插入片段。将该片段用Klenow处理，与SalI接头(NewEnglandBiolabs，Beverly，Massachusetts)相连，然后克隆到pKC1的3’单一的SalI位点以产生质粒pKC1e。将pKC1的NotI插入片段微注射到1/2天小鼠胚胎中以产生转基因小鼠。建立4个不同pKC1e衍生的转基因小鼠品系，然后将其与含重和轻链小座位的小鼠交配。用Southern印迹杂交来评估这些品系，KC1e-1399、KC1e-1403、KC1e-1527和KC1e-1536，以确定是否分别含有约20-50、5-10、1-5和3-5拷贝转基因的整合物。pKC2将含未重排的人VκIII基因片段65.5(质粒p65.5g1，实施例21)的6.8kbXhoI/SalIDNA片段克隆到pKC15’的单一XhoI位点以产生质粒pKC2。该小座位转基因含有两个不同的功能VκIII基因片段。将pKC2的NotI插入片段微注射到1/2天小鼠胚胎中以产生转基因小鼠。建立5个不同的pKC2衍生的转基因小鼠品系，然后将其与含重和轻链小座位的小鼠交配。用Southern印迹杂交来评估这些品系，KC2-1573、KC2-1579、KC2-1588、KC2-1608和KC2-1610，以确定是否分别含有约1-5、10-50、1-5、50-100和5-20拷贝转基因的整合物。实施例26本实施例说明携带人κ转基因的转基因小鼠可产生抗原诱导的抗体反应，形成含功能人κ链的抗体。与人Igκ轻链相关的抗体反应将含HC1-57人重链和KC1e人κ转基因的转基因小鼠用纯化的人可溶性CD4(一种人糖蛋白抗原)免疫。在0天，将通过与聚苯乙烯乳胶颗粒(PolysciencesWarrington，PA)结合而不溶的20ug纯化的人CD4(NENResearch产品，Westwood，MA)在盐水中与二甲基二十八烷基溴化铝(Calbiochem，SanDiego，CA)一起腹膜内注射，然后再在20天和34天再注射。在25天和40天眼眶后取血，然后通过ELISA筛选是否存在含人IgM或人IgG重链的抗CD4抗体。简单地说，将纯化的人CD4以2.5ug/ml包被到PVC微滴定板上，与用PBS、0.5％吐温20、5％鸡血清以1∶4或1∶5稀释的培养物上清液保温。洗涤平板，然后加入人IgGFc特异性的辣根过氧化物酶-结合的山羊抗血清或人IgMFc5Mu特异性的兔抗血清(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)。在进一步洗涤，并加入ABTS底物后，确定是否存在与捕获抗体结合的结合物。在两种血中均检测到与抗原反应的人μ，而基本上没有可检测的γ反应性。用相同的试验，用山羊抗人κ过氧化物酶结合物(Sigma，St.Louis，MO)还检测了40天的样品的抗原-反应的人κ链。此时检测CD4-结合的κ反应性。图48中列出了结果。实施例27本实施例说明成功地产生了转基因小鼠，所述小鼠是功能破坏的鼠重链和轻链座位(重链和κ链座位)纯合的，并且同是含有人重链转基因和人轻链转基因，所述转基因能够进行再现性重排以编码功能性人重链和功能性人轻链。将所述小鼠命名为“0011”小鼠，前两个数字中的两个“0”表示小鼠没有功能性重和轻链座位，后两个数字中的“1”表示小鼠是人重链转基因和人轻链转基因半合的。本实施例说明所述0011小鼠能够对预定抗原产生特异性抗体反应，而且所述抗体反应可能涉及同种型转换。0011/0012小鼠内源性Ig失效+人Ig转基因将功能破坏的内源重链座位(不含功能JH区(命名为JHD++或JHΔ++)并含有人类HC1转基因，如上文所述的HC1-26转基因小鼠)纯合的小鼠与功能破坏的内源κ链座位(不含功能JH区(命名为JHD++或JHΔ++)见实施例9)纯合小鼠进行品种间杂交以产生功能破坏的重链和κ链座位纯合的小鼠(重链/κ链失效)，将其命名为JHD++/JKD++并含有一HC1转基因。通过品种间杂交产生所述小鼠并通过基因组DNA的Southern印迹评估的基因型来筛选。将命名为HC1-26/JKD++/JHD++小鼠的这些小鼠与含人κ链转基因的小鼠(品系KC2-1610，KC1e-1399和KC1e-1527；见实施例25)进行品种间杂交，用基因组DNA的Southern印迹分析来鉴定子代小鼠，所述子代小鼠是功能破坏的重和轻链座位纯合的并是HC1转基因和KC2或KC1e转基因半合的。将所述小鼠用数字命名，并鉴定其基因型，使用下列缩写HC1-26表示HC1-26品系的人重链小座位转基因整合的半合性；JHD++表示JH失效纯合性；JKD++表示JK失效纯合性；KC2-1610表示在品系KC2-1610中整合的KC2人κ转基因的半合性；KC1e-1527+表示在品系KC1e-1527中整合的KC1e人κ转基因的半合性；KC1e-1399+表示在品系KC1e-1399中整合的KC1e人κ转基因的半合性。将所得个体子代用数字命名(如6295、6907等)，并评估每个子代是否存在JH失效等位基因，JK失效等位基因、HC1-26转基因和κ转基因(KC2或KC1e)并确定在各座位是半合(+)还是纯合(++)。表10列出了一些子代小鼠的数字命名、性别和基因型。表10编号性别Ig编号基因型6295M0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC2-1610+6907M0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC1e-1527+7086F0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC1e-1399+7088F0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC1e-1399+7397F0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC1e-1527+7494F0012HC1-26+；JHD++；JKD++；KC2-1610++7497M0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC1e-1399+7648F0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC2-1610+7649F0012HC1-26+；JHD++；JKD++；KC2-1610++7654F0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC2-1610+7655F0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC2-1610+7839F0011HC1-26+；JHD++；JKD++；KC1e-1399+7656F0001HC1-26-；JHD++；JKD++；KC2-1610+7777F1100Co1-2141-；JHD+；JKD+我们从3只6周龄雌性小鼠中取出脾。用Southern印迹杂交确定小鼠#7655是HC1(品系26)和KC2(品系1610)基因整合半合的以及小鼠μ和κJ区JHΔ和JκΔ靶缺失纯合。用Southern印迹杂交确定小鼠#7656是KC2(品系1610)转基因整合半合的以及小鼠μ和κJ区JHΔ和JκΔ靶缺失纯合。用Southern印迹杂交确定小鼠#7777是小鼠μ和κJ区JHΔ和JκΔ靶缺失半合。由于这些缺失的退化性质，该小鼠在表型上应是野生型。在0011小鼠中表达内源Ig链用FACS分析分类来自下列的淋巴细胞，所述FACS分析使用一组与人μ、小鼠μ、人κ、小鼠κ或小鼠λ有反应性的抗体(1)野生型小鼠(7777)，(2)重链和κ失效等位基因纯合并含有人轻链转基因的0001小鼠(7656)，和(3)重链和κ失效等位基因纯合并含有人轻链转基因以及人重链转基因的0011小鼠(7655)。我们按Mishell和Shiigi所述(Mishell，B.B.&amp;Shiigi，S.M.(eds)SelectedMethodsinCellularImmunology.W.H.Freeman&amp;Co.NewYork，1980)从脾和溶解的红细胞用NH4Cl制备单细胞悬浮液。用下列试剂将淋巴细胞染色二碘化丙锭(MolecularProbes，Eugene，OR)、FITC结合的抗人IgM(克隆G20-127；Pharmingen，SanDiego，CA)、FITC结合的抗小鼠IgM(克隆R6-60.2；Pharmingen，SanDiego，CA)、藻红蛋白结合的抗人Igκ(克隆HP6062；CalTag，SouthSanTrancisco，CA)、FITC结合的抗小鼠Igλ(克隆R26-46；Pharmingen，SanDiego，CA)、FITC结合的抗小鼠B220(克隆RA3-6B2；Pharmingen，SanDiego，CA)、和Cy-Chrome结合的抗小鼠B220(克隆RA3-6B2；Pharmingen，SanDiego，CA)。用FACScan流式细胞计数器和LYSESII软件(BectonDickinson，SanJose，CA)分析染色的细胞。通过在前向和侧翼面扫描栅排除巨噬细胞和残留的红细胞。通过滤过二碘化丙锭阳性细胞来排除死细胞。图49和50中的流式细胞计数数据证明了Southern印迹杂交数据并说明小鼠#7655表达人μ和人κ，如果有任何小鼠μ和小鼠κ的话也是极少的。然而，B细胞的大部分馏份(约70-80％)似乎表达由人重和小鼠λ轻链组成的杂种Ig受体。图49表示在细胞表面上表达人μ或小鼠μ的B细胞的相对分布情况；0011小鼠(7655)淋巴细胞是人μ阳性，但相对缺乏小鼠μ；0001小鼠(7656)淋巴细胞不表达很多的人μ或小鼠μ；野生型小鼠(7777)淋巴细胞表达小鼠μ但不表达人μ。图50表示在细胞表面上表达人κ或小鼠κ的B细胞的相对分布情况；0011小鼠(7655)淋巴细胞是人κ阳性，但相对缺乏小鼠κ；0001小鼠(7656)淋巴细胞不表达很多的人κ或小鼠κ；野生型小鼠(7777)淋巴细胞表达小鼠κ但不表达人κ。图51表示在细胞表面上表达小鼠λ的B细胞的相对分布情况；0011小鼠(7655)淋巴细胞是小鼠λ阳性；0001小鼠(7656)淋巴细胞不表达明显的小鼠λ；野生型小鼠(7777)淋巴细胞表达小鼠λ但其水平与0011小鼠(7655)相比相当低。图52表示与人κ(转基因编码的)相比，内源小鼠λ阳性的B细胞的相对分布情况。顶上左边组表示来自野生型小鼠细胞的结果，所述小鼠表达功能性内源重和轻链等位基因，但不表达人转基因；所述细胞是小鼠λ阳性的。顶上右边组表示来自小鼠(#5822)细胞的结果，所述小鼠具有κ失效背景(JKD++)并含有KC1e-1399品系的人κ转基因整合；很多比例的所述细胞是人κ或小鼠λ阳性的。下面左边组表示来自小鼠(#7132)细胞的结果，所述小鼠具有κ失效背景(JKD++)并含有KC2-1610品系的人κ转基因整合；小鼠λ阳性的细胞多于人κ阳性的，可能说明KC2-1610转基因整合的效率比KC1e-1399转基因整合的效率低。下右组表示来自含人κ小座位转基因(KCo4)并不含功能性内源鼠κ等位基因的小鼠细胞。图52中所列的数据还说明转基因之间表型表达的可变性。所述可变性表示需要筛选表达一个或多个产生于整合的转基因(如同种型转换、高水平表达、低鼠Ig背景)的所需表型特征的个体转基因和/或转基因小鼠品系。通常分别使用一种或多种转基因(如pKC1e、pKC2、KCo4)以形成通过下列特征区别的多个个体转基因品系(1)转基因，(2)转基因整合的位点和/或(3)遗传背景。检测各个转基因品系的所需参数如(1)对预定抗原产生免疫反应的能力，(2)在转基因编码的恒定区内进行同种型转换的频率和/或反式转换成内源(如鼠)Ig恒定区基因的频率，(3)转基因编码的免疫球蛋白链和抗体的表达水平，(4)内源(如鼠)免疫球蛋白序列的表达水平，和(5)生产性VDJ和VJ重排的频率。通常，筛选生产最大浓度转基因编码(如人)免疫球蛋白链的转基因品系；优选所筛选的品系在转基因动物的血清中生产约至少40ug/ml转基因编码的重链(如人μ或人γ)和/或至少100ug/ml转基因编码的轻链(如人κ)。检测在小鼠未免疫血清和用特异性抗原如人CD4免疫后其血清中，小鼠表达人和鼠免疫球蛋白链的情况。图53表示在4个各种基因型的未免疫接种的0011小鼠血清中，人μ、人γ、人κ、小鼠μ、小鼠γ、小鼠κ和小鼠λ链相对表达情况(nt＝未检测)；人κ是最多的轻链，人μ和鼠γ(推测是反式转换的产物)是最多的重链，但品系之间有所变化，这说明用选择步骤来鉴定有利的基因型组合可使鼠链的表达最小，而表达人链。小鼠#6907和7088表示人μ到人γ的同种型转换(在转基因内的顺式转换)。图54表示各种0011基因型的小鼠中，人μ、人γ、人κ、小鼠μ、小鼠γ、小鼠κ和小鼠λ链的血清免疫球蛋白链水平。在0011小鼠中的特异性抗体反应按下列免疫方法，用致免疫剂量的人CD4免疫0011小鼠(#6295)，0天，腹膜内注射100μlCD4小鼠免疫血清；1天，注射在乳胶珠上和100ulDDA中的20ug人CD4(AmercanBio-Tech)；15天，注射在乳胶珠上和100ulDDA中的20ug人CD4(AmericanBio-Tech)；29天，注射在乳胶珠上和100ulDDA中的20ug人CD4(AmericanBio-Tech)；43天，注射在乳胶珠上和100ulDDA中的20ug人CD4(AmericanBio-Tech)。图55表示在3星期或7星期对CD4免疫的有关抗体反应，说明抗CD4反应中，人μ、人γ或人κ链的存在。人γ链在7周血清中显著增加，说明在重链转基因内的顺式转换(同种型转换)以时间关系方式发生，这与在野生型动物中的同种型转换方式相似。图56是人各种重链和轻链转基因的示意图。实施例28本实施例提供了鼠λ轻链座位的靶失效。鼠λ轻链座位的靶失效与Ig重和κ轻链座位不同，鼠VλJλ和Cλ基因片段不按照5’-3’排列分成3个家族，而是散布的。最多的5’部分由两个V片段(Vλ2和VλX)组成，然后以3’方向为两个恒定区外显子，每个外显子都与其自己的J片段(Jλ2Cλ2和假基因Jλ4Cλ4)相连。接着是使用最广泛的V片段(Vλ1)，其后为第二簇恒定区外显子(Jλ3Cλ3和Jλ1Cλ1)。整个座位跨约200kb，在两簇之间有～20-90kb的间隔序列。λ座位表达涉及Vλ2或VλX大部分重排成Jλ2，而很少再在3’重排成Jλ3或Jλ1。Vλ1可与Jλ3和Jλ1重组。因此可突变λ座位以便完全消除该座位的重组和表达。两个λ基因簇之间的距离使得很难通过产生一个致密的靶缺失而使该座位的表达失活，如在使鼠Ig重链和κ轻链座位失活时所用的。然而，可以使得不表达λ轻链的小的单缺失可跨约120kb，从Jλ2Cλ2到Jλ1Cλ1(图57)。这样除去了所有的λ恒定区外显子以及Vλ1基因片段，从而确保使该座位失活。构建取代型靶向载体(ThomasandCapecchi(1987)出处同上)，其中用选择性标记基因neo取代在PGK表达盒中的缺失的120kb。将该标记植入缺失侧翼的基因组λ序列内以提供与λ座位的同源性，而且还可含有HSV-tk基因，该基因可在同源区的任一末端，以便富集具有同源整合的载体的细胞。通过筛选与待靶向的ES品系同基因的菌株129/Sv基因组噬菌体文库，可得到λ座位基因组克隆序列，因为已经报导，用与待靶向染色体DNA同基因的靶向载体可提高同源重组的效率。构建同源长度与λ座位不同的靶向载体。第一个载体(载体1图58)含有标记基因，其侧翼为共约8-12kb的λ座位序列。对于其中用取代载体介导几kbDNA增加或缺失的靶向过程，这已经表明高于同源性的充足程度(Hastyetal.(1991)出处同上；Thomasetal.，(1992)出处同上)。构建含有另外约40-60kb侧翼λ序列的载体(载体2，图58)。常规克隆至少80kb的人Ig小座位，然后在质粒载体pGP1(Tayloretal.，(1993)，出处同上)中繁殖。使λ座位失活的另一种方法是使用两个独立的突变，例如在同一ES细胞中突变两个恒定区簇或两个V区座位。由于两个恒定区都被包含在约6kb的DNA内，而一个V座位跨约19kb，所以构建靶向载体以独立地缺失Jλ2Cλ2/Jλ4Cλ4和Jλ3Cλ3/Jλ1Cλ1座位。如图58所示，各载体均由PGK表达盒中的选择性标记(如neo或pac)组成，该标记周围为消除了各缺失的约8-12kbλ座位基因组DNA。可将HSV-tk基因加到靶向载体中以便通过阳性-阴性筛选来富集同源重组事件。用这两个载体连续靶向ES细胞，以便产生携带缺失恒定区座位之一的克隆；然后用所述两个载体连续靶向这些克隆，以便产生携带缺失恒定区座位之一的克隆，然后靶向这些克隆以产生其余功能性恒定区簇的缺失。因此由于两个靶向事件均是针对同一细胞，所以优选两个靶向事件使用不同的选择性标记。在图58所示的方案实例中，载体之一含有neo基因，另一个含有pac(嘌呤霉素N乙酰基转移酶)基因。第三种潜在的显性选择性标记是hyg(潮霉素磷酸转移酶)基因。pac和hyg基因均可被插入到PGK表达构建体中，成功地将neo基因靶向Ig重和κ轻链座位。由于两个λ恒定区簇紧紧相连，所以重要的是两个突变位于同一染色体上。优选两个独立的靶向事件有50％的可能性突变同一等位基因，在从双靶ES细胞衍生的嵌合体繁殖过程中，通过其共分离而建立这两个突变的连锁。实施例29本实施例提供了靶失效鼠重链座位。靶失效鼠重链座位用靶向具有图59所示之结构的转基因的同源重组基因以通过在ES细胞中靶向基因而缺失至少一个，但优选基本上所有鼠重链座位恒定区基因。图59说明靶向转基因的一般方法。片段(a)是位于待缺失的恒定区基因上游的克隆的基因组DNA序列(即，靠近JH基因)；片段(b)含有阳性选择标记，如pgk-neo；片段(c)是位于待缺失恒定区基因下游(即恒定区基因和JH基因远端)的克隆的基因组DNA序列；而片段(d)(任选的)含有阴性选择标记基因(如HSV-tk)。图60是从ImmunoglobulinGenes，Honjo，T，Alt，FWandRabbisTH(eds)AcademicPress，NY(1989)p.129得到的鼠重链座位图谱。具有图59所示结构的靶向转基因，其中(1)(a)片段是克隆JH8.1(Chenetal.，(1993)Int.Immunol.5647)的11.5kb插入片段或含有约至少1-4kb鼠Cμ基因上游的序列，(2)(b)片段是上文所述的pgk-neo，(3)(c)片段含有图61所示的1674bp序列或从小鼠Cα基因的噬菌体克隆中分离的4-6kb插入片段，用末端标记的具有下列序列的核苷酸筛选小鼠基因组克隆文库而分离出所述Cα基因5’-gtgttgcgtgtatcagctgaaacctggaaacagggtgaccag-3’和(4)(d)片段含有上文所述的HSV-tk表达盒。或者，逐步缺失一个或多个重链恒定区基因，其中第一靶向转基因含有同源区，即片段(a)和(c)(所述同源区与恒定区基因侧翼的序列同源)、第一种阳性选择性标记基因(pgk-neo)和HSV-tk阴性选择性标记。因此，(a)片段含有至少约1-4kb的序列，并与Cγ3上游区同源，(c)片段含有至少约1-4kb的序列，并与Cγ2a基因上游区同源。该靶向转基因缺失Cγ3、Cγ1、Cγ2b和Cγ2a基因。将所述第一靶向转基因导入ES细胞中筛选正确的靶向重组(如用G418)，以产生正确靶向的C区缺失。然后阴性筛选HSV-tk表达盒的丢失(如用9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤或FIAU。所得的正确靶向的第一轮C缺失重组体含有丢失了Cγ3、Cγ1、Cγ2b和Cγ2a基因的重链座位。第二靶向转基因含有同源区，即片段(a)和(c)，与恒定区基因侧翼序列同源、与第一种(如gpt或pac)不同的第二种阳性选择标记以及HSV-tk阴性选择标记。因此，(a)片段含有至少约1-4kb的序列，并与Cε上游区同源，(c)片段含有至少约1-4kb的序列，并与Cα上游区同源。该靶向转基因缺失了Cε和Cα基因。将所述第二靶向转基因导入从第一靶向事件得到的正确靶向C区的重组体ES细胞中。用选择性药物筛选正确靶向第二失效事件(即与第二靶向转基因通过同源重组)的细胞，所述选择性药物是第二种阳性选择性标记基因(如酶酚酸以选择gpt；嘌呤霉素以筛选pac)特异性的。然后阴性筛选HSV-tk表达盒的丢失(例如，用9-(1，3-二羟-2-丙氧甲基)鸟嘌呤或FIAU)。所得的正确靶向的第二轮C区重组体含有丢失了Cγ3、Cγ1、Cγ2b、Cγ2a、Cε和Cα基因的重链座位。将不含一个或多个C区基因的正确靶向的第一轮或第二轮重组体ES细胞按上述(见上文)用于胚细胞注射并产生嵌合小鼠。建立靶向重链等位基因的种系传递，繁殖所得的建立者小鼠以产生C区失效纯合的小鼠。与JH失效小鼠相比，所述C区失效小鼠有数种优点；例如C区失效小鼠在人重链转基因和内源重链座位恒定区之间进行反式转换的能力降低(或完全失去该能力)或，由此降低了转基因小鼠中嵌合人/小鼠重链的频率。鼠γ基因失效是优选的，尽管通过同源靶向也经常缺失μ和δ。可将C区失效与在内源鼠重链座位中的其它靶向损伤同时进行；将C区缺失与JH失效组合以消除鼠重链座位的生产性VDJ重排并防止或降低人重链转基因与鼠重链座位等之间的反式转换。对于某些实施方案，需要生产特异性丢失一个或多个内源重链座位C区基因，但保留某种其它C区基因的小鼠；例如如果所述IgA赋予一种有利的表型并基本上不会干扰小鼠的所需实用性的话，优选保留鼠Cα基因以便通过反式转换生产嵌合人/小鼠IgA。