能够结合免疫球蛋白的肽的制作方法

专利名称：能够结合免疫球蛋白的肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及能够结合免疫球蛋白的肽、该肽的融合蛋白、编码该肽和该融合蛋白 的核酸、该肽和该融合蛋白的产生方法、用于结合免疫球蛋白的组合物和用具。本发明还涉 及包含能够结合该免疫球蛋白的肽或该肽的融合蛋白的，用于治疗或预防由Clq和免疫球 蛋白之间的结合引起的疾病的药物组合物，以及其他方面。
背景技术：
Clq是一种补体蛋白，已知能在补体激活途径中起作用。例如，已知该经典途径的 激活是由Clq结合免疫球蛋白分子的Fc片断引发的。已报道，血液中Clq浓度很高的类风湿性关节炎(RA)患者将来会遭受关节破坏 (非专利文献1)。由于据信涉及以上所述的Clq激活，因此需要开发针对Clq和免疫球蛋 白分子之间的结合的抑制剂。已报道，Clq B亚单位(B链)上的精氨酸残基可能参与Clq和免疫球蛋白分子之 间的结合(非专利文献2)。但是，由于这个报道是基于通过计算机模拟得出的预测结果，实 际的免疫球蛋白结合位点并不清楚。另外，没有关于结合位点的氨基酸序列的详情。能特异性结合免疫球蛋白的蛋白质如A蛋白或G蛋白被用于免疫球蛋白的纯化。 但是，由于这些蛋白质强烈结合免疫球蛋白，它们一旦被结合，需要苛刻的条件才能分离， 例如使用强酸性缓冲剂来分离。由于这个原因，免疫球蛋白的构象容易发生解折叠，不能纯 化出高亲和力抗体。非专利文献1 =Ochi T 等人，Arthritis Rheum. 1988 年 1 月；31 (1) :37_73非专利文献2 =Gaboriaud C 等人，J Biol Chem. 2003 年 11 月 21 日；278 (47) 46974-82。Epub 2003 年 9 月 5 日发明公开内容本发明所要解决的问题本发明的一个目标是提供能够结合免疫球蛋白的肽、该肽的融合蛋白、编码该肽 和该融合蛋白的核酸、包含所述核酸的载体，以及其他方面。另外，本发明的另一个目标是 提供一种新型抗体纯化方法，所述方法能让对抗原具有高亲和力的抗体得到纯化而不使该 抗体的构象发生解折叠，以及用于该方法的组合物和用具。解决问题的手段鉴于上述情况，本发明人进行了认真的研究，结果成功鉴定出参与Clq和免疫球 蛋白之间的结合的氨基酸序列，从而完成本发明。另外，该氨基酸序列出人意料地不含有据 报道参与该结合的精氨酸残基。另外，由于包含这个氨基酸序列的肽能比A蛋白和G蛋白 更弱地结合免疫球蛋白，它解决了常规的抗体纯化所造成的问题，如抗体的 构象的解折叠， 以及对于靶向用于纯化的抗体的限制(如不能够纯化对抗原具有高亲和力的抗体)，并且 使得能够在温和条件下进行抗体纯化。也就是说，本发明涉及
(1)选自以下的能够结合免疫球蛋白的肽(a)具有SEQ ID NO :1_7氨基酸序列中任何一个序列的肽；(b)具有由SEQ ID NO :1-7氨基酸序列中任何一个序列缺失、置换或添加一个或 几个氨基酸得到的氨基酸序列的肽；和(c)具有与SEQ ID NO :1_7氨基酸序列中任何一个序列有66. 