实施例30本实施例描述了从含人转基因的转基因小鼠中得到的淋巴细胞样品中，来自体内的淋巴细胞耗尽，所述淋巴细胞表达内源(鼠)免疫球蛋白。通过与抗鼠免疫球蛋白抗体的特异性结合来选择性地耗尽表达鼠Ig的淋巴细胞，所述抗鼠免疫球蛋白抗体基本上不与由所述转基因编码的人免疫球蛋白结合。来自体内的表达鼠Ig的B细胞的耗尽将人重链小座位转基因(HC2)和人轻链小座位转基因(Kco4)纯合的小鼠与C57BL./6(B6)自交系小鼠交配以得到2211小鼠(即小鼠是功能性内源鼠重链座位纯合的，是功能性内源鼠轻链座位纯合的，而且还含有一个拷贝的人重链转基因和一个拷贝的人轻链转基因)。所述2211小鼠还表达B6主要的和少量的组织相容性抗原。将这些小鼠用致免疫剂量的抗原免疫，约1周后分离脾细胞。按标准方法(Wysockietal.，(1978)Proc.Natl.Acad.Sci.USA752844；MACS磁珠细胞分类，MiltenyiBiotecInc.，Sunnyvale，CA)通过固相结合的抗体依赖性细胞分离法，除去鼠Ig阳性的B细胞，然后通过抗体依赖性补体介导的细胞溶解(SelectedMethodsinCellularImmunology，MishellBBandShiigiSM(eds)，W.H.FreemanandCompany，NewYork，1980，pp.211-212)以基本上除去鼠Ig阳性的残留B细胞。将耗尽样品中的剩余细胞(如T细胞、人Ig阳性B细胞)优选与其它抗鼠Ig抗体一起静脉内注射到SCID/B6或RAG/B6小鼠中，以耗尽产生的B细胞。然后用抗原进一步免疫重建的小鼠以得到抗体以及用于生产杂交瘤克隆的亲和力成熟的细胞。实施例31在体细胞嵌合体中生产全部人抗体描述了在体细胞嵌合小鼠中用于生产全部人抗体的方法。通过将胚胎干(ES)细胞导入RAG-1或RAG-2缺陷型小鼠的胚细胞中来生产这些小鼠，所述胚胎干细胞携带人免疫球蛋白(Ig)重和轻链转基因，但没有功能性鼠Ig重和κ轻链基因。RAG-1或RAG-2缺陷型小鼠(Mombaertsetal.，(1992)Cell，68869；shinkaietal.，(1992)Cell68855)由于不能启动VDJ重排并组装编码Igs和T细胞受体(TCR)的基因片段而不含有鼠B和T细胞。通过将野生型ES细胞注射到从RAG-2缺陷型小鼠产生的胚细胞中而在B和T细胞生产中产生所述缺陷。所得的嵌合小鼠生产完全衍生于注射的ES细胞的成熟B和T细胞(Chenetal.，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA904528)。将注射的ES细胞的遗传操作用于将特定的突变和/或内源DNA构建体导入嵌合体的所有B和/或T细胞中。Chen等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA904528-4532得到了携带纯合Ig重链座位失活的ES细胞，然后将所述细胞注射到RAG胚细胞中，产生可生产T细胞但不产生B细胞的嵌合体。将重排的鼠重链转染到突变ES细胞中，使B细胞发育获救并在嵌合体中同时生产B和T细胞。可产生不合成鼠Ig重链或κ轻链的、表达全部人抗体的嵌合体小鼠。将人Ig重和轻链构建体导入ES细胞中，所述ES细胞是鼠Ig重链或κ轻链基因均失活的纯合细胞。然后将ES细胞注射到来自RAG缺陷型小鼠的胚细胞中。所得的嵌合体含有只衍生于注射的ES细胞的B细胞，所述注射的ES细胞不能表达鼠Ig重链或κ轻链基因，但表达人Ig基因。产生免疫球蛋白重和κ轻链基因失活的纯合的ES细胞分别按照已知的方法(Chenetal.，(1993)EMBOJ.12821；andChenetal.，(1993)Int.Immunol.出处同上)，在ES细胞中通过靶向缺失IgJH和Jκ/Cκ序列而产生携带失活Ig重和κ轻链座位的小鼠。将两个突变品种的小鼠交配在一起以产生两个Ig座位失活的纯合的品种。将该双突变品种用于衍生ES细胞。所用的方法基本上是Robertson所述的方法(1987，inTeratocarcinomasandEmbryonicStemCellAPracticalApproach，p.71-112，editedByE.J.Robertson，IRLPress)。简单地说，通过纯合双突变小鼠的自然交配产生胚细胞。在怀孕2.5天，对怀孕雌性小鼠进行卵巢切割，在怀孕7天从子宫中取出“延迟的”胚细胞，在饲养细胞上培养以有助于使其保持未分化状态。通过形态学鉴定从胚细胞的内细胞群中捡出干细胞，解离，然后在饲养细胞上传代。鉴定有正常核形的细胞，检测雄性细胞系产生嵌合体的能力，然后提供小鼠生殖细胞。雄性ES细胞对于雌性品种是优选的，因为雄性嵌合体可产生更显著的子代。将人Ig基因导入小鼠Ig重和κ轻链缺陷型ES细胞将人免疫球蛋白重和轻链基因以小座位构建体，如HC2和KC-C04或YCA克隆如J1.3P导入突变ES细胞。通过如电穿孔或用阳离子脂脂转染的技术来用人IgDNA转染ES细胞。为了选择已掺入人DNA的ES细胞，将选择性标记与构建体相连或将其与构建体一起共转染到ES细胞中。由于产生Ig基因失活的基因靶向事件，突变ES细胞含有新霉素磷酸转移酶(neo)基因，因此，可用不同的选择性标记如潮霉素磷酸转移酶(hyg)或嘌呤霉素N乙酰基转移酶(pac)以便将人Ig基因导入ES细胞。用不同的选择性标记，可将人Ig重和轻链基因同时或依次导入突变的ES细胞。转染后，用适宜的选择性标记筛选细胞，扩增药物抗性菌落用于冷冻和DNA分析以确定并分析人基因序列的整合。生产嵌合体按所述(Bradley，A.(1987)，InTeratocarcinomasandEmbryonicStemCellAPracticalApproach，P.113-151，editedbyE.J.robertson，IRLPress)将含人Ig重和轻链基因的ES克隆注射到RAG-2胚细胞中并转换进假孕雌性小鼠子宫中。通过血清样品的ELISA试验筛选存在人抗体的子代。将阳性动物用于免疫并生产人单克隆抗体。实施例32本实施例描述了通过ES细胞中的同源重组，将靶向移码突变导入鼠重链座位，从而经转换重组缺失B细胞。移码小鼠是含非鼠(如人)转基因的适宜宿主，所述转基因编码人序列免疫球蛋白。可用新移码的小鼠表达由重链转基因和/或轻链转基因编码的非鼠(如人)序列免疫球蛋白，并用于分离从导入的转基因表达类型转换的、亲和力成熟的人序列抗体的杂交瘤，以及其它用途。将一个移码导入到4个小鼠JH基因片段中的一个并导入到小鼠μ基因的第一外显子中。两个所导入的移码突变彼此补偿，由此当B细胞将移码的JH用于功能性VDJ连接时，表达全功能的鼠μ重链。未将另3个JH片段中的任何一个用于功能性VDJ连接，因为在μ中的移码，在其余的JH基因中不能得到补偿。或者可将补偿移码改造成多个鼠JH基因。补偿的、移码的免疫球蛋白重链等位基因纯合的小鼠含有接近生理水平的外周B细胞，以及接近生理水平的含鼠和人μ的血清IgM。但是恢复成生发中心的B细胞经常经类型转换而转换成非μ同种型。在表达内源鼠μ链的B细胞中所进行的所述类型转换会导致表达未补偿的移码mRNA，因为其余的非μCH基因没有补偿的移码。所得的B细胞不表达B细胞受体并被缺失。因此，在其到达发生同种型转换的分化阶段后，缺失了表达鼠重链的B细胞。但是，表达非鼠(如人)转基因编码之重链的B细胞能够再进一步发育，包括进行同种型转换和/或亲和力成熟等，所述转基因能够进行同种型转换，但不含有所述同种型限制移码。因此，移码的小鼠就鼠重链(μ)而言，具有受损伤的二级反应，但与转基因编码的重链有显著的二级反应。如果将能够进行类型转换的重链转基因导入该突变背景，通过表达转基因的B细胞就能突出非IgM二级反应。因此可以从这些移码小鼠中分离亲和力成熟的表达人序列免疫球蛋白的杂交瘤。此外，移码小鼠一般具有免疫保护水平的鼠IgM，在人重链转基因仅编码有限的可变区库的情况下，这是有利的。为了制备分泌人序列单克隆抗体的杂交瘤，免疫转基因突变小鼠；将其脾细胞与骨髓瘤细胞系融合；然后筛选表达转基因编码的人非μ同种型的杂交瘤。此外，移码小鼠比JH缺失小鼠优越，因为它含有与转录的VDJ相邻的功能性μ转换序列，所述转录的VDJ可作为顺式转换的活性底物(Guetal.(19993)Cell731155)；从而降低表达嵌合人/小鼠抗体的反式转换的B细胞的水平。构建移码载体构建两个不同的移码载体。用其中一个载体在小鼠J4基因片段的3’末端导入2个核苷酸，用另一载体从小鼠μ基因外显子1的5’末端缺失相同的2个核苷酸。1.JH载体将覆盖小鼠重链J区和μ内含子增强子的3.4kbXhoI/EcoRI片段亚克隆到质粒载体中，所述质粒载体含有在磷酸甘油酸酯激酶启动子控制下的新霉素抗性基因以及疱疹胸苷激酶基因(tk/neo盒；Hastyetal.，(1991)Nature350243)。然后用该克隆作为产生2个不同PCR片段的底物，所述PCR使用下列寡核苷酸引物o-A15′-ccacactctgcatgctgcagaagcttttctgta-3′o-A25′-ggtgactgaggtaccttgaccccagtagtccag-3′o-A35′-ggttacctcagtcaccgtctcctcagaggtaagaatggcctc-3′o-A45′-aggctccaccagacctctctagacagcaactac-3′用寡核苷酸o-A1和o-A2扩增SphI和KpnI消化的1.2kb片段。用寡核苷酸o-A3和o-A4扩增KpnI和XbaI消化的0.6kb片段。然后将这两个消化的片段克隆到SphI/XbaI消化的质粒A中以产生质粒B。质粒B在J4的末端含有2个核苷酸的插入，另外，在插入片段上游含有一新KpnI位点。用KpnI位点作为插入的诊断性标记。可将其它侧翼序列克隆到质粒B的5’XhoI位点和3’EcoRI位点以提高其同源重组的效率。然后用SphI或另一种在插入片段内有一个位点的限制酶消化所得质粒，然后电穿孔到胚胎干细胞中，接着胺Hasty等(1991)所述(出处同上)用G418筛选。以Southern印迹杂交鉴定同源重组体，然后按Hasty等所述用FIAU选择以获得缺失的亚克隆，所述亚克隆在JH4中仅含与2个碱基对的插入以及一个新KpnI位点。用KpnI消化的DNA的Southern印迹杂交鉴定这些克隆并用PCR扩增的JH4DNA的DNA序列分析证实。所得小鼠含有已从未突变序列...TGGGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCAG＿gtaagaatggcctctcc...TrpGlyGlnGlyThrSerValThrVAlSerSerGlu转换成突变序列的JH4片段...TGGGGTCAAGGTACCTCAGTCACCGTCTCCTCAGAGgtaagaatggcctctcc...TrpGlyGlnGlyThrSerValThrVAlSerSerGluμ外显子1载体用与上述相似的体外诱变方法，将2个碱基对插入到JH4基因片段中，组装PCR产物和基因组亚克隆以产生在第一μ外显子5’末端含2个碱基对缺失的载体。另外，为了标记该突变，通过将A变成G而将一个新XmnI位点导入下游。未突变的μ基因序列是...ctggtcctcagAGAGTCAGTCCTTCCCAAATGTCTTCCCCCTCGTC...GluSerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal突变的μ基因序列是XmnI...ctggtcctcag＿AGTCAGTCCTTCCCGAATGTCTTCCCCCTCGTC...SerGlnSerPheProAsnValPheProLeuVal将含突变序列的同源重组载体线性化并电穿孔到含JH4插入的ES细胞系中。从新霉素抗性克隆中鉴定同源重组体。通过KpnI/BamHI消化的DNA的Southern印迹杂交，鉴定那些同源重组体，所述重组体含有与JH4插入在同一染色体上的移码插入。JH4插入与新KpnI位点有关，该位点将KpnI/BamHI片段J-μ内含子的大小从来自野生型的11.3kb减小到突变的9kb。然后用FIAU筛选缺失了插入的tk/neo盒的所得克隆。通过XmnI消化DNA的Southern印迹杂交来鉴定含突变μ外显子的克隆。通过PCR扩增的μ外显子1DNA的DNA序列分析证实所述突变。产生移码小鼠将含有JH4的2碱基对插入并在μ外显子1中含2个碱基对缺失的ES细胞导入胚细胞阶段的胚胎中，将所述胚胎插入假孕雌性小鼠中以产生嵌合体。繁殖嵌合动物以获得种系传递并繁殖所得的动物达到纯合以获得突变动物，所述突变动物是补偿移码重链座位纯合的，并在表达鼠重链的B细胞中有损伤的二级体液免疫反应。可将人重链转基因，如pHC1或pHC2等通过将含所述人转基因的小鼠杂交育种成含移码鼠IgH座位的小鼠交配到鼠重链移码背景中。通过杂种繁殖和反交，在鼠IgH座位产生μ补偿的移码鼠IgH等位基因(即仅能够补偿鼠μ的框架中表达，但对鼠非μ链则不行)纯合的，并含有至少一整合拷贝的功能性人重链转基因(如pHC1或pHC2)小鼠。所述小鼠还可含有如上文所述的内源鼠κ和/或λ座位失效，并还可含有人或其它非鼠轻链转基因(如pKC1e，pKC2等)。或者人转基因(重和/或轻链)可含有补偿的移码，以便转基因J基因含有由转基因恒定区基因中的移码补偿的移码。对内源恒定区基因的反式转换得不到补偿，并产生一截短的或无意义产物；筛选表达所述未补偿反式转换的免疫球蛋白的B细胞并进行耗尽。实施例33通过D区消除使内源重链失活本实施例描述了阳性-阴性筛选同源重组载体，将该载体用于用非功能重排的VDJ片段取代小鼠种系免疫球蛋白重链D区。所得等位基因在B细胞内作为正常非生产性等位基因发挥作用，并含有经等位基因内重链类型转换的等位基因，由此降低反式转换成活性转基因座位的水平。D区靶向构建体分离位于鼠D区上游的8-15kbDNA片段，然后用寡核苷酸探针从小鼠菌株129噬菌体文库进行亚克隆，所述探针含有GenBank所列DFL16.1片段的约50个连续核苷酸的公开序列。DFL16.1是上游D片段(即V区基因簇的近端，恒定区基因簇的远端)。同样，分离含JH3、JH4、Eμ、Sμ和μ恒定区前两个编码外显子的9.5kbBamHI片段，然后从小鼠品种129基因组噬菌体文库中亚克隆。然后从小鼠杂交瘤(任何菌株)分离5-10kb重排的VDJ，将合成的含终止密码子的接头插入到J片段中。J内的终止接头对于框架外的VDJ连接是优选的，这可能是由于V取代重排的可能性。将这3个片段与pGKneo阳性选择盒和PGKHSVtk阴性选择盒组装在一起以形成阳性-阴性选择载体，用于通过同源重组消除129-衍生的ES细胞中的小鼠D区(如AB1)。通过将8-15kbDNA片段与阳性选择盒(如PGKneo)相连形成靶向载体，选择盒本身与重排的5-10kb重排的VDJ相连，重排的VDJ本身与9.5kbBamHI片段相连；然后将阴性选择盒(如PGKHSVtk)连在靶向构建体的任一末端。图63中图示说明了所述D区靶向构建体的构建。将D区靶向构建体转移到AB1ES细胞中，胺上述进行阳性和阴性选择，克隆正确靶向的ES细胞。将正确靶向的ES细胞克隆用于胚细胞注射，然后产生嵌合小鼠。繁殖嵌合小鼠以产生含D区失活的重链等位基因的建立者小鼠。将子代进行杂种繁殖以产生没有功能内源重链座位的纯合体。用所述纯合体近交含人Ig转基因(如pHC1，pHC2，pKC2，pKC1e，Kco4)的小鼠以产生(通过与不含功能D区的纯合体进一步回交)不含功能内源重链座位，但含有人重链转基因(也优选人轻链转基因)的小鼠。在保留某些功能性内源轻链座位(如λ座位)的实施方案中，一般优选转基因含有转录控制序列，所述控制序列指导高水平表达人轻链(如κ)多肽，并因此使转基因座位与保留的内源轻链(如λ)座位进行有效的竞争。例如与pKC1在转基因动物中内源λ座位进行有效竞争的能力相比，一般优选Co4κ轻链转基因。实施例34本实施例描述通过共注射人κ轻链小座位和含部分人Vκ座位的酵母人工染色体，来扩展人轻链转基因V基因库。通过共注射含Vκ的YACDNA和κ小座位而导入功能性人轻链V片段从公开可得到的ICRFYAC文库的克隆4×17E1(Larinetal.，(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)884123；GenomeAnalysisLaboratory，ImperialCancerResearchRund，London，UK)中，得到作为未扩增YACDNA的约450kbYAC克隆，该克隆含部分人Vκ座位。按制造商的说明(CHEFDR-II电泳细胞，Bio-RadLaboratories，Richmond，CA)，用标准脉冲场凝胶电泳不用预先扩增就可分离450kbYAC克隆。用溴化乙锭将6个脉冲肠凝胶染色，从凝胶上切下含YAC克隆DNA的凝胶物质，然后包埋在三角形凝胶托盘中的新凝胶(在标准凝胶缓冲液中的低熔点琼脂糖)模中。将所得的三角形凝胶(含6个切割的含YAC的凝胶块)在窄琼脂糖凝胶的顶点展开，所述凝胶含2M醋酸钠和标准电泳缓冲液。然后将凝胶放在浸入到标准凝胶缓冲液中的电泳槽中。在缓冲液表面上形成Y形凝胶形成物，以便电流仅流过窄的高盐凝胶部分。将聚异丁烯酸树脂块放在高盐凝胶片上以防止醋酸钠扩散到缓冲液中。然后将YACDNA电泳出原切割的凝胶片(包埋的)，而电泳入窄高盐凝胶部分。在从低盐凝胶到高盐凝胶过渡的时候，有一个电阻压降，可有效地防止DNA在三角形凝胶顶点的迁移。电泳并用溴化乙锭染色后，从凝胶的其余部分切出浓缩的YACDNA，然后用GELase(EpiCentreTechnologies，Madison，Wisconsin)消化琼脂糖。然后将氯化铯加到所得的含YAC的液体中以得到1.68g/ml的密度。将该溶液以37000rpm离心36小时，以便将YACDNA与任何污染物分开。分离0.5ml所得密度梯度的馏份，将峰DNA馏份用5mMTris(pH7.4)，5mMNaCl，0.1MEDTA透析。透析后，发现所得的0.65mlYACDNA溶液的浓度为含2μg/mlDNA，将所述YACDNA与来自质粒pKC1B和pKV4之插入片段的纯化DNA混合，比例为20∶1∶1(微克YAC4×17E1KC1BKV4)。将所得2ug/ml溶液注射到半天的B6CBF2胚胎前核中，将95个存活的微注射胚胎转移到假孕雌性小鼠的输卵管中。生出12个从微注射胚胎发育的小鼠实施例35本实施例描述在免疫的转基因小鼠中的类型转换、体细胞突变和B细胞发育，所述转基因小鼠是失活内源免疫球蛋白座位纯合的，并含有HC1或HC2重链转基因。为了说明人序列种系构型小座位可在功能上取代真正的座位，我们将不含内源IgH的小鼠品种与含人种系构建IgH转基因的小鼠品种交配。两个转基因小座位HC1和HC2分别包括1和4个功能可变(V)片段、分别10和16多样性(D)片段、所有6个连接(JH)片段和μ和γ1两个恒定区片段。小座位包括人顺式作用调节序列-如JH-μ内含子增强子和μ和γ1转换序列-与编码片段紧紧相连。它们还包括衍生于大鼠IgH座位3’末端的另一增强子元件。我们将HC1和HC2转基因小鼠与干细胞衍生的突变小鼠杂交，所述干细胞衍生的突变小鼠没有所述(见上文)的JH片段(JHD小鼠)并因此不能进行功能重链重排。所得的转基因JHD小鼠含有依赖于所导入的重链序列的B细胞。免疫和杂交瘤我们通过腹膜内注射50-100ug抗原来免疫小鼠。抗原包括人癌胚抗原(CEA；CrystalChem，chicago，IL)、鸡卵白溶菌酶(HEL；Pierce，Rockford，IL)和匙孔戚蓝蛋白(KLH；Pierce，Rockford，IL)。为了进行第一次注射我们将抗原与完全弗氏佐剂混合，对于随后的注射，我们使用不完全弗氏佐剂(GibcoBRL，Gaithersburg，MD)。我们将脾细胞与非分泌的小鼠骨髓瘤P3X62-Ag8.653(ATCCCRL1580)融合。我们用ELISA检测血清样品和杂交瘤上清液，以确定是否存在特异性和非特异性的含人重链序列的抗体。为了检测非特异性抗体，我们用人重链同种型特异性抗体(小鼠单克隆抗体α人IgG1，克隆HP6069，Calbiochem，LaJolla，CA；小鼠单克隆抗体α人IgM，克隆CH6，TheBindingSite，Birmingham，UK)包被微滴定孔，然后用过氧化物酶结合的抗血清(从多克隆山羊α人IgG(fc)辣根过氧化物酶结合的亲和力纯化的fab片段，cat#109-036-098；亲和力纯化的辣根过氧化物酶结合的多克隆兔α人IgM(fc)，cat#309-035-095，JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)显色。为了检测抗原特异性抗体，我们用抗原包被微滴定孔，用过氧化物酶结合的人重链同种型特异性抗血清显色。我们通过与过氧化氢和2，2’-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(SigmaChem.Co.，St.louis，MO)一起保温来检测结合的过氧化物酶。通过在415nm的吸收值来测量反应产物，然后校正成490nm的吸收值。流式细胞计数我们从脾、骨髓和腹腔中制备单细胞悬浮液，然后按MishellandShiigi所述用NH4Cl溶解红细胞。用下列试剂将淋巴细胞染色藻红蛋白结合的抗小鼠Igκ(克隆X36；BectonDickinson，SanJose，CA)、FITC结合的抗小鼠IgD(克隆SBA1；SouthernBiotech，AL)、FITC结合的抗小鼠CD5(克隆53-7.3；BectonDickinson，SanJose，CA)、FITC结合的抗小鼠Igλ(克隆R26-46；Pharmingen，SanDiego，CA)、和Cy-Chrome结合的抗小鼠B220(克隆RA3-6B2；Pharmingen，SanDiego，CA)。用FACScan流式细胞计数器和LYSESII软件(BectonDickinson，SanJose，CA)分析染色的细胞。通过在前向和侧翼面扫描栅排除大多数巨噬细胞、嗜中性白细胞和残留的红细胞。B细胞区室获救在HC1转基因-JHD动物的腹腔中，我们发现了正常水平的CD5+B细胞和约1/4正常水平的常规CD5-B细胞。转基因腹膜CD5+B细胞与正常动物中所述的所谓B-1细胞相似它们大于常规B和T淋巴细胞，它们表达B22的水平比在脾中发现的常规B细胞的低，它们包括较高比例的表达λ轻链的细胞。90％以上的脾B细胞表达κ，而50％以上的腹膜B细胞表达λ。因此，当常规B细胞的水平在所有组织中均匀减少时，B-1的水平(报导说有更大的自我更新能力)在HC1转基因JHD动物中似乎是正常的。类型转换在转基因JHD小鼠中，与抗原重复接触会导致生产人γ1抗体和μ抗体。我们将人CEA以每周的间隔注射给转基因JHD小鼠，在4周的时间内监测抗原特异性IgM和IgG1血清水平(图63)。在第一周有可检测的IgM反应，但没有IgG1反应。但是，在2周后，IgG1反应比IgM反应大，而且会继续增加，而IgM反应保持相对稳定。这中模式-开始是IgM反应，然后是IgG反应，-是典型的二级免疫反应；表明在转基因中所包含的顺式作用序列可应答指导类型转换的细胞因子。我们认为表达非μ同种型有3种可能的机制，每种机制均已在文献中讨论过。这些机制是改变的剪接，不包括μ基因缺失；“δ型”转换，通过侧翼重复序列之间的同源重组而涉及μ基因缺失；转换区之间的非同源重组。下面描述的我们试验的结果是转换区重组模式的标志。两种非缺失选择剪接机制可有助于解释同种型转换。首先，可能是从转基因表达了覆盖μ和γ1的单个转录物；可将所述转录物进行不同的剪接以应答通过与抗原接触而诱导的细胞因子。或者可将开始于γ1上游的细胞因子诱导的无效转录物进行反式剪接以形成μ转录物。如果这两种机制中的任何一种均不足以解释人γ1序列的表达，则我们预期可分离表达μ和γ1的杂交瘤。但是，尽管我们筛选了数百个表达人μ或人γ1的杂交瘤，但我们未发现任何所述双生产者(μ+和γ1+)杂交瘤。这表明γ1的表达需伴有μ基因的缺失。通过μ和γ1转换区之间的非同源重组或通过两个侧翼400bp同向重复序列(σμ和∑μ)之间的同源重组来介导μ基因的缺失，所述同向重复序列包含在HC1和HC2转基因中。已经报导认为σμ和∑μ之间的缺失重组是产生某些人B细胞IgD+、IgM+表型的原因。第一种机制，非体液转换重组应产生不同长度的转换产物，而第二种机制σμ/∑μ重组应总是产生相同的产物。我们用Southern印迹分析了从3个杂交瘤分离的基因组DNA(图64)，一个表达μ，两个表达γ1。我们发现转基因γ1上游的基因组重排只在两个γ1转换区(图64B)。此外，所观察到的任何一个结构均不与σμ和∑μ之间的同源重组相符。因此我们的结论与γ1同种型表达的模型一致，所述γ1同种型表达是由编码μ和γ1转换区的转基因之间的缺失非同源重组介导的。反式转换除人γ1外，我们在HC1和HC2转基因JHD小鼠血清中发现了小鼠γ。我们还从这些动物得到了表达小鼠γ的杂交瘤。由于非转基因纯合JHD动物不表达可检测水平的小鼠免疫球蛋白，因此我们将HC1和HC2转基因JHD小鼠中，小鼠γ的表达归因于反式转换现象。我们分析的所有转基因杂交瘤均表达小鼠或人恒定区序列中的任一种，但不会同时表达两者。因此涉及反式剪接机制是不可能的。我们用PCR扩增法分离反式转换产物的cDNA克隆，确定所得10个克隆的核苷酸序列(图65)。在PCR扩增中的5’寡核苷酸是转基因编码VH251特异性的，3’寡核苷酸是小鼠γ1、γ2b和γ3序列特异性的。我们发现了反式转换产物的实例，在所述反式转换产物中掺入了所有这3个小鼠恒定区。体细胞突变图7中所示的反式转换产物可变区内的约1％的核苷酸不是由种系编码的。这可能是由于体细胞突变而产生的。由于已将突变的序列转座到内源座位，因此指导这些突变的顺式作用序列可能在小鼠γ转换区3’的任何位置。但是，正如我们下文所讨论的，我们还发现在VDJ片段中的体细胞突变，所述突变未经过所述转座；该结果说明在转基因中包含了重链体细胞突变所需的序列。为了确定HC1和HC2构建体是否包含足以使转基因JHD小鼠中发生体细胞突变的顺式作用序列，我们分离并部分测序了衍生于两个独立HC1转基因品系和一个HC2品系的cDNA克隆。我们发现来自转基因JHD小鼠的某些γ1转录物含有带广泛体细胞突变的V区。这些突变转录物的频率似乎随重复的免疫接种而增加。图66A和66B列出了两组cDNA序列一组衍生于HC1(品系26)转基因JHD小鼠，在分离RNA前5天，我们通过注射一次抗原而免疫了所述小鼠；第二组衍生于HC1(品系26)转基因JHD小鼠，我们在分离RNA前5个月，开始每隔3天通过注射抗原而使所述小鼠超免疫；第二组衍生于HC1(品系26)转基因JHD小鼠，我们在分离RNA前5个月，开始每隔3天通过注射抗原而使所述小鼠超免疫。接触5天后的小鼠的13个V区中，只有2个含有任何非种系编码的核苷酸。这些V中的每个均只含有一个核苷酸改变，该样品产生总体细胞突变的频率不到0.1％。相反，来自超免疫动物的13个V序列没有一个完全是种系的，总的体细胞突变频率为1.6％。比较从一个组织样品中分离的μ和γ1转录物表明，体细胞突变的频率在经过类型转换的转基因拷贝中更高。我们从超免疫HC1品系57转基因JHD小鼠中分离并部分测序了47个独立的μ和γ1cDNA克隆(图67A和67B)。就种系序列而言，大部分μcDNA克隆是未修饰的，而一半以上的γ1克隆含有多个非种系编码的核苷酸。表达γ1的细胞不同于表达μ的细胞，而两种方法不是必需相连的，类型转换和体细胞突变发生在同一B细胞亚种群中。尽管我们在未超免疫的CH1转基因小鼠中未广泛地发现VH251基因的体细胞突变，但我们在自然HC2转基因小鼠的VH56p1和VH51p1基因中发现了相当多的体细胞突变。我们从未免疫的9周龄雌性HC2转基因动物中分离了脾和淋巴结RNA。我们用V和γ1特异性引物，逐个扩增γ1转录物，在所述转录物中在HC2转基因中掺入了4个V区中的一个。特异性PCR产物的相对产率是VH56p1＞VH51p1＞VH4.21＞VH251。尽管该技术未严格定量，但可以说明在HC2小鼠偏向使用V片段。图68表示23个随机捡出的γ’cDNA序列，所述序列衍生于使用等摩尔混合的所有4种V特异性引物所进行PCR扩增。我们再次观察到偏向VH56p1(19/23克隆)。此外，VH56p1序列有相当的体细胞突变，在V基因片段内的总频率为2.1％。检测CDR3序列表明，尽管19个VH56p1克隆中的17个是单一的，但它们只衍生于7种不同的VDJ重排事件。因此在自然动物中可能是通过内源病原体或自身抗原筛选了表达VH56p1的B细胞。可能相关的是所述同一基因在人胎儿库中是过度表现的(over-represented)。总结上游顺式作用序列限定了各个转换区的功能，而且对于类型转换是必需的。我们的观察结果-在HC1转基因中的类型转换主要限于与二级反应有关的细胞，而且在整个B细胞种群中不是随机发生-这说明转基因内所含的最小序列就足够了。由于在该构建体中所含的γ序列仅开始于γ无效转录物起始位点上游的116个核苷酸，因此转换调节区是致密的。我们的结果表明这些重要的顺式作用调节元件要么与各个γ基因紧密相连，要么与HC1和HC2转基因中所含的3’重链增强子相连。由于HC1和HC2插入片段进行转基因自体类型转换-这可作为已经进行了体细胞突变的序列的标记-我们能够很容易地发现超突变转录物，所述转录物不是来源于向内源座位的转座。我们在3个独立的转基因品系(两个HC1品系和一个HC2品系)中发现了体细胞突变的γ转录物。因此转基因整合位点侧翼的序列不可能影响该过程；相反，转基因序列足以指导体细胞突变。实施例36本实施例描述从小鼠产生杂交瘤，所述小鼠是失活内源免疫球蛋白座位纯合的并含有编码人序列重链和轻链的转基因序列。所述杂交瘤分泌单克隆抗体，所述单克隆抗体含有人序列重链和人序列轻链并与在T淋巴细胞上表达的预定抗原结合。本实施例还说明小鼠产生人序列抗体以应答人衍生的免疫原(人CD4)的能力，以及所述小鼠作为制备杂交瘤的来源的适宜性，所述杂交瘤分泌与人抗原反应的人序列单克隆抗体。A.产生从用人CD4抗原免疫的HC1转基因小鼠中衍生的人Ig单克隆抗体免疫转基因小鼠，所述小鼠是功能破坏的JH座位纯合的并含有能够进行重排以编码人序列重链的转基因和能够进行重排以编码人序列轻链的转基因。所述小鼠的表型是HC1-26+KC1e-1536+JHD+/+JKD-，说明是鼠重链失活纯合的并存在种系拷贝的HC1人序列重链转基因和KC1e人序列轻链转基因。用表达小鼠-人杂种CD4分子(该分子由稳定转染的多核苷酸编码)的EL4细胞系(ATCC)变异体免疫小鼠。表达的CD4分子含有基本上类似人的CD4序列。在0天，将在100ulPBS与100ul完全弗氏佐剂中的5×106个细胞经腹膜内注射导入小鼠。在7、14、21、28、60和77天重复接种，在18、35和67天检测血样。在81天取出脾，然后将约7.2×107个脾细胞与约1.2×107个融合配对细胞(P3×63Ag8.653细胞系；ATCC)通过标准方法(PEG融合法)融合，然后在RPMI164015％FCS、4mM谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠加HAT和PSN培养基中培养。进行多融合。使杂交瘤生长并用ELISA检测上清液与市售的、在CHO细胞中表达的纯化重组可溶人序列CD4(AmericanBio-Technologies，Inc.(ABT)，Cambridge，MA)和/或得自NEN-DuPont的CD4的结合情况。ABT样品含纯化的55kD人CD4分子，该分子含有人CD4的V1-V3结构域。将重组的人序列CD4(在CHO-K1细胞中生产的)吸附到检测板上，然后用于捕获来自杂交瘤上清液的抗体，然后评估捕获的抗体与一组抗体(所述抗体结合人μ、人κ、人γ、鼠μ或鼠κ)的结合情况。将一个杂交瘤亚克隆到其培养板孔中，命名为1F2、与ABTCD4制剂结合的1F2抗体是人μ和人κ阳性的，但是人γ、小鼠γ和小鼠κ阴性的。B.产生从用人CD4和人IgE免疫的HC2转基因小鼠中衍生的人Ig单克隆抗体图56中列出了重链转基因，并已在上文作了描述(参见实施例34)。通过将两个克隆的DNA片段共整合在小鼠基因组的一个位点中而产生图56中所述的人轻链转基因Kco4。该片段含有4个功能VK片段、5个J片段、CK外显子和所有两个内含子和下游增强子元件(参见实施例21)(MeyerandNeuberger(1989)EMBOJ.81959-1964；JuddeandMax(1992)，Mol.CellBiol.125206-5216)。由于这两个片段享有共同的3kb序列(见图56)，所以它们可以有效整合到基因组DNA中作为一个连续的43kb转基因，然后在重叠序列之间进行同源重组。已经表明所述重组事件经常发生在微注射重叠的DNA片段后(Pieperetal.，(1992)NucleicAcidsRes.201259-1264)。共注射的DNA还倾向于共整合在受精卵中，各克隆片段中所含的序列随后在B细胞发育过程中通过DNA重排而被连接。表12表明，来自至少2个转基因品系的转基因插入片段是有功能的。在该组36个克隆中代表了VJ连接的实例，所述VJ连接掺入了4个转基因编码的V片段中的一个和5个J片段中的一个。表12</tables>在KCo4转基因小鼠中人轻链V和J片段的使用。该表列出了从两个转基因品系的cDNA扩增的PCR克隆的数量，所述品系含有所示人κ序列。用从w各个KCo4转基因小鼠(小鼠#8490，3mo.，雄性，KCo4系4437；小鼠#8867.2.5mo..雌性KCo4系4436)分离的脾RNA合成cDNA。用下列CK特异性寡核苷酸5’TAGAAGGAATTCAGCAGGCACAACAACAGAGGCAGTTCCA3’和下列2个VK特异性寡核苷酸的1∶3混合物5’AGCTTCTCGAGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCC3’和5’CAGCTTCTCGAGCTCCTGCTACTCTGGCTC(C，A)CAGATACC3’通过PCR扩增cDNA。用XhoI和EcoRI消化PCR产物，然后克隆到质粒载体中。通过双脱氧链终止法，确定从各动物中随机捡出的18个克隆的部分核苷酸序列。将各克隆的序列与未重排转基因的种系序列进行比较。从注射的胚胎发育出了23个轻链小座位阳性和18个重链阳性小鼠。将这些小鼠和其子代与在内源小鼠重链(品种JHD)和κ轻链座位(品种JCKD)含靶向突变的小鼠交配以得到含人重和κ轻链，不含功能性小鼠重和κ轻链座位的小鼠。在这些小鼠中，如果有的话，仅小鼠轻链来自小鼠λ座位。表13说明体细胞突变发生于转基因小鼠的转基因编码的人重链转录物可变区中。将来自HC2转基因小鼠的23个cDNA克隆部分测序以确定在可变区内非种系编码的寡核苷酸的频率。数据仅包括各克隆V片段密码子17-94的序列，不包括N区。从小鼠5250(HC2品系2550半合的，JHD纯合的)的脾和淋巴结中分离RNA。按所述(参考文献)合成单链cDNA，并用PCR扩增γ转录物。将扩增的DNA克隆到质粒载体中，然后通过双脱氧链终止法将23个随机捡出的克隆部分测序。从恒定区序列估测PCR导入核苷酸改变的频率＜0.2％。表13在HC2转基因小鼠人γ转录物的可变区含有非种系编码的核苷酸</tables>流式细胞计数我们用FACScan流式细胞计数器和LYSESII软件(BectonDickinson，SanJose，CA)分析染色的细胞。用下列试剂将脾细胞染色二碘化丙锭(MolecularProbes，Eugene，OR)、藻红蛋白结合的α人Igκ(克隆HP6062；CalTag，SouthSanTrancisco，CA)、藻红蛋白结合的α小鼠Igκ(克隆X36；BectonDickinson，SanJose，CA)、FITC结合的α小鼠Igμ(克隆R6-60.2；Pharmingen，SanDiego，CA)、FITC结合的抗小鼠Igλ(克隆R26-46；Pharmingen，SanDiego，CA)、FITC结合的α人Igμ(克隆G20-127；Pharmingen，SanDiego，CA)、和Cy-Chrome结合的α小鼠B220(克隆RA3-6B2；Pharmingen，SanDiego，CA)。人Ig转基因的表达图69说明用流式细胞计数分析来自KCo4和HC2小鼠的脾细胞，所述两种小鼠是JHD和JCKD突变纯合的。人序列HC2转基因获救了在JHD突变背景中的B细胞发育，将脾中B220+细胞的相对数量恢复到野生型动物的大约一半。这些B细胞表达细胞表面免疫球蛋白受体，所述受体使用转基因编码的重链。人Kco4转基因也是有功能的，并成功地与完整内源λ轻链座位进行竞争。在JHD/JCKD纯合突变小鼠中，近95％的脾B细胞表达完整的人细胞表面IgMκ，所述小鼠含有重和轻链人转基因(双转基因)。按如下通过ELISA确定血清Ig水平人μ用小鼠单克隆抗体α人IgM(克隆CH6，ThebingdingSite，Birmingham，UK)包被微滴定孔，用过氧化物酶结合的山羊α人IgM(fc)(cat#309-035-095，JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)显色。人γ用小鼠单克隆抗体α人IgG1(克隆HP6069，Calbiochem，LaJolla，CA)包被微滴定孔，用过氧化物酶结合的兔α人IgG(fc)(cat#109-036-098，JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)显色。人κ用小鼠单克隆抗体α人Igκ(cat#0173，AMAC，Inc.)和Igκ(cat#A7164，SigmaChem.Co.St.，Louis，MO)包被微滴定孔。小鼠γ用山羊α小鼠IgG(cat#115-006-071，JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)包被微滴定孔。小鼠λ用大鼠单克隆抗体α小鼠Igλ(cat#02171D，Pharmingen，SanDiego，CA)包被微滴定孔，然后用过氧化物酶结合的兔α小鼠IgM(fc)(cat#309-035-095，JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)显色。通过与过氧化氢和2，2’-连氮基-二-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(SigmaChem.Co.，St.louis，MO)一起保温来检测结合的过氧化物酶。通过在415nm的吸收值来测量反应产物。双转基因小鼠还在血清中表达全部人抗体。图70说明18个双转基因小鼠免疫球蛋白的测量的血清水平，所述小鼠是内源重链和κ轻链失活纯合的，衍生于数个不同的转基因建立者动物。我们发现了可检测水平的人μ、γ1和κ。我们在上文已经说明人γ1的表达是通过转基因μ和γ1转换区之间的基因组重组，从真正的类型转换产生的。此外，我们还发现转基因内类型转换总是伴随着重链可变区的体细胞突变。除人免疫球蛋白外，我们还在血清中发现了小鼠γ和λ。小鼠λ蛋白质的存在是预期的，因为内源性座位完全完整。另外我们还显示了小鼠γ的表达是转基因VDJ片段反式转换重组到内源重链座位中的结果。该反式转换现象(最初认为是野生型重链等位基因和重排的VDJ转基因的现象，(Durdiketal.，(1989)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA862346-2350；Gersteinetal.，(1990)，Cell，63537-548))发生于突变JHD背景中，原因在于下游重链恒定区和其相应的转换元件仍是完整的。人IgMκ在双转基因小鼠中的血清浓度是约0.1mg/ml，在动物或品系之间有几乎没有偏差。但是人γ1、小鼠γ和小鼠λ水平的范围从0.1-10mg/ml。个体动物之间观察到的γ水平的偏差可能是γ是可诱导恒定区这一事实的结果。表达可能取决于许多因素如动物的健康状态、与抗原的接触以及可能的MHC型。小鼠λ血清水平仅仅是与各转基因品系相关的参数。每整合有最少拷贝鼠转基因的KCo4系4436小鼠(约1-2拷贝)有最高的内源λ水平，而KCo4系4437小鼠(每整合约10个拷贝)有最低的λ水平。这与内源λ随后重排成κ转基因的模型一致，而且在所述模型中，不筛选血清λ水平，但却反映了前体B细胞库的相对大小。含多个轻链插入片段的转基因座位有机会进行一次以上的V到J重排事件，随着可能性的提高，它们之中的一个将是功能性的。因此，高拷贝品系潜在的λ细胞库较小。用人CD4和IgE免疫为了检测转基因B细胞参与免疫反应的能力，我们用人蛋白质抗原免疫双转基因小鼠，然后用ELISA测量抗原特异性免疫球蛋白的血清水平，用在完全弗氏佐剂中的50ug与聚苯乙烯珠(cat#08226，PolysciencesInc.Warrington，PA)共价相连的重组sCD4(cat.#013101，AmericanBio-TehcnologiesInc.，Cambridge，MA)经腹膜内注射免疫小鼠。各小鼠是内源μ和κ座位破坏纯合的，人重链转基因HC2系2500和人κ轻链转基因Kco4系4437是半合的。方法将稀释的血清样品加到用重组sCD4包被的微滴定孔中。用过氧化物酶结合的兔α人IgM(fc)(JacksonImmunoResearch，WestGrove，PA)或过氧化物酶结合的山羊抗人Igκ(Sigma，St.Louis，MO)检测人抗体。图71A说明用重组人可溶性CD4免疫的转基因小鼠的初级反应。所有4个免疫的动物在一周时均有抗原特异性人IgM反应。CD4特异性血清抗体含有人μ重链和人κ轻链。为了评估HC2转基因参与二级反应的能力，我们用抗原重复注射来超免疫转基因小鼠，并监测诱导抗体的重链同种型。在0天，将人重链转基因HC2和人κ轻链转基因Kco4纯合的小鼠用在完全弗氏佐剂中的25ug人IgEκ(TheBingingSite，Birmingham，UK)免疫。此后，约每隔一周，用不完全弗氏佐剂中的IgEκ注射动物。将血清样品以1∶10稀释，在人IgE、λ包被的平板上进行抗原特异性ELISA。图71B说明这些动物免疫反应的典型时间过程我们用在完全弗氏佐剂中的人IgE注射双转基因小鼠，然后每周用不完全弗氏佐剂中的IgE加强。开始的人抗体反应是IgMκ，然后出现抗原特异性人IgGκ。在这些小鼠中，诱导的血清抗体与人IgM或BSA没有交叉反应。在此过程中，人IgG产生。我们还监测了重链转基因在体外进行类型转换的能力存在LPS和重组小鼠IL-4的条件下，将从相同重链构建体半合动物(HC2，系2500)纯化的脾B细胞从人IgM转换成人IgG1。但是，存在LPS和重组小鼠IL-4，或仅LPS的条件下，未发生体外转换。我们发现在双转基因/双失效(0011)小鼠的脾、淋巴结、腹膜和骨髓中有表达人IgM的细胞。尽管腹腔含有正常数量的B细胞，但在骨髓和脾中绝对数量的转基因B细胞为正常细胞的约10-50％。