7%或更高同源性的 氨基酸序列的肽，(2)根据(1)的肽，其具有SEQ ID NO :1_7氨基酸序列中任何一个序列，(3)根据(1)或(2)的肽，其具有SEQ ID NO 1氨基酸序列，(4)选自以下的编码能够结合免疫球蛋白的肽的核酸(a)编码根据(1)的肽的核酸；(b)具有SEQ ID NO :8_16核苷酸序列中任何一个序列的核酸；(c)具有由SEQ ID NO :8_16核苷酸序列中任何一个序列缺失、置换或添加一个或 几个核苷酸得到的核苷酸序列的核酸；(d)可在严格条件下与(b)或(c)的核酸或者它们的互补链杂交的核酸；和(e)具有与SEQ ID NO :8_16核苷酸序列中任何一个序列有50%或更高同源性的 核苷酸序列的核酸，(5)根据⑷的核酸，其具有SEQ ID NO :8_16核苷酸序列中任何一个序列，(6)根据(4)或(5)的核酸，其具有SEQ ID NO :8或9核苷酸序列，(7) 一种包含根据(4)-(6)中任一项的核酸的载体，(8) 一种融合蛋白，其中根据(1)_(3)中任一项的肽附加到靶蛋白的N末端和/或 C末端，(9) 一种编码根据(8)的融合蛋白的核酸，(10) 一种包含根据(9)的核酸的载体，(11) 一种包含根据(4)-(6)或(9)中任一项的核酸或者根据(7)或(10)的载体 的细胞，(12) 一种产生能够结合免疫球蛋白的肽的方法，所述方法包括以下步骤(a)用根据(7)的载体转化细胞；和(b)培养所述细胞以产生所述肽，(13) 一种能够结合免疫球蛋白的肽，其可通过根据(12)的方法获得，(14) 一种产生其中能够结合免疫球蛋白的肽附加到靶蛋白的N末端和/或C末端 的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤(a)用根据(10)的载体转化细胞；和(b)培养所述细胞以产生所述融合蛋白，(15)根据(14)的方法，所述方法还包括从融合蛋白获得靶蛋白的步骤，(16) 一种融合蛋白，其可通过根据(14)或(15)的方法获得，(17) 一种用于结合免疫球蛋白的组合物，所述组合物包含根据(1)_(3)中任一项 的肽或者根据(8)的融合蛋白，(18)根据(17)的组合物，其用于测定免疫球蛋白的存在或数量，或者用于分离免 疫球蛋白，
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(19) 一种用于结合免疫球蛋白的用具，所述用具上固定化了根据(1)_(3)中任一 项的肽或者根据(8)的融合蛋白，(20)根据(19)的用具，其用于测定免疫球蛋白的存在或数量，或者用于分离免疫 球蛋白，(21) 一种用于结合免疫球蛋白的方法，所述方法包括
(a)向样品加入根据(1)_(3)中任一项的肽或者根据⑶的融合蛋白；和(b)检查所述肽或融合蛋白与免疫球蛋白的复合物，(22) 一种供用于根据(21)的方法的试剂盒，所述试剂盒包含能够结合免疫球蛋 白的肽或者含有该肽的融合蛋白，(23) 一种用于治疗或预防由Clq和免疫球蛋白之间的结合引起的疾病的药物组 合物，所述药物组合物包含根据(1)_(3)中任一项的肽或者根据(8)的融合蛋白，(24)根据(23)的药物组合物，其中所述疾病是类风湿性关节炎，(25)根据(23)的药物组合物，其中所述疾病是免疫复合物疾病，如系统性红斑狼 疮(SLE)、血管球性肾炎、血管炎或关节炎，(26)根据(1)_(3)中任一项的肽或者根据⑶的融合蛋白，其是经标记的，和(27) 一种用于检测样品中的抗体的方法，所述方法包括使根据(26)的经标记的 肽或融合蛋白与样品中的抗体反应，然后检测与抗体结合的所述肽或所述融合蛋白。发明的效果根据本发明，提供了以下方面能够结合免疫球蛋白的肽，该肽的融合蛋白，编码 该肽和该融合蛋白的核酸，该肽和该融合蛋白的产生方法，用于结合免疫球蛋白的组合物 和用具，和用于治疗或预防由Clq和免疫球蛋白之间的结合引起的疾病的药物组合物，该 药物组合物包含该能够结合免疫球蛋白的肽或该肽的融合蛋白，以及其他方面。附图简述