这种减少可能产生于转基因依赖性B细胞发育的延迟。双转基因/双失效(0011)小鼠还在血清中表达全部人抗体，在这些小鼠中有显著水平的人μ、γ1和κ。表达的人γ1产生于转基因μ和γ1转换区之间通过基因组重组而进行的真正类型转换。此外，转基因内的类型转换总是伴有转基因所编码的重链可变区的体细胞突变。除人免疫球蛋白外，我们在这些小鼠中还发现了小鼠μ和λ。小鼠μ的表达可能是反式转换重组的结果，其中转基因VDJ被重组到内源小鼠重链座位。反式转换(最初在野生型重链等位基因和重排的VDJ转基因中观察到的)发生于我们的JH-/-背景，因为小鼠下游重链恒定区和其相应的转换元件仍是完整的。为了说明转基因B细胞参与免疫反应的能力，我们用人蛋白质抗原免疫0011小鼠，然后监测抗原特异性免疫球蛋白的血清水平。最初的人抗体反应是IgM，然后表达抗原特异性人IgG(图71B和图73)。出现人IgG抗体的延迟现象与类型转换和对抗原的二级反应之间的关系一致。在用人CD4免疫的转基因小鼠中，在血清浓度为2×10-2-1.6×10-4小范围内可检测到人IgG对CD4抗原的反应性。鉴定抗人CD4杂交瘤在0天，用在完全弗氏佐剂中的20ug重组人CD4免疫人重链转基因HC2和人κ轻链转基因KCo4纯合的转基因小鼠。此后，以约每周的间隔用在不完全弗氏佐剂中的CD4注射动物。图73表示在转基因小鼠血清中，对人CD4的人抗体反应。将血清样品以1∶50稀释，然后在人CD4包被的平板上进行抗原特异性ELISA。各线代表单个样品的测定值。实心圈代表IgM，空心方块代表IgG。我们还从应答人CD4免疫的一只小鼠中分离了杂交瘤细胞系。克隆的5个杂交瘤分泌人IgGκ(人γ1/人κ)抗体，所述抗体结合重组人CD4但与一组其它糖蛋白抗原没有交叉反应(用ELISA测量的)。确定免疫用人CD4抗原与单克隆抗体的结合和解离速率，所述抗体是由两个IgGκ杂交瘤，4E4.2和2C5.1分泌的。抗体4E4.2和2C5.1的实验产生的结合常数(Ka)分别为约9×107M-1和8×107M-1。这些Ka值落在其他人(Chenetal.，(1993)Int.Immuno.6647)已用于临床试验的鼠IgG抗人CD4抗体的范围内。在0、13、20、28、33和47天，用人CD4免疫小鼠品系#7497(0012；HC1-26+；JHD++；JKD++；KC2-1610++)，产生的抗人CD4抗体含有人κ和人μ或γ。28天末，在血清中发现了人μ和人κ。在47天末，抗人CD4的血清反应包括了人μ和γ，以及人κ。在50天，将脾细胞与P3X63-Ag8.653小鼠骨髓瘤细胞融合并培养。700个孔中的44个(6.3％)含有人γ和/或κ抗人CD4单克隆抗体。证实这些孔中有3个含有人γ抗CD4单克隆抗体，但没有人κ链(可能是表达了小鼠λ)。初级孔中的9个含有完整的人IgMκ抗CD4单克隆抗体，筛选后进一步表征。将表达完全的人IgMκ抗CD4单克隆抗体的一个所述杂交瘤命名为2C11-8。通过有限的稀释克隆初级杂交瘤，然后评估分泌与CD4反应的人μ和人κ单克隆抗体。9个杂交瘤中有5个在CD4ELISA中仍是阳性。通过其与其他抗原(包括卵清蛋白、牛血清白蛋白、人血清白蛋白、匙孔血蓝蛋白和癌胚抗原)没有反应性来说明人CD4的这些IgMκ单克隆抗体特异性。为了确定这些单克隆抗体是否识别细胞表面上的CD4(即天然CD4)，检测来自这5个克隆的上清液与CF4+T细胞系，SupY1的反应性。5个人IgMκ单克隆抗体中，有4个与这些CD4+细胞反应。为了进一步确定这些IgMκ单克隆抗体特异性，用这些抗原将新鲜分离的人外周血淋巴细胞(PBL)染色。衍生于5个初级杂种中的4个克隆仅与CD4+淋巴细胞结合，而不与CD8+淋巴细胞结合(图72)。图72说明IgMκ抗CD4单克隆抗体与人PBL的反应性。将人PBL与来自各克隆的上清液或同种型匹配的阴性对照单克隆抗体，然后是与PE结合的小鼠抗人CD4单克隆抗体(顶行)或与FITC结合的小鼠抗人CD8抗体(底行)一起保温。用与FITC或PE结合的小鼠抗人μ分别检测结合的人IgMκ。给出了克隆之一2C11-8(右侧翼)和对照IgMκ(左侧翼)的代表性结果。如所预期的，阴性对照IgMκ不与T细胞反应，而山羊抗人μ与约10％的PBL反应，这可能是人B细胞。在选择用于发育的单克隆杂交瘤细胞系时，良好的生长和高水平的IgMκ抗CD4单克隆抗体生产是重要的因素。来自杂交瘤2C11-8的数据表明，可产生高达5pg/细胞/d(图74)。用第二个克隆可得到相似的结果。正如通常所观察到的，细胞进入静止生长期后，生产显著增加。图74表示在小规模培养中细胞生长和人IgMκ抗-CD4单克隆抗体的分泌。用2×105个细胞/ml的2ml总体积接种重复培养物。此后连续4天，每隔24小时收集培养物。通过计数活细胞确定细胞生长，通过总的人μ的ELISA确定IgMκ的生产量(顶行)每细胞每天的产量计算为IgMκ的量除以细胞数(底行)。图75表示人IgMκ抗CD4单克隆抗体的表位图谱。用竞争结合的流式细胞计数试验定位由IgMκ抗CD4单克隆抗体，2C11-8识别的表位。为了这些研究，使用小鼠抗CD4单克隆抗体，Leu3a和RPA-T4，所述抗体与CD4上特有非重叠表位结合。用PE结合的山羊抗人IgM检测CD4+细胞的PE荧光，所述CD4+细胞与依次降低浓度的RPA-T4或Leu3a预保温。Leu3a有人IgMκ抗CD4单克隆抗体2C11-8的浓度依赖性竞争结合，而RPA-T4没有(图75)。因此，由2C11-8识别的表位相似于或相同于由单克隆抗体Leu3a识别的表位，但不同于由RPA-T4识别的表位。总之，我们生产了数种分泌人IgMκ单克隆抗体的杂交瘤克隆，所述单克隆抗体与天然人CD4特异性反应并可用于分辨人PBL的CD4+和CD4-亚种群。这些抗体中至少一种结合或接近由单克隆抗体Leu3a识别的表位。已经表明针对该表位的单克隆抗体可抑制混合的白细胞反应(Englemanetal.，J.Exp.Med.(1981)，153193)。已表明单克隆抗体Leu3a的嵌合体对蕈样霉菌病有一些临床效果(Knoxetal.，(1991)Blood，7720)。我们从3个不同的杂交瘤细胞系(2C11.8，2C5.1和4E4.2)中分离了cDNA，并确定了各个细胞系中所表达的免疫球蛋白基因的部分核苷酸序列。为了进行序列分析，从约5×106个杂交瘤细胞中分离总RNA。用oligodT通过引发反转录来合成双链cDNA。将部分该双链cDNA用于由具有下列特异性的oligo库引发的两个PCR反应(i)HC1或HC2转基因所含的重链可变框架区和恒定人γ序列特异性的一个下游寡核苷酸，或(ii)KC2或KCo4转基因中所含的轻链可变框架区和恒定人κ序列特异性的一个下游寡核苷酸。用适宜的限制酶消化来自这些PCR反应的产物，凝胶纯化，然后分别克隆到pNN03载体中。分离DNA并对单链DNA进行人工双脱氧和/或自动荧光测序反应。下列表11中列出了3个杂交瘤2C11.8、2C5.1和4E4.2的特征。表11杂交瘤中所用的人可变区亚克隆特异性同种型VhDhJhVκJκ2C11.8nCD4IgMκ251nd.*nd.nd.nd.2C5.1rCD4IgGκ251HQ52JHS65.15JK44E4.2rCD4IgGκ251HQ52JHS65.15JK4n.d.，未检测对来自两个IgGκ杂交瘤2C5.1和4E4.2所表达的重和轻链序列进行核苷酸序列分析表明它们是衍生于同一祖先B细胞的姊妹克隆。这两个克隆的重和轻链V(D)J连接是相同的，尽管推测的体细胞突变所确定的精确核苷酸序列有区别。重链VDJ连接序列是VH251NDHQ52JH5TATTACTGTGCGAG(ggctcc)AACTGGGGACTGGTTCGACYYCARAPTGDWFD轻链VJ连接是Vk65.15NJk4TATAATAGTTACCCTCC(t)ACTTTCGGCYNSYPPTFG鉴定了下列非种系编码的密码子(推测的体细胞突变)2CS.1重链AGC-＞AGGS28R(置换)轻链CCG-＞ACGP119T(置换)4E4.2重链AGC-＞AGGS28R(置换)CTG-＞CTAL80L(沉默)轻链GAG-＞GACE41D(置换)AGG-＞AAGR61K(置换)CCG-＞ACGP119T(置换)我们得出结论这两个γ杂交瘤衍生于经过了有限体细胞突变的B细胞。该数据表明HC2转基因动物使用VH5-51(akaVH251)片段。我们以前已表明VH4-34，VH1-69和VH3-30.3由这些小鼠表达。这些结果结合起来说明HC2转基因小鼠表达所有4种转基因编码的人VH基因。我们得出结论表达人免疫球蛋白的B细胞进行了发育并应答在小鼠免疫系统中的抗原。抗原反应性导致了免疫球蛋白重链同种型转换和可变区体细胞突变。我们还表明可用常规杂交瘤技术从这些小鼠中得到单克隆人序列抗体。因此，这些转基因小鼠可作为抗人靶抗原之人抗体的来源。实施例37本实施例描述了转基因小鼠的产生，所述转基因小鼠是失活内源重链和κ链座位纯合的并含有能够同种型转换成多个下游人CH基因的转基因。本实施例还说明了通过共微注射含重叠同源序列连接点(见图76)的多个DNA片段，组装大转基因(如160kb)的克隆方法，这样在体内(如在微注射的ES细胞或其克隆子代中)待组装的一组片段的远末端通过多个同源区的同源重组而从两个以上的重叠片段构建大转基因。本实施例还表明，连同其它事情，例如用IL-4和LPS体外可诱导来自转基因动物的分离的淋巴细胞进行同种型转换。构建一组5个不同的质粒克隆以便可分离基本上不含其它载体序列的质粒插入片段；并以便使插入片段一起形成一个叠盖组的、约150kb长的重叠序列。该组包括人V、D、J、μ、γ3和γ1编码序列，以及小鼠重链3’增强子序列。5个克隆以5’-3’的顺序依次是pH3V4D、pCOR1xa、p11-14、pP1-570和pHP-3a(图76)。用一些不同的克隆载体产生该组克隆。设计一些载体以具体地用于构建大转基因的目的。这些载体(pGP1a、pGP1b、pGP1c、pGP1d、pGP1f、pGP2a和pGP2b)是以PBR322为基础的质粒，这些质粒在每个细胞中的拷贝数低于pUC载体(Yanisch-Perronetal.，(1985)Gene33103-119)。所述载体还包括在多接头和质粒B-内酰胺酶基因3’端之间的trpA转录终止信号。多接头侧翼为稀有切割酶NotI的限制位点；因此可以在胚胎注射前，从载体序列中分离出插入片段。NotI位点内，多接头在两末端之一还包括单一的XhoI和SalI位点。在Taylor等(1992)NucleicAcidsRes.236287中描述了pGP1载体。为了产生pGP2载体，首先用AlwNI消化pGP1f，然后与合成的寡核苷酸o-236和o-237(o-2365’-ggcgcgccttggcctaagaggcca-3’；o-2375’-cctcttaggccaaggcgcgcctgg-3’)相连。将所得的质粒命名为pGP2a。然后用KpnI和EcoRI消化质粒pGP2a，然后与寡核苷酸o-288和o-289相连(o-2885’-aattcagtatcgatgtggtac-3’；o-2895’-cacatcgatactg-3’)以得到pGP2b(图7A和图77B)。在图78中描述了用pGP质粒进行转基因构建的一般方法(途径A和B)。以相同的5’到3’的方向，将所有的成分DNA片段首先逐个克隆在pGP载体中。通过寡核苷酸诱变或如果可能通过部分小鼠、聚合酶补平以及平整末端连接来破坏插入片段的NotI、XhoI和SalI位点。这样只在各插入片段5’和3’末端有多接头衍生的XhoI和SalI位点。然后通过从一个克隆中分离XhoI/SalI片段，然后将分离的片段插入另一克隆的5’XhoI或3’SalI位点而逐步组合各插入片段(图78，途径A)。通过与一个或多个插入片段过滤杂交来筛选转化体以得到组装的克隆。由于XhoI/SalI连接不能由两种酶中的任一种裂解，因此所得产物保持单个5’XhoI和3’SalI位点，然后可在构建步骤中使用。另一种方法是用载体pGP2和pGP2b完成(图78，途径B)。这些质粒在氨苄青霉素抗性序列和质粒复制原点之间包含一SfiI位点。通过用SfiI和XhoI或SalI切割，可将插入片段与药物抗性基因或复制原点一起分离。在各合成步骤中，将一个SfiI/XhoI片段与另一SfiI/XhoI片段相连。用该方法有3个优点(i)在存在氨苄青霉素的条件下，来自这两个片段的序列是质粒复制所需的，因此降低了背景转化体；(ii)可以仅以5’到3’的方向进行连接；和(iii)SfiI末端不是自我相容的，而且不与XhoI或SalI相容，因此降低了非生产性连接的水平。这种方法的缺点是必须除去插入片段的SfiI位点以及NotI、XhoI或SalI位点。这些媒介拷贝载体比常用的pUC衍生克隆载体有改进。为了比较这些载体保持大DNA插入片段的能力，将含人JH/Cμ区的43kbXhoI片段连接到pSP72(Promega，Madison，WI)，pUC19(BRL，GrandIsland，NY)和pGP1f的SalI位点。将转化体菌落转移到硝酸纤维素上，通过与放射性探针的杂交来筛选含插入片段的克隆。使阳性克隆在3ml培养基中生长过夜，然后分离DNA所得DNA的EcoRI消化片段表明pSP72和pUC19衍生的所有克隆均缺失了插入片段(图79)；但是18个pGP1f衍生的克隆中有12个包含了完整的插入片段。在这12个克隆中两个方向都有。下面描述构建和分离用于产生HCo7转基因的5个克隆(pH3V4D、pCOR1xa、p11-14pP1-570和pHP-3a)。pH3V41D使用用于VH1和VH3型的合成寡核苷酸探针，从噬菌体1基因组DNA文库中分离种系构型的重链可变基因片段。VH1型探针是o-495′-gttaaagaggattttattcacccctgtgtcctctccacaggtgtc-3′VH3型探针是o-1845′-gtttgcaggtgtccagtgt(c，g)aggtgcagctg(g，t)tggagtc(t，c)(g，c)g-3′分离阳性杂交克隆，作部分限制图谱、亚克隆然后部分测序。从核苷酸序列中，确定用o-49探针分离的一个VH1克隆编码VH基因片段，49.8，含有与公开的hv1263基因序列(Chenetal.，(1989)ArthritisRheum.3272)中所含相同的氨基酸序列。用o-184探针分离的3个VH3基因184.3、184.14和184.17，含有与VH基因公开序列DP-50、DP-54和DP-45(Tomlinsonetal.(1992)J.Mol.Biol.227776)所含相同的氨基酸序列。将这4个VH基因用于构建pH3V4D质粒。发现184.3基因包含在一3kbBamHI片段内。将该片段亚克隆到质粒载体pGP1f中以便多接头的XhoI位点在该基因的5’，SalI在3’。将所得质粒称为p184.3.36f。发现184.14基因包含在4.8kbHindIII片段内。将该片段以通过XhoI/SalI消化可进一步将该基因分离为3.5kb片段的方向亚克隆到质粒载体pUC19中，所述基因组XhoI位点在在该基因上游0.7kb，多接头衍生的SalI位点在该基因的3’。将所得质粒命名为p184.14.1。发现184.17基因包含在5.7kbHindIII片段内。将该片段以多接头衍生的XhoI和SalI位点分别在该基因5’和3’的方向亚克隆到质粒载体pSP72(Promega，Madison，WI)中。该质粒的插入片段含有在该基因3’的XhoI位点，通过用XhoI部分消化、Klenow补平然后再连接可除去该位点。将该片段亚克隆质粒载体pNN03，以便多接头衍生的XhoI和ClaI位点分别在所得的质粒称为p184.12SK。发现49.8基因包含于6.3kb×baI片段内。该基因的5’和3’以产生质粒pVH49.8(Tayloretal.，(1994)InternationalImmunol6579)。然后将pVH49.8的XhoI/ClaI插入片段亚克隆到pGP1f中以产生质粒pVH49.8f，该质粒在49.8基因的5’和3’末端分别包含单一的XhoI和SalI位点。将p184.14.1的3.5kbXhoI/SalI片段克隆到p184.3.36f的XhoI位点以产生质粒pRMVH1，该质粒以相同的方向包含184.14和184.3基因。用XhoI消化该质粒，插入p184.17SK的5.7kbXhoI/SalI片段以产生质粒pRMVH2，该质粒从5’到3’的方向含3个VH基因，184.17、184.14和184.3，均以相同的方向。然后用XhoI切割质粒pRMVH2，插入pVH49.8f的6.3kbXhoI/SalI插入片段以产生质粒pH3VH4，该质粒从5’到3’的方向含4个VH基因，49.8、184.17、184.14和184.3，均以相同的方向。将人D区克隆pDH1(上文所述；例如在实施例12中)的10.6kbXhoI/EcoRV插入片段克隆到XhoI/EcoRV消化的pGPe质粒载体以产生新质粒pDH1e。然后用EcoRV消化该质粒，然后与含SalI位点(5’-ccggtcgacccg-3’)的合成接头片段相连。所得质粒pDH1es包含在插入片段内的大部分人D1簇，可用XhoI和SalI消化所述插入片段，以便XhoI位点在5’末端，SalI位点在3’末端。分离该插入片段，然后克隆到pH3VH4的SalI位点以产生质粒pH3VH4D，该质粒含有4个种系构型的人VH基因片段和8个种系构型的人D片段，所有均以5’-3’的相同方向。通过用NotI消化分离出基本上不含载体序列的该克隆的插入片段。pCOR1xa将含有32kbXhoI插入片段的质粒pCOR1(上文所述)用XhoI部分消化、Klenow处理，然后与合成的SalI接头相连以产生新质粒pCOR1xa，所述插入片段含有9个人D片段、6个人J片段、Jμ内含子重链增强子、μ转换区和Cμ编码外显子，质粒pCOR1xa在5’末端含有单一的XhoI位点，在3’末端含单一的SalI位点。pCOR1和pCOR1xa均在3’末端含有0.6kb大鼠重链3’增强子片段，如果用NotI代替XhoI或XhoI/SalI消化该质粒，则所述0.6kb大鼠重链3’增强子片段被包含在插入片段内。用寡核苷酸引物对，通过PCR筛选噬菌体P1文库(GenomeSystemsInc.，St.Louis，Missouri)5′-tcacaagcccagcaacaccaag-3′5′-aaaagccagaagaccctctccctg-3′设计该引物对以用人γ基因模板产生216bpPCR产物。发现鉴定的一个P1克隆在80kb的插入片段内含有人γ3和γ1基因。通过NotI和SalI消化可分离出基本上不含载体序列的该克隆的插入片段(在图80中描述了)。p11-14人γ3/γ1克隆P1-570的限制性图谱表明14kbBamHI片段靠近插入片段的5’末端。将该14kb片段亚克隆到质粒载体pGP1f中，以便多接头衍生的SalI位点与插入片段的5’末端相邻。将所得的质粒命名为pB14。另外，用合成的寡核苷酸衔接子，将衍生于质粒克隆pJ1NA(Choietal.(1993)NatureGenetics4117)的11kbNdeI/SpeI基因组DNA片段(覆盖了人μ基因的3’末端和人δ基因的5’末端)亚克隆到pBluescript(Stratagene，LaJolla，CA)的SalI位点。然后分离所得的SalI插入片段，然后克隆到pB14的SalI位点以便pJ1NA的μ片段的5’到3’方向与P1-570的γ片段的方向相同。将所得克隆命名为p11-14。通过NotI消化分离出基本上不含载体序列的该克隆的插入片段。pHP-3a从balb/c小鼠基因组DNA噬菌体λ文库克隆小鼠重链3’增强子(Dariavachetal.(1991)Eur.J.Immuno.211499；Liebersonetal.(1991)NucleicAcidsRes.19933)。为了得到探针，用总balb/c小鼠胸腺DNA作为模板用于PCR扩增，用下列两种寡核苷酸cck765′-caataggggtcatggaccc-3′cck775′-tcattctgtgcagagttggc-3′用TACloningTM试剂盒(Invitrogen，SanDiego，CA)克隆所得的220bp扩增产物，然后用插入片段筛选小鼠噬菌体文库。将来自所得噬菌体克隆之一的阳性杂交5.8kbHindIII片段亚克隆到pGP1f中。该亚克隆pHC3’ENfa的插入片段以多接头XhoI位点与插入片段5’末端相邻、SalI位点与3’末端相邻的方向插入。对部分该HindIII片段进行核苷酸序列分析，证明该片段含有3’重链增强子。pHC3’ENfa的插入片段在增强子序列核心的EcoRI位点上游约1.9kb处含有一个XhoI位点。通过部分消化，Klenow补平和再连接除去该XhoI位点以产生克隆pHC3’ENfx，该质粒在插入片段5’和3’分别含有单一的XhoI和SalI位点。按如下亚克隆人γ3/γ1克隆P1-570的3’末端用NotI消化P1-570DNA、Klenow处理、然后用XhoI消化；分离13kb末端片段然后与用BamHI消化、Klenow处理的质粒载体pGP2b连接，然后用XhoI消化。所得质粒pPX-3丢失了多接头NotI位点，该位点与插入片段5’末端的多接头XhoI位点相连；但是，XhoI位点保持完整，通过用NotI和XhoI、或SalI和XhoI消化可分离插入片段。分离含3’增强子的pHC3’ENfx的XhoI/SalI插入片段，然后连接到pPX-3的3’SalI位点以产生质粒pHP-3a。将pHP-3a插入片段内所含的增强子以与P1-570克隆3’相反的方向连接。因此，pHP-3a含有一内部SalI位点，通过用XhoI和NotI消化分离所述插入片段。由于这是增强子元件，5’到3’的方向通常对功能不重要。HCo7为了制备用于前核微注射的HCo7DNA混合物，用限制酶消化上述5个质粒的DNA，然后在琼脂糖凝胶上分离。用NotI切割克隆pH3V4D；用NotI切割克隆pCOR1xa；用NotI切割克隆p11-14；用NotI和SalI切割克隆pP1-570；用用NotI和XhoI切割克隆pHP-3a。电洗脱DNA插入片段，然后再在不含EtBr的平衡CsCl梯度上纯化。将插入片段透析到注射缓冲液中，并按如下混合50μl的pH3V4D插入片段@20.4ng/μl；50μl的pCOR1xa插入片段@20.48ng/μl；50μl的p11-14插入片段@15.6ng/μl；300μl的pP1-570插入片段@8.8ng/μl；60μl的pHP-3a插入片段@10.8ng/μl和1.49ml注射缓冲液。HCo7转基因动物按Hogan等所述(Manipulatingthemouseembryo，ColdSpingHarborLaboratories，ColeSpringHarborNY)将Hco7DNA混合物微注射到半天龄的胚胎前核中，然后将胚胎转移到假孕雌性小鼠的输卵管中。从由微注射胚胎发育的202个动物中分离尾尖DNA。用含人μ和DH序列的探针对该DNA进行Southern印迹分析，表明22个建立者动物掺入了至少部分HCo7转基因。图81说明了在6个G0动物血清中，人μ和γ1表达的分析，所述G0动物是从用Hco7DNA微注射的胚胎发育的。按Lonberg等(1994)Nature368856所述用ELISA测量人免疫球蛋白蛋白质的血清水平。Southern印迹分析表明，6个小鼠中有4个掺入了转基因，这些小鼠中有3个在其血清中表达人μ和γ1蛋白质。用Southern印迹分析确定不表达人免疫球蛋白的那个转基因小鼠仅含低拷贝数的转基因，这可能是未掺入完整的转基因或该小鼠是基因镶嵌的。将两个建立者Hco7小鼠#11952和#11959与人κ小座位(Kco4，品系4436)转基因小鼠交配以产生两个内源座位破坏纯合和两个导入人小座位Kco4和HCo7半合的小鼠，所述人κ小座位(Kco4)转基因小鼠是内源重链和κ轻链座位破坏纯合的(Lonbergetal.，出处同上)。分析5个所谓双转基因/双缺失小鼠表达人IgM、人IgG1和人IgG3的情况。作为对照，分析中包括3个HC2/KCo4双转基因/双缺失小鼠。在图82中列出了该试验。在该图中按Lonberg等(出处同上)收集ELISA数据，除人IgG3的检测外，包被抗体是抗人IgG3特异性的单克隆抗体(cat.#08041，Pharningen，LaJolla，CA)；IgG3试验的另一详细内容与公开的IgG1的相同。HC2/KCo4小鼠仅表达人IgM和人IgG1，而HCo7/KCo4小鼠除表达这两种同种型外，还表达人IgG3。通过PCR扩增从转基因小鼠脾分离的RNA合成的cDNA来检测人γ3和γ1在HCo7小鼠中的表达。图83描述了用来自3个不同转基因小鼠的脾cDNA合成的PCR扩增产物品系2550是HC2转基因品系，而品系11959和11952是HCo7转基因品系。按Taylor等(1992)NucleicAcidRes.206287所述从脾RAN合成单链cDNA。然后用下列寡核苷酸PCR扩增cDNAo-3825′-gtccagaattcggt(c，g，t)cagctggtg(c，g)agtctgg-3′o-3835′-ggtttctcgaggaagaggaagactgacggtcc-3′该引物对指导PCR产物的合成，所述PCR产物跨人γ转录物的铰链区。由于人γ1和γ3铰链区结构上的差异，PCR扩增区别了这两种转录物。人γ1模板将指导752bpPCR产物的合成，而人γ3将指导893bp产物的合成。尽管在HC2品系2550和HCo7品系11959的脾中，只有人γ1模板是可检测的，而在HCo7品系11952脾中，γ1和γ3转录物均是可检测的。由于该检测具有不定量的性质，而且由于个体动物之间γ3表达的差异(如图82ELISA所示)，在图83HCo7品系11959的脾中不能观察到γ3并不能说明γ3在该品系中不表达。通过用LPS和IL4体外刺激，还可诱导从HCo7/KCo4小鼠分离的脾细胞表达IgG1和IgG3。图84中列出了该试验。检测来自7周龄雄性HCo7/KCo4双转基因/双缺失小鼠(#12496；品系11959/4436)脾细胞的免疫球蛋白分泌情况，所述分泌情况是应答单独的胸腺独立的B细胞促分裂素、LPS、以及与各种细胞因子的组合。通过细胞毒消除T细胞来富集B细胞的脾细胞。将B-富集的细胞以2×106个细胞/孔的密度，用2ml10％FCS的RPMI-1640铺在24孔平板中。以10μg/ml将LPS加到所有孔中。以50单位/ml加入IL-2，以15ng/ml加入IL-4，以15ng/ml加入IL-6，以100单位/ml加入γIFN。将培养物在37℃、5％CO2中培养10天，然后用ELISA分析上清液中人IgG1和IgG3的表达。除捕获抗人IgM(来自TheBindingSite(Birmingham，UK)的单克隆抗体)外，用于ELISA的所有试剂均来自JacksonImmunologicals(WestGrove，PA)的多克隆抗血清。实施例38本实施例说明通过共注射人κ轻链小座位和含多个人Vκ片段的YAC克隆，成功地将功能性人轻链V片段导入小鼠基因组中。本实施例表明YAC上所含的Vκ片段基因有助于在所得小鼠中表达人κ链库。本实施例描述了转基因编码的人免疫球蛋白库扩展的方法，具体地描述了如何通过共导入未连接的多核苷酸来扩展人κ链可变区库，所述多核苷酸含有人免疫球蛋白可变区片段。通过共导入含酵母人工染色体克隆DNA和κ轻链小座位克隆DNA而导入功能性人轻链V片段I.分析含克隆的人Vκ基因片段的酵母菌株从含450kb酵母人工染色体(YAC)的酵母菌株中分离总基因组DNA，所述YAC含有部分人Vκ座位(ICRFYAC文库命名4×17E1)。为了确定在该YAC克隆中所含某些Vκ基因片段的一致性，用基因组DNA作为底物用于一系列Vκ家族特异性PCR扩增反应。在4组扩增中，一个共同的3’引物与4种不同的5’引物配对。5’引物是o-270(5’-gacatccagctgacccagtctcc-3’)，o-271(5’-gatattcagctgactcagtctcc-3’)，o-272(5’-gaaattcagctgacgcagtctcc-3’)和o-273(5’-gaaacgcagctgacgcagtctcc-3’)。Mark等(Eur.J.Immunol.1991.21，985)将这些引物用作Vκ家族特异性引物。3’引物o-274(5’-gcaacgttctgtcccagacccactgccactgaacc-)是以FR3的共有序列为基础的。4组引物各指导预期0.2kb片段的扩增，该片段来自含有酵母基因组DNA的YAC克隆4×17E1。然后凝胶纯化4组不同的扩增产物，然后克隆到质粒载体pSP72(Promega)的PvuII/HindIII位点。对11个所得克隆进行核苷酸序列分析，鉴定了7个不同的V基因。下面表14中列出了这些结果。表14鉴定在YAC4×17E1上的人Vκ片段PCR引物克隆编号鉴定的基因Vκ家族</tables>*定位在远端Vκ簇内的基因片段(Coxetal.Eur.J.Immunol.1994.24，827；Pargentetal.，Eur.J.Immunol.1991.21，1829；SchableandZachauBio.Chem.Hoppe-Seyler1993.374，1001)将从YAC克隆扩增的所有序列清楚地指定到定位于远端簇的Vκ基因内，或它们与远端基因序列相容。由于没有一个序列可以被清楚地指定到近端V基因上，因此似乎YAC4×17E1含有来自远端Vκ区的序列。此外，所鉴定的一个序列，克隆#7(Vk02)定位于接近远端簇末端的J的附近，而另一序列，克隆#1和4(VkL22)定位于接近远端簇末端的J的附近，300kb上游。因此，如果450kbYAC克隆4×17E1代表未缺失的相应人基因组片段拷贝，则它至少含有32个不同的Vκ片段。但是，其中一些是无功能的假基因。2.产生含YAC衍生的Vκ基因片段的转基因小鼠为了得到用于微注射到胚胎前核中的纯化的YACDNA，在琼脂糖凝胶上将总基因组DNA进行大小分级分离。溶解前，将含YAC4×17E1的酵母细胞包埋入琼脂糖，然后通过标准脉冲场凝胶电泳(每个制造商说明CHEFDR-II电泳池，BIO-RADLaboratories，RichmondCA)从酵母染色体DNA中分离YACDNA。用溴化乙锭将6个脉冲场凝胶染色，从其余的凝胶上切下含YAC克隆的凝胶物质。然后将含YAC的凝胶片包埋入在三角形凝胶盘中的新(低熔点)琼脂糖凝胶模中。用含2mol/l醋酸钠和标准凝胶缓冲液的窄凝胶，在顶点扩展所得的三角形凝胶(图85)。然后将凝胶放在浸入标准凝胶缓冲液的电泳槽中。在缓冲液表面产生“Y”形凝胶以便电流仅能通过窄高盐凝胶片。将Plexiglas块放在高盐凝胶片上，以防止醋酸钠扩散到凝胶缓冲液中。然后将YACDNA电泳出原凝胶片段，并进入窄高盐块。在从低盐凝胶向高盐凝胶过渡的时候，有一个电阻压降，可以有效地防止YACDNA迁移过凝胶。这样可以在三角形凝胶的顶点浓缩YACDNA。电泳并染色后，将浓缩的YACDNA从其余的DNA中切开，用GELase(EPOCENTRETechnologies)消化琼脂糖。然后将溴化乙锭加到含YACDNA的液体中以得到1.68g/ml的密度。将该溶液以37000rpm离心36小时，以便将YACDNA与任何污染物分开。分离0.5ml所得密度梯度的馏份，将峰DNA馏份用5mMTris(pH7.4)/5mMNaCl/0.1MEDTA透析。透析后，发现所得的0.65mlYACDNA溶液的浓度是2ug/ml。将所述YACDNA与来自质粒pKC1B和pKC4(Lonberg等，1994，自然，368，856)之插入片段的纯化DNA混合，比例为20∶1∶1(微克YAC4×17E1KC1BKV4)。将所得2ug/ml溶液注射到半天的小鼠胚胎前核中，将95个存活的微注射胚胎转移到假孕雌性小鼠的输卵管中。生出39个从微注射胚胎发育的小鼠。用这些小鼠中的2个#9269和#9272建立转基因品系。将所述品系命名为KCo5-9269和KCo5-9272。对来自KCo5-9269和KCo5-9272品系小鼠的基因组DNA进行Southern印迹分析以确定YAC4×17E1衍生的Vκ片段是否已插入其基因组中。将来自远端Vκ簇中间的Vκ基因片段，VkA10(登记号#x12683；Straubingeretal.，1988，Biol.Chem.Hoppe-Seyler369,601-607)用作Southern印迹分析的探针。为了得到克隆的探针，先用PCR扩增VkA10基因。用下列两个寡核苷酸作为引物，扩增来自YAC4×17E1的1kb片段o-337(5’-gggttaactcattgcctccaaagcac-3’)和o-338(5’-gggttaactcattgcctccaaagcac-3’)。将扩增的产物进行凝胶纯化，用HincII消化，然后克隆到pUC18中以得到质粒p17E1A10。然后用该质粒的插入片段检测KCo5-9269和KCo5-9272DNA的Southern印迹。印迹表明仅在KCo5-9272小鼠DNA中探针与预期的限制片段杂交。这表明VkA10基因插入到了KCo5-9272小鼠的基因组中，但未插入KCo5-9269小鼠的基因组中。然后将品系KCo5-9272小鼠与HC2-2550/JHD/JKD小鼠交配以得到内源重和κ轻链座位破坏纯合的，而人重和κ轻链转基因半合或纯合的小鼠。将内源重和κ轻链座位破坏纯合的，而HC2和KCo5转基因半合或纯合的小鼠命名为双转基因/双缺失小鼠。完成cDNA克隆试验以确定在品系KCo5-9272小鼠中是否表达了YAC衍生的Vκ基因。将双转基因/双缺失小鼠#12648(HC2-2550/KCo5-9272/JHD/JKD)杀死，然后从脾中分离总RNA。从RNA合成单链cDNA，然后在4种不同的PCR反应中作为模板，所述PCR使用o-270、o-271、o-272和o-273为5’引物，用Ck特异性寡核苷酸o-186(5’-tagaaggaattcagcaggcacacaacagaggcagttcca-3’)为3’引物。将扩增产物克隆到pCRIITA克隆载体(Invitrogen)中。确定19个插入片段的核苷酸序列。下列表15中列出了序列分析结果。表15鉴定在小鼠品系KCo5-9272中表达的人Vκ基因PCR引物克隆编号鉴定的基因Vκ家族</tables>*由转基因质粒序列编码的Vκ基因**唯一由YAC衍生的转基因序列编码的Vκ基因这些结果表明至少3个YAC衍生的Vκ基因片段，A10、L18和L24有助于在品系KCo5-9272小鼠中表达的人库。为了确定所述增加的库对骨髓和脾中不同B220+细胞种群大小的影响，对品系KCo5-9272小鼠进行流式细胞计数分析。在图86和87中列出了所述分析的一部分内容。在该试验中，比较两个双转基因/双缺失小鼠，一个含KCo5转基因，另一个含KCo4转基因。这两个转基因有相同的连接和恒定区序列，以及相同的内含子和3’增强子序列。它们还共有4个不同的克隆V基因片段；但是KCo5转基因包含在KCo4转基因中不含的、衍生于YAC4×17E1的其它V片段。从小鼠#13534(HC2-2550/KCo5-9272/JHD/JKD)和小鼠#13449(HC2-2550/KCo4-4436/JHD/JKD)中分离细胞。用抗小鼠B220(Caltag，SouthSanFrancisco，CA)抗小鼠CD43(Pharmingen，LaJolla，CA)和抗人IgM(JacksonImmuologic，WestGrove，PA)将骨髓细胞染色。用抗小鼠B220和抗人IgM将脾细胞染色。图86表示比较了KCo5和KCo4小鼠骨髓中的B细胞、B细胞祖先种群。KCo5小鼠(6％)骨髓中的B细胞馏分(B220+，IgM+)是KCo4小鼠(2％)的3倍。KCo5小鼠中的前B细胞种群(B220+，CD43-，IgM-)也更高(9％，与KCo4的5％相比)。此外，在这些小鼠中，原B区室(B220+，CD43+)也增加(KCo5，11％；KCo4，5％)。尽管KCo5小鼠中的这3个区室中的每个都比KCo4小鼠的大，但水平仍是野生型小鼠的近一半。骨髓B细胞数量的增加可能是增加的库大小的直接结果。这些小鼠较大的初级库提供了与内源抗原具有某些最小阈亲合力的膜Ig。然后受体连接使得可以增殖表达反应性Ig的那些B细胞。但是，由于前B和原B细胞不表达轻链基因，因此，有关KCo5小鼠这两个区室大小增加的解释不是很显而易见的。在KCo5小鼠中B细胞祖先区较大，因为B细胞数量的增加产生了更有利于这些种群扩展的骨髓环境。这种影响是通过分泌的因素或B细胞与祖先细胞之间的细胞-细胞接触而直接介导的，或通过抑制祖先细胞存活或增殖的因素或细胞的滴定而间接介导的。图87说明比较了KCo5和KCo4小鼠中的脾B细胞(B220+，IgM+)种群。这两种小鼠之间的主要差异是B220暗B细胞种群的相对大小(在KCo5小鼠中为6％，在KCo4小鼠中为13％)。B220暗细胞比B220亮B细胞大，而且其大部分馏分表达1轻链。这些是所谓B1种群的特征，所述B1种群通常在野生型小鼠的腹膜B细胞种群中是主要的。KCo4小鼠的脾含有不规则的高馏分B220暗细胞，而KCo5小鼠中这些细胞的分布更正常。但是这两个品种均含有为正常脾B细胞数量1/2到1/3的所述细胞。实施例39本实施例说明将实施例38的KCo5转基因小鼠成功地用于分离杂交瘤克隆，所述杂交瘤克隆分泌高亲合力、抗原特异性的人IgG单克隆抗体。免疫。每隔一周，用4-10×106个照射的T4D3细胞，表达人CD4的鼠T细胞系(Dr.JaneParnes，Stanford，StanfordUniversity)将双缺失/双转基因小鼠(KCo5-9272/HC2-2550/JHD/JKD，#12657)腹膜内免疫8周，两周后腹膜内注射20mg在不完全弗氏佐剂(Sigma)中的可溶性重组人CD4(sCD4；Intracell)。在用20mgsCD4静脉内输注前3天，给小鼠加强免疫一次。杂交瘤融合。将来自免疫小鼠脾淋巴细胞的单细胞悬浮液与1/6量的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCCCRL1580)和50％PEG(Sigma)融合。将约2×105个细胞铺在平底微滴定板上，然后在选择性培养基中培养2周，所述培养基含有20％胎克隆血清(HyClone)、18％“653”条件培养基、5％Origen(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠、5mMHEPES、0.055mM2-巯基乙醇、50单位/mlmM青霉素、50mg/mlmM链霉素、50mg/mlmM庆大霉素和1XHAT(Sigma；HAT在融合24小时后加入)。2周后，将细胞在用HT取代HAT的培养基中培养。在观察到广泛的杂交瘤生长或耗尽培养基后，用ELISA和流式细胞计数筛选孔。ELISA筛选杂交瘤。为了检测抗CD4单克隆抗体，4℃，用50ml2.5mg/mlPBS中的sCD4将微滴定板(Falcon)包被过夜，在RT用100mlPBS中的5％鸡血清阻断1小时，然后然后与1∶4稀释的杂交瘤上清液、1∶1000稀释的辣根过氧化物酶(HRPO)结合的山羊抗人IgG(JAckson)的F(ab’)2片段或1∶250稀释的HRPO结合的山羊抗人Igk抗体(Singma)加1％正常小鼠血清，最后与在0.1M柠檬酸磷酸盐缓冲液中的0.22mg/mlABTS，pH4和0.0024％H2O2在RT顺序保温1小时。除第一次外，在所有保温之间用洗涤缓冲液(0.5％吐温20的PBS溶液)将平板洗涤3-6次。用稀释剂(洗涤缓冲液加5％鸡血清)稀释上清液和HRPO结合物。用双波长测量吸收值(490nm参考波长的OD减去415nm的OD)。为了检测含小鼠λ的单克隆抗体，除下列改变外，使用上述ELISA方法。将微滴定板的孔用100ml1)1.25mg/ml山羊抗小鼠λ(Pierce)，2)1.25mg/ml山羊抗人Fcγ(Jackson)，或3)2.5mg/mlsCD4(ABT)包被。对于检测步骤，使用与生物素结合的100ml1∶5000山羊抗小鼠1(SBA)，然后用100ml与HRPO(Jackson)结合的1∶1000链霉抗生物素蛋白。在所示浓度下使用鼠和人单克隆抗体标准。为了寻找与无关抗原的交叉反应，用CEA(CrystalChem)、KLH(CalBiochem)、HSA(Sigma)、BSA(Sigma)或OVA(Sigma；除CEA是2.5mg/ml外，均是2mg/ml)包被孔。滴定适宜的抗体，然后用作阳性对照(人IgM抗CEA(GenPharm)、兔抗-KLH(Sigma)、羊抗-HSA(TheBindingSite)、羊抗-BSA(TheBindingSite)和羊抗-OVA(TheBindingSite))。用山羊抗人IgM、驴抗兔IgG或驴抗羊IgG(均以1∶1000稀释并得自Jackson)的HRPO结合物检测任何结合的抗体。另外，然后进行标准ELISA方法。用流式细胞计数筛洗杂交瘤。为了进一步筛选与天然细胞表面CD4有反应的单克隆抗体，在冰上将5×105个SupT1细胞(ATCCCRL1942)与1∶2稀释的来自融合平板的消耗上清液保温30分钟用冷染色缓冲液(0.1％BSA，0.02％NaN3的PBS溶液)洗涤两次，与1.5mg/mlFITC结合的山羊抗人Fcg的F(ab’)2片段(FITC-GaHuIgGiJackson)保温15分钟，洗涤一次然后立即用FACScan(Becton-Dickinson)分析。CD4反应性杂交瘤。用上述ELISA和流式细胞计数技术，鉴定12个杂交瘤克隆，所述克隆分泌与天然人CD4特异性反应的人IgG。进一步亚克隆12个克隆中的10个。鉴定这些亚克隆中的8个为分泌人IgG1κ的杂交瘤。另两个表达小鼠λ轻链。8个全人克隆的亲本孔是1E11、2E4、4D1、6C1、6G5、7G2、10C5和1G1。图88中说明3个全人IgGκ亚克隆(4D1.4、6G5.1和10C5.6)结合的流式细胞计数。图88说明IgGκ抗-nCD4单克隆抗体与CD4+SupT1细胞的结合。洗涤来自对数生长期的培养物的细胞，然后不用单克隆抗体、4E4.2(作为阴性对照)、嵌合Leu3a(作为阳性对照)或10个人IgG抗-nCD4单克隆抗体之一染色。用FITC结合的山羊抗人Fcγ检测任何结合的单克隆抗体。所有10个单克隆抗体均与SupT1细胞结合，尽管在本文只给出了3个数据。用克隆的杂交瘤分析人抗体分泌。为了比较单克隆抗体的生长和分泌，将亚克隆放在24孔平板上的HT培养基中复制培养，开始的密度为2×105个细胞/ml。每天收集各克隆的复制培养物，连续收集7天，然后测定细胞数、细胞存活力(用苔盼蓝排除法)和上清液中的单克隆抗体量(用定量ELISA确定总的人γ)。表16列出了7天末杂交瘤亚克隆的抗体分泌。表16人IgGk抗nCD4单克隆抗体的分泌水平亚克隆pg/细胞pg/细胞/d1E11.153.90.561G1.9111.54D1.41.40.916C1.103.30.486G5.17.81.17G2.24.40.6310C5.68.01.1*pg/细胞＝(最大量单克隆抗体)/(最大存活细胞数)pg/细胞/d＝(pg/细胞)/7天人单克隆抗体的纯化。