图1显示具有6个氨基酸的肽R1、具有9个氨基酸的肽R2和具有15个氨基酸的 肽R3-R6能抑制Clq和免疫球蛋白之间的结合。在这个图中，NC是其中无肽的DMSO加到 不含碱性磷酸酶(ALP)标记人免疫球蛋白(IgG)的反应溶液所得的样品的结果，PC是其中 无肽的DMSO加到不含碱性磷酸酶(ALP)标记人免疫球蛋白(IgG)的反应溶液所得的样品 的结果。图2显示具有6个氨基酸的突变肽R7-R9、具有9个氨基酸的突变肽10和具有15 个氨基酸的突变肽Rll能抑制Clq和免疫球蛋白之间的结合。在这个图中，NC是其中无肽 的DMSO加到不含碱性磷酸酶(ALP)标记人免疫球蛋白(IgG)的反应溶液所得的样品的结 果，PC是其中无肽的DMSO加到不含碱性磷酸酶(ALP)标记人免疫球蛋白(IgG)的反应溶 液所得的样品的结果。图3显示在关节炎诱发的小鼠中通过腹膜内给予(每天一次给予或者每天分两次 给予)10mg/kg的肽R5，关节炎得到了抑制。作为对照，显示了每天给予一次无肽的0. 5% 甲基纤维素溶液的小鼠的结果和每天给予一次0. lmg/kg甲氨喋呤溶液的小鼠的结果。图4显示在关节炎诱发的小鼠中通过腹膜内给予10mg/kg的肽R1，关节炎得到了 抑制。作为对照，显示了类似地给予无肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果。图5显示在关节炎诱发的小鼠中通过腹膜内给予10mg/kg的肽R2，关节炎得到了抑制。作为对照，显示了类似地给予无肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果。图6显示在关节炎诱发的小鼠中通过腹膜内给予10mg/kg的肽R5，关节炎得到了 抑制。作为对照，显示了类似地给予无肽的0.5%甲基纤维素溶液的小鼠的结果。图7显示了在III型过敏性(Arthus)反应诱发的大鼠中通过腹膜内给予10mg/kg 或100mg/kg的肽R1、R2或R5，免疫复合物疾病如SLE、血管球性肾炎、血管炎或关节炎得到 了抑制。作为对照，显示了类似地给予无肽的生理盐水的大鼠的结果。图8显示了在III型过敏性(Arthus)反应诱发的大鼠中通过在尾静脉给予10mg/ kg的肽R1或R2，免疫复合物疾病如SLE、血管球性肾炎、血管炎或关节炎得到了抑制。作为 对照，显示了类似地给予无肽的生理盐水的大鼠的结果。图9显示用本发明的肽检测到抗体。对于每个条带，使用了以下数量的BSA 条带 1,0. lug BSA ；条带 2，0. 5ii g 85八；条带3，1.0118 BSA ；条带 4，2. 0 y g BSA。图10显示通过使用本发明肽的亲和纯化柱纯化到了兔抗体。作为对照，显示了使 用A蛋白进行纯化的结果。各数值表示每个流份中IgG蛋白的数量(mg/ml)。在图中，PT 代表流通流份，W1-5代表洗涤流份，E1-5代表洗脱流份。图11显示通过使用本发明肽的亲和纯化柱纯化到了人抗体。各数值表示每个流 份中IgG蛋白的数量(mg/ml)。在图中，PT代表流通流份，W1-5代表洗涤流份，E1-5代表 洗脱流份。实施本发明的最佳方式在一个方面，本发明涉及选自以下的能够结合免疫球蛋白的肽(a)具有SEQ ID NO :1_7氨基酸序列中任何一个序列的肽；(b)具有由SEQ ID NO :1-7氨基酸序列中任何一个序列缺失、置换或添加一个或 几个氨基酸得到的氨基酸序列的肽；和(c)具有与SEQ ID NO :1_7氨基酸序列中任何一个序列有66. 