使各个杂交瘤克隆生长在不含HT和Origen和培养基中，逐渐减少FCS，使在最后1升培养物中含约2-3％。在杂交瘤的存活力降到约30％以下时，收集上清液。为了纯化IgGk单克隆抗体，将消耗的上清液离心以除去细胞，然后经超滤浓缩至约50-100ml，用PBS，pH7.4稀释，然后上样到5mlProteinA(Pharmacia)柱。用3-5倍柱体积的PBS洗涤后，用0.1HCl、150mMNaCl，pH2.8洗脱人IgGk单克隆抗体，然后立即用1MTris碱中和。将OD280＞0.2的含柱馏分的物质合并，然后在PBS中透析。然后测定OD280，用1.4吸收常数计算人IgG的蛋白质浓度。在流出物中未检测到单克隆抗体，回收率为93-100％。获得3-6mg各纯化的单克隆抗体，纯度＞90％。分析来自克隆杂交瘤的单克隆抗体。为了研究单克隆抗体的结合特异性，在Ficoll上分离人PBMC并按如下染色。将在染色缓冲液中的人PBMC(106)在冰上保温30分钟，在不同的反应中，分别与等体积来自3个亚克隆杂交瘤(4D1.4、6G5.1和10C5.6)之一的上清液或与同种型匹配的阴性对照单克隆抗体保温，洗涤两次，然后在冰上与1mg/mlFITC-GaHuIgG以及10ml与藻红蛋白(PE)结合的小鼠抗人CD4单克隆抗体(Leu3a；Becton-Dickinson)、10ml与PE结合的小鼠抗人CD8单克隆抗体(Leu2a；Becton-Dickinson)或5ml与PE结合的小鼠抗人CD19单克隆抗体(SJ25-C1；Caltag)保温20分钟。然后用FACScan流式细胞计数器(Becton-DickinsonSanJose，CA)分析关住的淋巴细胞。发现所有3种抗体均与人PBMC中的CD4馏分特异性结合。为了接近由这3种单克隆抗体识别表位的位置，在冰上将5×105个SupT1细胞与在染色缓冲液中的2.5mg/mlRPA-T4或2.5mg/mlLeu3a预保温20分钟，然后与10种人IgG单克隆抗体之一保温30分钟(1∶2稀释的上清液)，最后与0.5mg/mlFITC结合的山羊抗人Fcγ保温以检测任何结合的人IgG。在最后的步骤前用染色缓冲液将细胞洗涤两次，在最后步骤后洗涤1次。在图89中列出了该阻断试验的结果。这3种抗体没有一个与RPA-T4有共同的表位，而6G5.1和10C5.6所识别的表位与Leu3a所识别的相同。速率和平衡常数测定按制造商的说明，通过氨基将人sCD4(2500-4200RU)固定于传感芯片表面。使抗体稀释物流过抗原结合的传感芯片直到平衡，然后仅使缓冲液流过。对于反应的各时期，结合和解离，画出结合的抗体馏份随时间的曲线。计算结合曲线的导数并画出对各浓度下的反应图。为了计算结合速率常数(K结合)，将这些线的斜率对单克隆抗体浓度作出图。该图上曲线的斜率对应于K结合。从对时间间隔的反应(在缓冲液流动相过程中)中下降的对数计算出解离速率常数(K解离)。以K解离除以K结合得到Ka。在表17中列出了产生于KCo5/HC2双转基因/双缺失小鼠的5种不同纯化单克隆抗体、以及一种市售纯化抗体的测量的速率和亲合力常数数据。表17与人CD4结合的单克隆抗体的速率和亲合力常数混合的淋巴细胞反应(MLR)，为了将生于KCo5转基因小鼠的人单克隆抗体10C5.6的体外效力与小鼠抗体Leu3a进行比较，进行了MLR试验。在Ficoll上分离来自2个不相关供体的人PBMC，然后按制造商的说明用CD4柱(HumanCD4Cellect，BiotexLaboratories，Inc.Canada)纯化来自各供体的CD4+PBL。用培养基(RPMI1640，含10％热失活的人AB血清(来自NABI)、Hepes、丙酮酸钠、谷胺酰胺、青霉素/链霉素和β巯基乙醇(均以制造商推荐的浓度使用))中的100mg/mlMitomycinC(Aldrich)在37℃处理来自这两个供体的PBMC30分钟，然后用培养基洗涤3次而得到失活的刺激者细胞。将用培养基稀释的不同浓度的单克隆抗体或仅有培养基过滤灭菌，然后在96孔圆底平板中一式三份，每孔加100ml。然后将来自一个供体的50ml含105CD4+PBL的培养基和来自另一供体的含105mitomyeinC处理的PBMC的50ml培养基加到各孔中。用对照平板作为单克隆抗体任何毒性或促分裂素作用的对照，所述对照平板含有单独的CD4+PBL反应者加单克隆抗体。还包括仅有刺激者的对照和培养基背景对照。37℃、5％CO2湿保温箱中7天后，从各孔中取出100ml上清液，然后加入20ml比色剂(CellTiter96AQ试剂盒，PromegaCorporation，Madison，WI)。显色4-6小时，然后在490nm读平板。图90中描述了该试验的结果，表明在该试验中，在阻断人PBMCCD4细胞的功能中，人IgG1k抗体10C5.6至少与Leu3a一样有效。实施例40人IgGκ抗-CD4单克隆抗体的结合特征本实施例描述了人IgGκ单克隆抗体的结合特征，所述单克隆抗体产生于得自用人CD4免疫的HC2/KCo5/JHD/JCKD转基因小鼠的杂交瘤。表明单克隆抗体与重组和天然人CD4有高亲合力和亲和性。来自10个分泌与人CD4反应的人IgGκ单克隆抗体(mAB)的杂交瘤细胞系(1E11、1G2、6G5、10C5、1G1、6C1、2E4、7G2、1F8和4D1)的细胞衍生于JHD/JCKD/HC2/KCo5转基因小鼠。使细胞系在培养基中生长，从上清液中分离抗体蛋白(Fishwildetal.1996，NatureBiotechnology14,845-851，该文献引入本文作为参考)。将用ProteinA亲和色谱纯化的抗体用于测量结合常数。表18和19中列出了结果。通过使用与传感芯片结合的山羊抗人IgG(Fc-特异性的)以及使饱和浓度的单克隆抗体流过，然后流过各种浓度的抗原(rCD4)用BIAcore(PharmaciaBiosensor)测定在表18中所列的速率和平衡常数。这些常数衍生于3个使用纯化单克隆抗体的实验。表18亲合力和速率常数速率常数(平均值±SD)人单克隆抗体kassoc(M-1s-1)kdissoc(s-1)Ka(M-1)1E11.151.7(±0.15)×1053.5(±0.09)×10-35.0×1076C1.101.8(±0.44)×1053.3(±0.04)×10-35.4×1071G1.91.2(±0.18)×1059.4(±0.22)×10-41.3×1086G5.19.3(±1.1)×1046.9(±0.36)×10-41.4×10810C5.69.4(±0.98)×1047.1(±0.36)×10-41.3×1082E4.21.8(±0.10)×1052.5(±0.05)×10-37.1×1074D1.42.5(±0.55)×1053.4(±0.15)×10-37.3×1077G2.22.4(±0.31)×1053.3(±0.07)×10-37.3×1071F8.31.8(±0.24)×1054.3(±0.14)×10-34.3×1071G2.102.2(±0.26)×1052.3(±0.03)×10-39.8×107chiLeu3a1.5(±0.35)×1052.3(±0.12)×10-46.6×108通过使用与传感芯片结合的抗原并流过mAb，用BIAcore测定在表19中所列的速率和平衡常数。这些常数产生于3个独立使用纯化单克隆抗体的实验。表19亲合力和速率常数速率常数(平均值±SD)人单克隆抗体kassoc(M-1s-1)kdissoc(s-1)Ka(M-1)1E11.152.8(±0.22)×1054.5(±0.43)×10-56.2×1096C1.102.0(±0.25)×1054.0(±0.63)×10-55.1×1091G1.99.1(±0.95)×1042.2(±0.71)×10-54.2×1096G5.11.1(±0.41)×1051.0(±0.34)×10-51.1×101010C5.67.4(±1.5)×1041.6(±0.57)×10-54.5×1092E4.21.4(±0.15)×1052.2(±0.25)×10-56.3×1094D1.49.8(±0.69)×1044.2(±1.3)×10-52.3×1097G2.21.7(±0.20)×1055.0(±0.42)×10-53.4×1091F8.21.7(±0.13)×1059.7(±1.2)×10-51.7×1091G2.101.7(±0.04)×1056.3(±0.49)×10-52.7×109chiLeu3a4.0(±0.45)×1051.2(±0.25)×10-53.4×1010Leu3a1.5(±0.30)×1054.2(±0.49)×10-63.7×1010表20提供了科学文献中抗CD4单克隆抗体的平衡常数。表20抗CD4单克隆抗体的亲合力和速率常数速率常数(平均值±SD)人单克隆抗体kassoc(M-1s-1)kdissoc(s-1)Ka(M-1)CE9.1(4)NR*NR3.1×1010cMT412(1)NRNR5.0×109chiLeu3a(2)NRNR1.0×1011BL4(3)NRNR5.5×107BB14(3)NRNR3.3×108cA2(5)NRNR1.8×109CDP571(6)NRNR7.1×109*NR＝未报告(1)J.Cell.Biol.15EA179.(2)J.Immunol.1452839.(3)Clin.Immunol.Immunopath.64248.(4)Biotechnology.101455.(5)Mol.Immunol.301443.(6)EuropeanPatentAppl.#0626389A1.用重组CD4(rCD4)完成上述亲合力和亲和性测定。确定人单克隆抗体与天然CD4(nCD4)的亲合力。用另一结合试验，该试验不需要待修饰的抗体。具体地说，将抗体的系列稀释物与SupT1细胞在冰上保温6小时，洗涤然后用FITC-山羊抗-人Fcγ检测任何结合的抗体。从产生1半最大荧光(使用四参数合适fourparameterfit))的抗体浓度确定Ka。结果表明所有10个人单克隆抗体均与nCD4有很好的结合，Ka值＞109M-1(表21)。包括嵌合Leu3a的大部分抗体与nCD4的结合不如与rCD4。这可能是由抗原密度的差异以两种抗原之间的差异。表21通过流式细胞计数确定的亲合力常数ka值(M-1)Ka比率人单克隆抗体rCD4nCD4*(rcD4/nCD4)1E11.156.2×1093.3×1091.96C1.105.1×1093.1×1091.51G1.94.2×1092.3×1091.96G5.11.1×10101.9×1095.910C5.64.5×1091.8×1092.52E4.26.3×1091.1×1095.84D1.42.3×1092.0×1091.27G2.23.4×1093.3×1091.01F8.21.7×1093.2×1090.51G2.102.7×1091.9×1091.4chiLeu3a3.4×10105.6×1096.1*将人单克隆抗体与SupT1细胞的系列稀释物保温6小时，洗涤两次，然后与FITC-连接的山羊抗-人Fcγ抗血清保温，洗涤并固定。用四参数合适确定产生一半最大荧光的抗体浓度来计算Ka。实施例41鉴定编码人IgGκ抗-CD4抗体的核苷酸序列本实施例描述试验的各杂交瘤仅产生功能性重或轻链RNA转录物，与适当功能化等位排斥一致。另外，重和轻链CDR片段的序列分析表明发生了免疫球蛋白转基因的体细胞突变。将来自5个杂交瘤细胞系(1E11、1G2、6G5、10C5和4D1)的细胞用于分离编码各抗体的RNA(Fishwildetal.1996，NatureBiotechnology14，845-851)，所述杂交瘤分泌与人CD4反应的人IgGκ单克隆抗体并来自JHD/JCKD/HC2/KCo5转基因小鼠。用RNA作为底物合成cDNA，然后用所述cDNA通过PCR扩增人Igγ和κ转录物序列，PCR使用人VH、Vκ、Cγ和Cκ特异性引物(Tayloretal.1992，NucleicAcidsRes.20，6287-6295；Larrick，J.W.，etal.，(1989)，Bio/Technology.7.934-938；Mark，J.D.，etal.，(1991).Eur.J.Immunol.21.985-991；Tayloretal.，1994，Int.Immunol.6,579-591)。将扩增的Ig重和κ轻链序列克隆到细菌质粒中，然后测定核苷酸序列。分析跨重链VDJ和轻链VJ连接的序列表明了5个克隆各自的阅读框内重和轻链转录物，在某些情况下，还有表现非功能性等位基因的框架外无效转录物。与适当的功能化等位排斥一致，各克隆没有一个有多于一个的单一重或轻链转录物。将10个功能性转录物的部分核苷酸序列指定为下列序列鉴定号1E11γ[SeqIDNo.1]；1E11κ[SeqIDNo.2]；1G2γ[SeqIDNo.3]；1G2κ[SeqIDNo.4]；6G5γ[SeqIDNo.5]；6G5κ[SeqIDNo.6]；10C5γ[SeqIDNo.7]；10C5κ[SeqIDNo.8]；4D1γ[SeqIDNo.9]；4D1κ[SeqIDNo.10]；并列在表22中。以5’到3’的方向列出了所有序列。表22有功能转录物的部分核苷酸序列1E11gamma[Seq.I.D.No.1]TGCACAAGAACATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTTCATCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTTCTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGGAGGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCCATCATCGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCGAGAGTCGAGTCACCCTATCAGTAGACACGTCCAAAAACCAGTTCTCCCTGAGGCTGAGTTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGACATTACTATGGTTCGGGGAGTACCTCACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC1E11kappa[Seq.I.D.No.2]GACAGACTTCACTCTCACCATCAGCAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCAGTGTATTACTGTCAGCAGTATGGTAGCTCACCCCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCGGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC1G2gamma[Seq.I.D.No.3]TCCACCATCATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGTTACTGGATCGCCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCGATCCTGCTGACTCTGATACCAGATACAACCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGTACCGCCTATTTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGACCAGCGAACTGGAACTGGTACTTCGTTCTCTGGGGCCGTGGCACCCTGGTCACT1G2kappa[Seq.I.D.No.4]GACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGTCAACAGTTTATTAGTTACCCTCAGCTCACTTTCGGCGGAGGGACCAGGGTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC6G5gamma[Seq.I.D.No.5]TGCACAAGAACATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGTAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTCGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAACTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGTAATTAATTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACC6G5kappa[Seq.I.D.No.6]GACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAATAGTTTCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCC10C5gamma[Seq.I.D.No.7]ATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGGTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCCCCAGGTAAGGGGCTGGAGTGGATTGGGGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCCCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTCGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCCCTGAAGCTGAGCTCTGTGACCGCCGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGTAATTAATTGGTTCGACCCCTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAG10C5kappa[Seq.I.D.No.8]ATGGACATGATGGTCCCCGCTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCATAAACCAGGGAAAGCCCCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAGGCTAATAGTTTCCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAAC4D1gamma[Seq.I.D.No.9]ATGGGGTCAACCGCCATCCTCGCCCTCCTCCTGGCTGTTCTCCAAGGAGTCTGTGCCGAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGAGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTCTCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCGGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCCAGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCACATACAGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGCAGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGAGACCAACTGGGCCTCTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAAGCTT4D1kappa[Seq.I.D.No.10]ATGGACATGGAGTTCCCCGTTCAGCTCCTGGGGCTCCTGCTGCTCTGTTTCCCAGGTGCCAGATGTGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCCTCACTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGGTATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCAGAAACCAGAGAAAGCCCCTAAGTCCCTGATCTATTCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGGGTCCCATCAAGGTTCAGCGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTATTACTGCCAACAGTATGATAGTTACCCGTACACTTTTGGCCAGGGGACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAAGCTT分析这些DNA序列表明5个杂交瘤克隆代表4个初级B细胞的子代。表23列出衍生于10个CF3区的氨基酸序列和种系基因片段的用途，所述种系基因片段插入到编码这些转录物的各基因中。种系用途是以从NationalCenterforBiotechnologyInformation，NationalLibraryofMedicine，NationalInstitutesofHealth，Bethesda，Md得到的公开序列为基础的。还参见Cooketal.，1994，NatureGenet.7,162-168；Tomlinsonetal.，1992，J.Mol.Biol.227,776-798；Matsudaetal.，1993，NatureGenet.3，88-94；SchableandZachau，1993，Biol.Chem.Hoppe-Seyler374，1001-1022；Coxetal.，1994，Eur.J.Immunol.24,827-836；Ravetchetal.，1981，Cell27,583-591；Ichiharaetal.，1988，EMBOJ.7，4141-4150；Yamadaetal.，1991，J.Exp.Med.173,395-407；Sanz，1991，J.Immunol.147，1720-1729。表23种系V(D)J片段在杂交瘤转录物中的使用</tables>n.d.从核苷酸序列不能确定。实施例42构建用于在转染的细胞系中表达人IgGκ抗CD4抗体的小基因本实施例描述了制备全人工基因的方法，所述基因编码免疫球蛋白多肽(即免疫球蛋白重或轻链)。构建质粒以便可用PCR扩增的V重和V轻链cDNA序列重建完整的重和轻链小基因。κ轻链质粒pCK7-96包含κ恒定区和聚腺苷酸化位点[Seq.IDNo.11]，以便可将5’引物(含有起始甲硫氨酸上游的HindIII位点)扩增的κ序列用HindIII和BbsI消化，然后克隆到用HindIII和BbsI消化的pCK7-96中以重建完整的轻链编码序列和聚腺苷酸化位点。可将该盒分离为HindIII/NotI片段，然后与转录启动子序列连接以产生用于转染到细胞中的功能小基因。γ重链质粒pCG7-96包含人γ恒定区和聚腺苷酸化位点[Seq.IDNo.12]，以便可将5’引物(含有起始甲硫氨酸上游的HindIII位点)扩增的γ序列用HindIII和AgeI消化，然后克隆到用HindIII和AgeI消化的pCG7-96中以重建完整的γ重链编码序列和聚腺苷酸化位点。可将该盒分离为HindIII/SalI片段，然后与转录启动子序列连接以产生用于转染到细胞中的功能小基因。下列实施例描述了来自杂交瘤的核苷酸序列如何用于重建功能Ig重和轻链小基因。用来自杂交瘤6G5和10C5之重和轻链转录物的核苷酸序列设计合成寡核苷酸的重叠组以产生与天然序列有相同氨基酸编码能力的合成V序列。合成的重和κ轻链序列(命名为HC6G5[SeqIDNo.61]和LC6G5[SeqIDNo.62])在3个方面不同于天然序列打断数列重复的核苷酸碱基以有利于寡核苷酸合成和PCR扩增；按照Kozak原则(Kozak，1991，J.Biol.Chem.266，19867-19870)插入最佳翻译起始位点；以及将HindIII位点加工到翻译起始位点的上游。A.合成κ轻链轻链PCR反应1合并下列寡核苷酸o-548[Seq.IDNO.13]，o-549[Seq.IDNO.14]，o-550[Seq.IDNO.15]，o-551[Seq.IDNO.16]，o-552[Seq.IDNO.17]，o-563[Seq.IDNO.18]，o-564[Seq.IDNO.19]，o-565[Seq.IDNO.20]，o-566[Seq.IDNO.21]，o-567[Seq.IDNO.22]，然后用下列2个引物扩增o-527[Seq.IDNO.23]和o-562[Seq.IDNO.24]。轻链PCR反应2合并下列寡核苷酸o-553[Seq.IDNO.25]，o-554[Seq.IDNO.26]，o-555[Seq.IDNO.27]，o-556[Seq.IDNO.28]，o-557[Seq.IDNO.29]，o-558[Seq.IDNO.30]，o-559[Seq.IDNO.31]，o-560[Seq.IDNO.32]，o-561[Seq.IDNO.33]，o-562[Seq.IDNO.34]，然后用下列2个引物扩增o-552[Seq.IDNO.17]和o-493[Seq.IDNO.34]。轻链PCR反应3然后将轻链PCR反应1和2的产物组合起来，用下列2个引物扩增o-493[Seq.IDNO.34]和o-527[Seq.IDNO.23]。用HindIII和BbsI消化轻链PCR反应的产物，然后克隆到HindIII/BbsI消化的pCK7-96[Seq.IDNO.11]中以产生pLC6G5[Seq.IDNO.35]。B.合成γ重链重链PCR反应1合并下列寡核苷酸o-528[Seq.IDNO.36]，o-529[Seq.IDNO.37]，o-530[Seq.IDNO.38]，o-531[Seq.IDNO.39]，o-532[Seq.IDNO.40]，o-543[Seq.IDNO.41]，o-544[Seq.IDNO.42]，o-545[Seq.IDNO.43]，o-546[Seq.IDNO.44]，o-547[Seq.IDNO.45]，然后用下列2个引物扩增o-496[Seq.IDNO.46]和o-542[Seq.IDNO.47]。重链PCR反应2将下列寡核苷酸o-533[Seq.IDNO.48]，o-534[Seq.IDNO.49]，o-535[Seq.IDNO.50]，o-536[Seq.IDNO.51]，o-537[Seq.IDNO.52]，o-538[Seq.IDNO.56]，o-539[Seq.IDNO.53]，o-540[Seq.IDNO.54]，o-541[Seq.IDNO.55]，o-542[Seq.IDNO.47]，以及分离的pCG7-96[Seq.IDNO.12]的439bpBbsI片段，然后用下列2个引物扩增o-490[Seq.IDNO.57]和o-520[Seq.IDNO.58]。重链PCR反应3然后将重链反应1和2的产物组合起来，用下列2个引物扩增o-520[Seq.IDNO.58]和o-521[Seq.IDNO.59]。用HindIII和AgeI消化重链反应3的产物，然后克隆到HindIII/AgeI消化的pCG7-96[Seq.IDNO.12]中以产生pHC6G5[Seq.IDNO.60]。表24在小基因构建中所用的引物、载体和产物p260-273序列pCK7-96[Seq.I.D.No.11]TCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGCGCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTAGCGGCCGCGGTCCAACCACCAATCTCAAAGCTTGGTACCCGGGAGCCTGTTATCCCAGCACAGTCCTGGAAGAGGCACAGGGGAAATAAAAGCGGACGGAGGCTTTCCTTGACTCAGCCGCTGCCTGGTCTTCTTCAGACCTGTTCTGAATTCTAAACTCTGAGGGGGTCGGATGACGTGGCCATTCTTTGCCTAAAGCATTGAGTTTACTGCAAGGTCAGAAAAGCATGCAAAGCCCTCAGAATGGCTGCAAAGAGCTCCAACAAAACAATTTAGAACTTTATTAAGGAATAGGGGGAAGCTAGGAAGAAACTCAAAACATCAAGATTTTAAATACGCTTCTTGGTCTCCTTGCTATAATTATCTGGGATAAGCATGCTGTTTTCTGTCTGTCCCTAACATGCCCTGTGATTATCCGCAAACAACACACCCAAGGGCAGAACTTTGTTACTTAAACACCATCCTGTTTGCTTCTTTCCTCAGGAACTGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGAGAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCCCAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGCAGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCCTGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAACAGGGGAGAGTGTTAGAGGGAGAAGTGCCCCCACCTGCTCCTCAGTTCCAGCCTGACCCCCTCCCATCCTTTGGCCTCTGACCCTTTTTCCACAGGGGACCTACCCCTATTGCGGTCCTCCAGCTCATCTTTCACCTCACCCCCCTCCTCCTCCTTGGCTTTAATTATGCTAATGTTGGAGGAGAATGAATAAATAAAGTGAATCTTTGCACCTGTGGTTTCTCTCTTTCCTCAATTTAATAATTATTATCTGTTGTTTACCAACTACTCAATTTCTCTTATAAGGGACTAAATATGTAGTCATCCTAAGGCGCATAACCATTTATAAAAATCATCCTTCATTCTATTTTACCCTATCATCCTCTGCAAGACAGTCCTCCCTCAAACCCACAAGCCTTCTGTCCTCACAGTCCCCTGGGCCATGGATCCTCACATCCCAATCCGCGGCCGCAATTCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCpCG7-96[Seq.I.D.No.12]GAACTCGAGCAGCTGAAGCTTTCTGGGGCAGGCCAGGCCTGACCTTGGCTTTGGGGCAGGGAGGGGGCTAAGGTGAGGCAGGTGGCGCCAGCCAGGTGCACACCCAATGCCCATGAGCCCAGACACTGGACGCTGAACCTCGCGGACAGTTAAGAACCCAGGGGCCTCTGCGCCCTGGGCCCAGCTCTGTCCCACACCGCGGTCACATGGCACCACCTCTCTTGCAGCCTCCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGCGGTCGCACGAGGATGCTTGGCACGTACCCCCTGTACATACTTCCCGGGCGCCCAGCATGGAAATAAAGCACCCAGCGCTGCCCTGGGCCCCTGCGAGACTGTGATGGTTCTTTCCACGGGTCAGGCCGAGTCTGAGGCCTGAGTGGCATGAGGGAGGCAGAGCGGGTCCCACTGTCCCCACACTGGCCCAGGCTGTGCAGGTGTGCCTGGGCCCCCTAGGGTGGGGCTCAGCCAGGGGCTGCCCTCGGCAGGGTGGGGGATTTGCCAGCGTGGCCCTCCCTCCAGCAGCACCTGCCCTGGGCTGGGCCACGGGAAGCCCTAGGAGCCCCTGGGGACAGACACACAGCCCCTGCCTCTGTAGGAGACTGTCCTGTTCTGTGAGCGCCCCTGTCCTCCCGACCTCCATGCCCACTCGGGGGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCATCGATGATATCAGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGGACATATTGTCGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATAo-548[Seq.I.D.No.13]ATGGTCCCAGCTCAGCTCCTCGGTCTCCTGCTGCTCTGGTTCCCo-549[Seq.I.D.No.14]AGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGo-550[Seq.I.D.No.15]TGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGo-551[Seq.I.D.No.16]AGTCAGGATATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCATAAACCo-552[Seq.I.D.No.17]AGGTAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCo-563[Seq.I.D.No.18]AGGAGCTTAGGTGCTTTACCTGGTTTATGCTGATACCAGGCTAAo-564[Seq.I.D.No.19]CCAGCTGCTAATATCCTGACTCGCCCGACAAGTGATGGTGACTCo-565[Seq.I.D.No.20]TGTCTCCTACAGATGCAGACACGGAAGATGGAGACTGGGTCATCo-566[Seq.I.D.No.21]TGGATGTCGCATCTGGAACCTGGGAACCAGAGCAGCAGGAGACCo-567[Seq.I.D.No.22]GAGGAGCTGAGCTGGGACCATCATGGTGGCAAGCTTAGAGTCo-527[Seq.I.D.No.23]GACTCTAAGCTTGCCACCATGATGGTCCo-562[Seq.I.D.No.24]ACCTTGATGGGACACCACTTTGCAAACTGGATGCAGCATAGATCo-553[Seq.I.D.No.25]AAAGTGGTGTCCCATCAAGGTTCAGCGGAAGTGGATCTGGGACAo-554[Seq.I.D.No.26]GATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCo-555[Seq.I.D.No.27]AACTTACTATTGTCAACAGGCTAATAGTTTCCCGTACACTTTTGo-556[Seq.I.D.No.28]GTCAGGGAACCAAGCTGGAGATCAAACGAACTGTGGCTGCACCAo-557[Seq.I.D.No.29]TCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTGAo-558[Seq.I.D.No.30]GGGAAGATGAAGACAGATGGTGCAGCCACAGTTCGTTTGAo-559[Seq.I.D.No.31]TCTCCAGCTTGGTTCCCTGACCAAAAGTGTACGGGAAACTATTAo-560[Seq.I.D.No.32]GCCTGTTGACAATAGTAAGTTGCAAAATCTTCAGGCTGCAGGCTo-561[Seq.I.D.No.33]GCTGATGGTGAGAGTGAAATCTGTCCCAGATCCACTTCCGCTGAo-493[Seq.I.D.No.34]TCAACTGCTCATCAGATGGCpLC6G5[Seq.I.D.No.35]TCTTCCGCTTCC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.55]GAGAACTGGTTCTTGGACGTGTCTACTGATATGGTGACTCGACo-538[Seq.I.D.No.56]CGATGGGCCCTTGGTTGAGGCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTTCo-490[Seq.I.D.No.57]GAAGCACCAACTACAACCCGo-520[Seq.I.D.No.58]GAGTTCCACGACACCGTCACCo-521[Seq.I.D.No.59]GACCTCAAGCTTGCCACCATGAAACACCTGTGGpHC6G5[Seq.I.D.No.60]GAACTCGAGCAGCTGAAGCTTGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCTAGATGGGTCCTGTCTCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGTTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCACCAGGTAAGGGTCTGGAGTGGATTGGTGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCTCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCTCTGAAACTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGTAATTAATTGGTTCGACCCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTGAATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGGTGAGAGGCCAGCACAGGGAGGGAGGGTGTCTGCTGGAAGCCAGGCTCAGCGCTCCTGCCTGGACGCATCCCGGCTATGCAGCCCCAGTCCAGGGCAGCAAGGCAGGCCCCGTCTGCCTCTTCACCCGGAGGCCTCTGCCCGCCCCACTCATGCTCAGGGAGAGGGTCTTCTGGCTTTTTCCCCAGGCTCTGGGCAGGCACAGGCTAGGTGCCCCTAACCCAGGCCCTGCACACAAAGGGGCAGGTGCTGGGCTCAGACCTGCCAAGAGCCATATCCGGGAGGACCCTGCCCCTGACCTAAGCCCACCCCAAAGGCCAAACTCTCCACTCCCTCAGCTCGGACACCTTCTCTCCTCCCAGATTCCAGTAACTCCCAATCTTCTCTCTGCAGAGCCCAAATCTTGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGGTAAGCCAGCCCAGGCCTCGCCCTCCAGCTCAAGGCGGGACAGGTGCCCTAGAGTAGCCTGCATCCAGGGACAGGCCCCAGCCGGGTGCTGACACGTCCACCTCCATCTCTTCCTCAGCACCTGAACTCCTGGGGGGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATCTCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGACCCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCCAAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGCGTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGCAAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAAGCCAAAGGTGGGACCCGTGGGGTGCGAGGGCCACATGGACAGAGGCCGGCTCGGCCCACCCTCTGCCCTGAGAGTGACCGCTGTACCAACCTCTGTCCCTACAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGGGATGAGCTGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTCTATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAACAACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTCTACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTCTCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGCCTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGTGCGACGGCCGGCAAGCCCCCGCTCCCCGGGCTCTCGCGGTCGCACGAGGATGCTTGGCACGTACCCCCTGTACATACTTCCCGGGCGCCCAGCATGGAAATAAAGCACCCAGCGCTGCCCTGGGCCCCTGCGAGACTGTGATGGTTCTTTCCACGGGTCAGGCCGAGTCTGAGGCCTGAGTGGCATGAGGGAGGCAGAGCGGGTCCCACTGTCCCCACACTGGCCCAGGCTGTGCAGGTGTGCCTGGGCCCCCTAGGGTGGGGCTCAGCCAGGGGCTGCCCTCGGCAGGGTGGGGGATTTGCCAGCGTGGCCCTCCCTCCAGCAGCACCTGCCCTGGGCTGGGCCACGGGAAGCCCTAGGAGCCCCTGGGGACAGACACACAGCCCCTGCCTCTGTAGGAGACTGTCCTGTTCTGTGAGCGCCCCTGTCCTCCCGACCTCCATGCCCACTCGGGGGCATGCCTGCAGGTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCATCGATGATATCAGATCTGCCGGTCTCCCTATAGTGAGTCGTATTAATTTCGATAAGCCAGGTTAACCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCAATGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGGACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGACGTCTAAGAAACCATTATTATCATGACATTAACCTATAAAAATAGGCGTATCACGAGGCCCTTTCGTCTCGCGCGTTTCGGTGATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGCAGCTCCCGGAGACGGTCACAGCTTGTCTGTAAGCGGATGCCGGGAGCAGACAAGCCCGTCAGGGCGCGTCAGCGGGTGTTGGCGGGTGTCGGGGCTGGCTTAACTATGCGGCATCAGAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACCATATGGACATATTGTCGTTAGAACGCGGCTACAATTAATACATAACCTTATGTATCATACACATACGATTTAGGTGACACTATAHC6G5[Seq.I.D.No.61]AAGCTTGCCACCATGAAACACCTGTGGTTCTTCCTCCTCCTGGTGGCAGCTCCTAGATGGGTCCTGTCTCAGGTGCAGCTACAGCAGTGGGGCGCAGGACTGTTGAAGCCTTCGGAGACCCTGTCCCTCACCTGCGCTGTCTATGGTGGTTCCTTCAGTGGTTACTACTGGAGCTGGATCCGCCAGCCACCAGGTAAGGGTCTGGAGTGGATTGGTGAAATCAATCATAGTGGAAGCACCAACTACAACCCGTCTCTCAAGAGTCGAGTCACCATATCAGTAGACACGTCCAAGAACCAGTTCTCTCTGAAACTGAGCTCTGTGACCGCTGCGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAGAGTAATTAATTGGTTCGACCCTTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCCTCAACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGCACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTLC6G5[Seq.I.D.No.62]AAGCTTGCCACCATGATGGTCCCAGCTCAGCTCCTCGGTCTCCTGCTGCTCTGGTTCCCAGGTTCCAGATGCGACATCCAGATGACCCAGTCTCCATCTTCCGTGTCTGCATCTGTAGGAGACAGAGTCACCATCACTTGTCGGGCGAGTCAGGATATTAGCAGCTGGTTAGCCTGGTATCAGCATAAACCAGGTAAAGCACCTAAGCTCCTGATCTATGCTGCATCCAGTTTGCAAAGTGGTGTCCCATCAAGGTTCAGCGGAAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAGCCTGCAGCCTGAAGATTTTGCAACTTACTATTGTCAACAG实施例43人抗CD4单克隆抗体与非人灵长类淋巴细胞的结合要求人抗CD4单克隆抗体在动物模型中能够完成临床前毒性和药物动力学研究。还要求可用于非人灵长类动物，所述动物表达含具有人CD4交叉反应性表位的CD4以便可被单克隆抗体识别。用5种不同人抗CD4单克隆抗体检测3种不同非人灵长类猩猩、恒河猴和猕猴的交叉反应性CD4表位，所述单克隆抗体来自杂交瘤1E11、1G2、6G5、10G5和4D1。从猩猩、恒河猴和猕猴的全血中分离外周血淋巴细胞。将分离的细胞用这5种杂交瘤(用FITC-抗-人IgG检测)和PE-抗-CD8或PE-抗-CD4双染色。然后用流式细胞计数分析染色的细胞以确定各个人单克隆抗体是否与这3种非人灵长类淋巴细胞表面上的内源CD4结合。发现5种抗体中有4种1E11、6G5、10G5和4D1结合猩猩CD4细胞。另外发现5种抗体中有4种6G5、1G2、10G5和4D1结合恒河猴和猕猴CD4细胞。因此，5种抗体中有3种6G5、10G5和4D1与所检测的3种非人灵长类中的各CD4细胞结合。实施例44没有已知的体外试验可以很容易地预测单克隆抗体在患者体内是非耗尽的(nondepleting)还是免疫抑制的。但是在人和非人灵长类如猩猩和猕猴中已经观察到3种不同单克隆抗体耗尽(或不耗尽)的能力间的关系(参见如M.Jonkeretal.，Clin.Exp.Immunol.93301-307(1993)；andJ.A.Powelsonetal.，Transplantation，57，788-793(1994))。因此在非人灵长类中用人单克隆抗体完成研究。在该研究中使用猩猩，因为抗-CD4单克隆抗体之一1E11仅在猩猩中识别CD-4，而在恒河猴或猕猴中均不识别。第二种单克隆抗体6G5识别猩猩、恒河猴和猕猴中的CD4。第三种单克隆抗体1G2在猩猩中不识别CD4，但在恒河猴和猕猴中识别CD4。已表明在猕猴中该单克隆抗体在体内是非耗尽的。除检测人单克隆抗体对外周血CD4+T细胞数的作用外，还评估施用单克隆抗体对体内T细胞功能的影响。完成这项任务最可接受的方法是使用已经对抗原如结核菌素或破伤风类毒素预先致敏并在皮肤上超敏感性反应增加的动物。在该研究中使用3只雄性猩猩。在-7、-3和1天，得到基线全血样品。在1天取血后，用两种人单克隆抗体之一(1E11或6G5)以2mg/ml静脉内输注一只猩猩。第三只猩猩只接受等体积/kg的缓冲液。在输注后30分钟、2小时、8小时、24小时和48小时取血。在2天，检测皮肤反应性。表25中所列的结果清楚地表明1E11引起外周血淋巴细胞的短暂耗尽，而大部分CD4+T细胞被耗尽。虽然6G5不引起淋巴细胞或CD4+T细胞耗尽，但与对照猩猩相比，两种单克隆抗体均能抑制对破伤风类毒素的超敏反应。因此两种人单克隆抗体在体内是免疫抑制的，而这种免疫抑制不需要T细胞耗尽。表25人单克隆抗体对外周血猩猩淋巴细胞的作用外周血淋巴细胞(百万个/ml)研究天数1E116G5对照-74.26.44.2-44.09.94.41，融合前4.85.75.81，30分钟后1.66.04.01，2小时后1.06.75.21，6小时后1.58.04.223.59.65.733.99.75.9为了说明和描述，已经给出了本发明优选实施方案的前述描述。它们不是打算穷举或将本发明限制到所公开的确切形式，在上述教导下，许多修饰和改变都是可能的。在权利要求范围内，可以实施的某种改变和修饰是显而易见的。本文所有文献和专利申请均以相同的程度引入本文作为参考，如同具体并分别说明各文献或专利申请引入本文作为参考。普通转让的1995年10月10日申请的美国系列申请号为08/544,404，1994年12月7日申请的美国系列申请号为08/352,322，1994年3月9日申请的美国系列申请号为08/209,741，1993年12月10日申请的美国系列申请号为08/165,699和1993年12月3日申请的美国系列申请号为08/161,739(08/161,739是1993年11月18日申请的美国系列申请号为08/155,301的部分延续申请)，WO92/03918，1991年12月17日申请的USSN07/810,279，1992年3月18日申请的USSN07/853,408，1992年6月23日申请的USSN07/904,068，1992年12月16日申请的USSN07/990,860，WO93/12227，1993年4月26日申请的美国系列申请号为08/053,131，各申请引入本文作为参考。权利要求1.含有免疫球蛋白的组合物，所述免疫球蛋白与预定人抗原结合的亲合力常数(Ka)至少为2×109M-1，其中所述免疫球蛋白由下列成分组成具下列组成的人序列轻链(1)含有基本上等同于由人VL基因片段和人JL片段编码的多肽序列的轻链可变区，和(2)含有基本上等同于由CL基因片段编码的多肽序列的轻链恒定区；和具下列组成的人序列重链(1)含有基本上等同于由人VH基因片段、或D区以及人JH片段编码的多肽序列的重链可变区，和(2)含有基本上等同于由人CH基因片段编码的恒定区。2.权利要求1的组合物，其中所述人序列重链和人序列轻链分别由已整合到小鼠细胞基因组中的人重链转基因和人轻链转基因编码。3.权利要求1的组合物，其中所述组合物含有单个个体型的单克隆抗体。4.权利要求1的组合物，其中所述预定人抗原是人蛋白，所述人蛋白是作为在人至少一种体细胞细胞类型中的表面或跨膜蛋白而自然存在的。5.权利要求1的组合物，其中所述人序列轻链含有κ恒定区。6.权利要求1的组合物，其中所述人序列重链含有γ恒定区。7.权利要求1的组合物，其中所述免疫球蛋白含有具有κ恒定区的人序列轻链和具有γ恒定区的人序列重链。8.权利要求4的组合物，其中所述预定人抗原是人CD4蛋白或其抗原性片段。9.权利要求7的组合物，其中所述预定人抗原是人CD4蛋白或其抗原性片段。10.与预定人抗原结合的亲合力常数(Ka)至少为1×1010M-1的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白由下列成分组成由下列组成的人序列轻链(1)含有多肽序列的轻链可变区，所述多肽序列基本上等同于人VL基因片段和人JL片段编码的多肽序列，和(2)含有多肽序列的轻链恒定区，所述多肽序列基本上等同于人CL基因片段编码的多肽序列；和由下列组成的人序列重链(1)含有多肽序列的重链可变区，所述多肽序列基本上等同于人VH基因片段，或D区以及人JH片段编码的多肽序列；和(2)含有多肽序列的恒定区，所述多肽序列基本上等同于人CH基因片段编码的多肽序列。11.权利要求10的免疫球蛋白，其中所述预定人抗原是人蛋白，所述人蛋白是作为在人至少一种体细胞细胞类型中的表面或跨膜蛋白而天然存在的。12.权利要求11的免疫球蛋白，其中所述人蛋白质是人CD4或其抗原性片段。13.权利要求10的免疫球蛋白，其中所述人序列轻链是κ链且人序列重链是γ链。14.由得自转基因小鼠的B细胞组成的杂交瘤，所述转基因小鼠含有含人重链转基因和人轻链转基因的基因组，所述B细胞已与适宜于产生杂交瘤的无限增殖细胞融合，其中所述杂交瘤在培养上清液中产生可检测量的权利要求10的免疫球蛋白。15.权利要求14的杂交瘤，其中所述免疫球蛋白由人序列κ链和人序列γ链组成。16.权利要求14的杂交瘤，其中所述免疫球蛋白以至少1.1×1010M-1的亲合力与人CD4结合。17.权利要求15的杂交瘤，其中所述免疫球蛋白以至少1.1×1010M-1的亲合力与人CD4结合。18.转基因小鼠，含有一对纯合的功能破坏了的内源重链等位基因、一对纯合的功能破坏了的内源轻链等位基因，至少一个拷贝的异源免疫球蛋白轻链转基因和至少一拷贝的异源免疫球蛋白重链转基因，而且其中所述动物在用人抗原免疫后，产生抗体反应，其中所述抗体反应包含权利要求10的免疫球蛋白。19.权利要求18的转基因小鼠，其中所述权利要求10的免疫球蛋白含有人序列κ链和人序列γ链。20.权利要求18的转基因小鼠，其中所述免疫球蛋白与至少一种人体细胞的表面或跨膜蛋白结合，其中所述免疫球蛋白以1.5×109M-1-1.8×1010M-1之间的亲合力常数(Ka)与所述人表面或跨膜蛋白结合。21.权利要求20的转基因小鼠，其中所述人表面或跨膜蛋白是人CD4。22.权利要求14的杂交瘤，其中所述转基因小鼠是权利要求18的转基因小鼠。23.产生权利要求18转基因小鼠的方法，包括将含有种系拷贝的人重链转基因的转基因小鼠与相反性别的适宜的转基因小鼠交配，以便子代包括权利要求18的转基因小鼠，所述人重链转基因能够进行转基因内的同种型转换。24.权利要求23的方法，其中所述相反性别的适宜转基因小鼠含有种系拷贝的人轻链转基因和失效背景，所述失效背景含有种系拷贝的功能破坏了的小鼠重链等位基因和功能破坏了的轻链等位基因。25.权利要求18的转基因小鼠，其中所述小鼠B细胞发生B细胞成熟、表达人序列免疫球蛋白、进行类型转换，以及在不表达有功能小鼠序列重或轻链时，发生体细胞突变。26.生产转基因小鼠的方法，所述转基因小鼠含有扩展的人可变区基因片段库，所述方法包括将人免疫球蛋白转基因和含人V基因片段的人V基因多核苷酸共同导入到小鼠基因组中，所述人V基因片段不在所述人免疫球蛋白转基因中。27.权利要求26的方法，其中所述V基因多核苷酸是含人κ免疫球蛋白座位一部分的酵母人工染色体。28.用权利要求26的方法生产的转基因小鼠，其中所述小鼠表达含可变区序列的免疫球蛋白链，所述可变区由在V区多核苷酸上的V区基因片段编码。29.含至少5个不同Vκ基因的转基因小鼠。30.扩展人序列免疫球蛋白表达特征的方法，包括繁殖权利要求28的转基因小鼠。31.用权利要求29的转基因小鼠生产的权利要求10的免疫球蛋白。32.用于生产人序列免疫球蛋白多肽的方法，该方法包括下列步骤(A)得到转基因小鼠，其中所述转基因小鼠含有一对纯合的功能破坏了的内源重链等位基因、一对纯合的功能破坏了的内源轻链等位基因、至少一个拷贝的人免疫球蛋白轻链转基因和至少一拷贝人免疫球蛋白重链转基因；(B)用预定抗原免疫转基因小鼠，其中进行免疫反应诱导，由此所述小鼠的转基因可经V-D-J重排，由此生产出重排的转基因。(C)分离并测序编码所述重排的转基因之至少一部分可变区的核酸，并确定由重排转基因的测序部分编码的免疫球蛋白多肽的氨基酸序列；(D)制备编码第二种免疫球蛋白多肽的人工基因，其中所述第二免疫球蛋白多肽含有的氨基酸序列基本上相似于重排转基因的测序部分编码之免疫球蛋白多肽的氨基酸序列；(E)将人工基因与转录启动子序列相连；和(F)将所述人工基因导入细胞；由此产生人序列免疫球蛋白多肽。33.权利要求32的方法，其中所述第二种免疫球蛋白多肽含有的氨基酸序列与由重排转基因的测序部分编码之免疫球蛋白多肽的氨基酸序列相同。34.权利要求32的方法，其中所述步骤(C)的核酸是从分泌人序列免疫球蛋白的杂交瘤中分离的。35.权利要求32的方法，其中所述重排的转基因是人免疫球蛋白重链转基因。36.权利要求35的方法，其中所述人工基因编码γ同种型恒定区。37.权利要求35的方法，还包括将第二人工基因导入步骤(F)的细胞中，其中除重排的转基因是人免疫球蛋白轻链转基因外，所述第二人工基因是按照权利要求4的步骤A-E制备的，而且其中所述细胞生产免疫球蛋白。38.权利要求37的方法，其中在杂交瘤中表达人免疫球蛋白重链转基因和人免疫球蛋白轻链转基因，所述杂交瘤是通过将来自转基因小鼠的单个B细胞与无限增殖细胞融合而产生的。39.权利要求37的方法，其中所述细胞产生以至少108M-1的亲合力常数(Ka)与预定抗原结合的免疫球蛋白。40.由权利要求32的方法生产的免疫球蛋白。41.含有至少一个人工基因的细胞，所述人工基因编码免疫球蛋白多肽的至少一部分，其中所述细胞生产可检测量的与预定人抗原结合的免疫球蛋白，而且其中所述免疫球蛋白多肽具有与由杂交瘤分泌的免疫球蛋白多肽基本上相同的序列，所述杂交瘤是从转基因小鼠中得到的，所述小鼠含有一对纯合的功能破坏了的内源重链等位基因、一对纯合的功能破坏了的内源轻链等位基因、至少一个拷贝的人免疫球蛋白轻链转基因和至少一拷贝的人免疫球蛋白重链转基因。42.权利要求41的真核细胞。43.权利要求42的细胞，其中所述免疫球蛋白与人CD4或其抗原性片段结合。44.与人CD4特异性结合的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白含有人序列轻链可变区，所述可变区含有与下列序列编码的氨基酸序列基本上相同的序列Seq.ID.No.1、Seq.ID.No.2、Seq.ID.No.3、Seq.ID.No.4、Seq.ID.No.5、Seq.ID.No.6、Seq.ID.No.7、Seq.ID.No.8、Seq.ID.No.9、Seq.ID.No.10。45.权利要求44的免疫球蛋白，其中所述免疫球蛋白含有Seq.ID.No.61或Seq.ID.No.62的序列。46.选择杂交瘤的方法，所述杂交瘤分泌与预选抗原特异性结合的人序列免疫球蛋白，该方法包括下列步骤a)从转基因小鼠中得到B细胞，其中所述转基因小鼠含有一对纯合的功能破坏了的内源重链等位基因、一对纯合的功能破坏了的内源轻链等位基因、至少一个拷贝的人免疫球蛋白轻链转基因和至少一拷贝的含编码μ和非μ片段的人免疫球蛋白重链转基因，其中所述小鼠已用预定抗原进行了免疫；b)将B细胞与无限增殖细胞融合，产生杂交瘤；c)鉴定分泌非μ、非δ同种型免疫球蛋白的第一组杂交瘤；d)鉴定第二组杂交瘤，其中第二组是第一组的亚组，而且其中第二组中的杂交瘤分泌与预定抗原特异性结合的免疫球蛋白；e)从第二组杂交瘤中筛选分泌人序列免疫球蛋白的杂交瘤，所述免疫球蛋白与预定抗原特异性结合。47.权利要求46的方法，其中所述第一组杂交瘤分泌IgG免疫球蛋白。48.权利要求46的方法，其中步骤(e)中的人序列免疫球蛋白以至少约109M-1的亲合力常数(Ka)与所述预定抗原结合。49.与人CD4特异性结合并与至少一种非人灵长类的CD4特异性结合的人抗-CD4免疫球蛋白。50.权利要求18的免疫球蛋白，其中所述的非人灵长类是恒河猴、猕猴或猩猩。51.权利要求50的免疫球蛋白，其中人抗-CD4免疫球蛋白与来自恒河猴和猕猴的CD4都特异性结合。52.权利要求50的免疫球蛋白，其中人抗-CD4免疫球蛋白与来自恒河猴、猕猴和猩猩的CD4特异性结合。53.人序列免疫球蛋白，含有VH4-34片段、DXP’1片段、JH4片段和含序列DITMVRGPH[Seq.IDNo.63]的重链CDR3区。54.人序列免疫球蛋白，含有VH5-51片段、DHQ52片段、JH2片段和含序列PANWNWYFVL[Seq.IDNo.64]的重链CDR3区。55.人序列免疫球蛋白，含有VH4-34片段、JH5片段和含序列VINWFDP[Seq.IDNo.65]的重链CDR3区。56.人序列免疫球蛋白，含有VH5-51片段、DHQ52片段、JH4片段和含序列DQLGLFDY[Seq.IDNo.66]的重链CDR3区。57.人序列免疫球蛋白，含有VkA27/A11片段、Jk4片段和含序列QQYGSSPLT[Seq.IDNo.67]的轻链CDR3区。58.人序列免疫球蛋白，含有VkL18片段、Jk4片段和含序列QQFISYPQLT[Seq.IDNo.68]的轻链CDR3区。59.人序列免疫球蛋白，含有VkL19片段、Jk2片段和含序列QQANSFPYT[Seq.IDNo.69]的轻链CDR3区。60.人序列免疫球蛋白，含有VkL15片段、Jk2片段和含序列QQYDSYPYT[Seq.IDNo.70]的轻链CDR3区。61.分泌免疫球蛋白的杂交瘤，其中所述免疫球蛋白选自含有VH4-34片段、DXP’1片段、JH4片段和含序列DITMVRGPH[Seq.IDNo.63]的重链CDR3区的人序列免疫球蛋白，含有VH-5-51片段、DHQ52片段、JH2片段和含序列PANWNWYFVL[Seq.IDNo.64]的重链CDR3区的人序列免疫球蛋白，含有VH4-34片段、JH5片段和含序列VINWFDP[Seq.IDNo.65]的重链CDR3区的人序列免疫球蛋白，含有VH5-51片段、DHQ52片段、JH4片段和含序列DQLGLFDY[Seq.IDNo.66]的重链CDR3区的人序列免疫球蛋白，含有VkA27/A11片段、Jk4片段和含序列QQYGSSPLT[Seq.IDNo.67]的轻链CDR3区的人序列免疫球蛋白，含有VkL18片段、Jk4片段和含序列QQFISYPQLT[Seq.IDNo.68]的轻链CDR3区的人序列免疫球蛋白，含有VkL19片段、Jk2片段和含序列QQANSFPYT[Seq.IDNo.69]的轻链CDR3区的人序列免疫球蛋白和含有VkL15片段、Jk2片段和含序列QQYDSYPYT[Seq.IDNo.70]的轻链CDR3区的人序列免疫球蛋白。全文摘要本发明涉及能够生产异源抗体的转基因非人动物和用于生产具有显著亲合力的人序列抗体的方法,所述抗体与人抗原结合。文档编号C12N15/00GK1199422SQ96197554公开日1998年11月18日申请日期1996年10月10日优先权日1995年10月10日发明者尼尔斯·隆博格,罗伯特·M·凯申请人:真药物国际公司