7%或更高同源性的 氨基酸序列的肽。本发明的肽与A蛋白和G蛋白相比对免疫球蛋白具有低亲和力，因此比 如说，与本发明的肽结合的免疫球蛋白可以在温和条件下解离，等等。另外，结合本发明肽 的免疫球蛋白本身的变性也降低。亲和力可通过相关技术领域的已知方法来评估。例如， 可将肽在免疫球蛋白的存在下进行温育以直接检查是否有结合。本发明的肽能够结合免疫球蛋白。上述的肽是具有SEQ ID N0:l_7氨基酸序列 中任何一个序列的肽，具有由SEQ ID NO :1-7氨基酸序列中任何一个序列缺失、置换或添 加一个或多个、优选一个或几个、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸得到 的氨基酸序列的肽(突变肽)，和具有与SEQ ID NO 1-7氨基酸序列中任何一个序列有例 如26. 6%或更高或者44. 4%或更高、优选至少50%或更高、更优选例如60、66. 7、70、75、 80、83.3、85、90、93%或更高同源性的氨基酸序列的肽。氨基酸序列同源性可用例如？43丁八、 BLAST、DNASIS (Hitachi Software Engineering Co.，Ltd 出品)或 GENETYX(Genetyx Corporation出品)来计算。或者，在短链肽的情况中，还可通过将序列简单地进行比较来 计算。另外，任何这些氨基酸可进行适当修饰。不管肽具有哪个氨基酸序列，本发明的肽都 能够结合免疫球蛋白。本发明的肽可以是任何一个肽，只要它是具有上述的氨基酸序列的肽。例如，它可 以是由SEQ ID NO :1-7本身任何一个序列所示的氨基酸序列组成的肽本身，或者它可包含上述的氨基酸序列或其同源序列作为核心序列，且具有多种附加到该氨基酸序列的N末端 和/或C末端的物质，如肽或氨基酸及它们的类似物、聚乙二醇、糖类、多糖或核苷酸。诸 如荧光标记、生物素、链霉亲和素、地高辛(DIG)、磁珠、胶乳珠或金胶体的物质可经由氨基 酸或肽附加到所述N/C末端。例如，当结合上肽时，这种肽可以是包含1-50个、例如1-20、 1-15或1-9个氨基酸的肽。另外，这种肽可以是具有诸如充当组氨酸标签、GST标签、S标 签、Myc标签、HA标签或E标签的功能的肽。本发明的肽可通过本领域技术人员知道的多种方法产生和获得。例如，它可基于 编码本发明的肽的核苷酸序列通过遗传工程方式产生。由于如上所述本发明的肽能够结合 免疫球蛋白，通过使用这种肽来结合免疫球蛋白，可以测定免疫球蛋白的存在或数量，分离 免疫球蛋白，等等。在另一个方面，本发明涉及编码能够结合免疫球蛋白的肽的核酸，所述核酸选自 以下(a)编码上述的肽的核酸；(b)具有SEQ ID NO :8_16核苷酸序列中任何一个序列的核酸；(c)具有由SEQ ID NO :8_16核苷酸序列中任何一个序列缺失、置换或添加一个或 几个核苷酸得到的核苷酸序列的核酸；(d)可在严格条件下与(b)或(c)的核酸或者它们的互补链杂交的核酸；和(e)具有与SEQ ID NO :8_16核苷酸序列中任何一个序列有50%或更高同源性的 核苷酸序列的核酸。在本文中，核酸指单链或双链DNA或RNA。本发明的核酸可通过本领域 技术人员知道的多种方法产生和获得。在本发明中，SEQ ID NO :8、10、12和13核苷酸序列 衍自Clq B亚单位，分别编码SEQ ID NO :1、2、3和4氨基酸序列。类似地，SEQ ID NO :9、 11和14-16核苷酸序列衍自Clq C亚单位，分别编码SEQ ID NO :1、2、5和6氨基酸序列。具体地讲，本发明的核酸是(1)编码具有SEQ ID NO: 1-7氨基酸序列中任何一个 序列的肽的核酸，(2)编码具有由SEQ ID NO :1-7氨基酸序列中任何一个序列缺失、置换或 添加一个或多个、优选一个或几个、例如2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个氨基酸得 到的氨基酸序列的肽的核酸，(3)编码具有与SEQ ID NO: 1-7氨基酸序列中任何一个序列 有例如26. 6%或更高或者44. 4%或更高、优选至少50%或更高、更优选例如60、66. 7、70、 75,80,83. 3、85、90、93%或更高同源性的氨基酸序列的肽的核酸，⑷具有SEQ ID NO :8_16 核苷酸序列中任何一个序列的核酸，(5)具有由SEQ ID NO :8-16核苷酸序列中任何一个序 列缺失、置换或添加一个或多个、优选一个或几个、例如2、3、4、5、6、7、8或9个核苷酸得到 的核苷酸序列的核酸，(6)可在严格条件下与(3)或(4)的核酸或者它们的互补链杂交的 核酸，和(7)具有与SEQ ID NO :8-16核苷酸序列中任何一个序列有至少50%或更高、优选 例如60、70、75、80、90、93、95或97%或更高同源性的核苷酸序列的核酸，等等。另外，任何 这些核苷酸可进行适当修饰。不管核酸具有哪个核苷酸序列，本发明的核酸都可编码能够 结合免疫球蛋白的肽。作为以上提到的严格条件，例如可举出诸如J. Sambrook等人，‘‘Molecular Cloning :A Laboratory Manual,Second Edition" ,1989,ColdSpring Harbor Laboratory Press中描述的条件。例如，在含有6XSSC、5XDenhardt溶液、0. 5% SDS禾口 100 ii g/ml变 性鲑精DNA的溶液中在68°C下与探针杂交之后，将洗涤条件从2XSSC，0. 1% SDS中室温变
8成在0. 1XSSC,0. 5% SDS中68°C的条件；在65°C下、在含有2XSSPE(描述于Frederick M.Ausubel 入，“Current Protocols in MolecularBiology“ , 1987, John Wiley & Sons，Hoboken NJ.)禾口 0. SDS的溶液中15分钟两次、再在含有0. 5XSSPE和0. SDS 的溶液中15分钟两次、然后在含有0. 1 X SSPE和0. 1 % SDS的溶液中15分钟两次的这么一 种条件；或者在65°C下、在含有2XSSPE，0. 1% SDS和甲酰胺(5-50% )的溶液中15分钟 两次、再在含有0. 5XSSPE，0. 1% SDS和甲酰胺(5-50% )的溶液中15分钟两次、然后在含 有0. 1XSSPE，0. 1% SDS和甲酰胺(5-50% )的溶液中15分钟两次的这么一种条件，等等。上述的核苷酸序列同源性可用例如FASTA、BLAST、DNASIS (Hitachi Software Engineering Co.，Ltd 出品)或 GENETYX(GenetyxCorporation 出品)来计算。本发明的核酸可以是任何核酸，只要它具有上述的核苷酸序列。例如，它可以是由 SEQ ID NO :8-16核苷酸序列本身任何一个序列组成的核酸，或者它可包含上述的核苷酸序 列作为核心序列，且具有多种结合到该序列的5'末端和/或3'末端的物质，如核苷酸、多 核苷酸或它们的类似物。例如，当结合上多核苷酸时，所述多核苷酸可以是包含1-150个、 例如1-60、1-45或1-18个核苷酸的多核苷酸。在另一方面，本发明涉及包含上述核酸的载体。本发明的载体可以是任何载体，只 要它包含上述核酸。载体的类型、上述核酸的核苷酸序列以外的序列等，可根据诸如导入该 载体的宿主的类型以及目的等各种条件进行选择。例如，本发明的载体也可用作其中能够 结合免疫球蛋白的肽附加到靶蛋白的N末端或C末端的融合蛋白的表达载体，所述附加是 通过将编码靶蛋白的核苷酸序列同框插入在SEQ IDN0:8或9核苷酸序列的5'末端3'或 末端进行。为了容易从融合蛋白分离靶蛋白，本发明的载体可含有在上述核苷酸序列和靶 蛋白核苷酸序列插入位点之间的，能被诸如HRV 3C、凝血酶、Xa因子或肠激酶的蛋白酶识 别的序列。可通过将本发明的载体导入细胞中以产生蛋白质，来获得上述本发明的能够结 合免疫球蛋白的肽。在另一个方面，本发明涉及其中能够结合免疫球蛋白的本发明肽附加到靶蛋白的 N末端和/或C末端的融合蛋白。本发明的融合蛋白可通过本领域技术人员知道的多种方 法产生和获得。由于本发明的融合蛋白是包含能够结合免疫球蛋白的肽的融合蛋白，可将 这种肽用作标签序列以分离和/或纯化靶蛋白，等等。另外，由于如上所述，本发明的肽对 免疫球蛋白的亲和力低，本发明的融合蛋白具有诸如以下的优点比如当在纯化柱上固定 化时，可以在比A蛋白或G蛋白温和的条件下纯化免疫球蛋白并反复使用该柱(柱的劣化 得到抑制)，又比如当用作探针以检测免疫球蛋白时，可容易进行再探测。本发明融合蛋白中所含的靶蛋白可以是任何蛋白质。当本发明的融合蛋白含有 诸如碱性磷酸酶(ALP)、过氧化物酶(HRP)、荧光蛋白如萤光素酶或绿色荧光蛋白(GFP)、 3 -半乳糖苷酶、谷胱甘肽S-转移酶或麦芽糖结合蛋白的酶作为靶蛋白时，可容易检测本 发明融合蛋白中所含的能够结合免疫球蛋白的肽与免疫球蛋白之间的结合，等等。另外，本 发明的融合蛋白可含有例如诸如以下的标签序列组氨酸标签、GST标签、S标签、Myc标签、 HA标签或E标签、核定位信号、二氧化硅结合蛋白或者A蛋白，以及其他标签序列。本发明的融合蛋白可含有在本发明肽和靶蛋白之间的能被蛋白酶识别的肽。含有 这种肽可使得靶蛋白容易从融合蛋白分离。因此，在另一个方面，本发明涉及编码上述融合蛋白的核酸。
另外，本发明涉及包含编码上述融合蛋白的核酸的载体。可通过将这种载体导入 细胞中产生蛋白质，来获得本发明的融合蛋白。在一个方面，本发明涉及包含有编码上述能够结合免疫球蛋白的肽的核酸、编码 上述融合蛋白的核酸或者包含这些核酸的载体的细胞。可通过用上述的核酸或载体转化宿 主细胞如大肠杆菌、酵母、昆虫细胞或动物细胞，来产生本发明的细胞。还可通过培养本发 明的细胞，并收集所产生的能够结合免疫球蛋白的肽或者含有能够结合免疫球蛋白的肽的 融合蛋白，来产生本发明的肽或者融合蛋白。在另一方面，本发明涉及产生能够结合免疫球蛋白的肽的方法，所述方法包括以 下步骤(a)用包含编码能够结合免疫球蛋白的肽的核酸的载体转化细胞；和(b)培养所述细胞以产生所述肽。细胞的转化可通过本领域技术人员知道的手段和/或方法来进行。因此，本发明涉及可通过上述肽产生方法获得的，能够结合免疫球蛋白的肽。在另一个方面，本发明涉及产生其中能够结合免疫球蛋白的肽附加到靶蛋白的N 末端和/或C末端的融合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤(a)用包含编码其中能够结合免疫球蛋白的肽附加到靶蛋白的N末端和/或C末 端的融合蛋白的核酸的载体转化细胞；和(b)培养所述细胞以产生所述融合蛋白。本发明融合蛋白的产生方法还可包括从融合蛋白获得靶蛋白的步骤。因此，本发明涉及可通过上述的融合蛋白产生方法获得的，其中能够结合免疫球 蛋白的肽附加到靶蛋白的N末端和/或C末端的融合蛋白。在一个方面，本发明涉及用于结合免疫球蛋白的组合物，所述组合物包含能够结 合免疫球蛋白的肽或者含有这种肽的融合蛋白。可根据各种条件，例如本发明组合物的使 用目的，适当选择上述肽或融合蛋白质之外的成分。如上所述，由于本发明的组合物含有能 够结合免疫球蛋白的肽，本发明的组合物可以是例如用于检测免疫球蛋白的存在或数量的 组合物，或者用于分离免疫球蛋白的组合物。借助本发明的组合物，可以测定样品中的免疫 球蛋白的数量，从样品分离免疫球蛋白，等等。在另一个方面，本发明涉及用于结合免疫球蛋白的用具，所述用具上固定化有能 够结合免疫球蛋白的肽或者含有这种肽的融合蛋白。本发明的用具是这样的用具，其中上 述的肽或融合蛋白固定化在诸如板、树脂、柱、珠粒、含有糖如琼脂糖或琼脂糖凝胶的树脂、 硅石底物、玻璃(载玻璃及其他玻璃)、金属(金及其他金属)或者磷灰石的载体上。固定 化可通过本领域技术人员知道的手段/方法进行，例如经由肽或蛋白质的氨基或羧基进行 的方法、经由氨基酸侧链的SH基团进行的方法、通过离子相互作用进行的方法和通过疏水 相互作用进行的方法。由于如上所述，本发明的用具是其上固定化有能够结合免疫球蛋白的肽的用具， 本发明的用具包括用于测定免疫球蛋白的存在或数量的用具和用于分离免疫球蛋白的用 具。本发明的用具还可用作例如ELISA板、免疫球蛋白纯化柱、检测用玻璃阵列、微流体系 统、SPR传感器芯片、检测用硅石底物、药物抗体纯化系统，等等。在另一方面，本发明涉及结合免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步骤
(a)向样品加入能够结合免疫球蛋白的肽或者含有这种肽的融合蛋白；和(b)检查所述肽或融合蛋白与免疫球蛋白的复合物。样品可以是任何样品，只要该样品可含有免疫球蛋白。通过检查与免疫球蛋白所 成的复合物的存在和/或数量，可以确定样品中是否存在免疫球蛋白，并且确定样品中存 在的免疫球蛋白的数量，等等。本发明方法中所用的肽或融合蛋白可以是经过标记的。标记 可包括本领域技术人员知道的各种标记，如生物素酰化标记、荧光标记、RI标记或酶标记。 加入这样的标记有助于检查与肽或融合蛋白所成的复合物。另外，本发明的方法可包括从 复合物分离免疫球蛋白的步骤。因此，本发明涉及供在用于结合免疫球蛋白的方法中使用的试剂盒，所述试剂盒 装有能够结合免疫球蛋白的肽或包含这种肽的融合蛋白。除了上述的肽或融合蛋白之外， 本发明的试剂盒还装有例如标记、检查复合物的用具，等等。在其他方面，本发明涉及用于治疗或预防由Clq和免疫球蛋白之间的结合引起的 疾病的药物组合物，所述药物组合物包含有能够结合免疫球蛋白的肽或包含这种肽的融合 蛋白。由Clq和免疫球蛋白之间的结合引起的疾病指直接或间接由这种结合引起的疾病， 例如可包括免疫复合物疾病如类风湿性关节炎、关节炎、系统性红斑狼疮(SLE)、血管炎症 群或肾炎、其他炎性疾病、传染病或者恶性肿瘤，等等。本发明的药物组合物可通过用所含 的能够结合免疫球蛋白的肽抑制Clq和免疫球蛋白之间的结合，来治疗和预防上述疾病。 要指出的是，将本发明的肽给予人，所产生的副作用极少，因为本发明的肽是衍自天然存在 于人体内的Clq，且只有短短6-15个残基。在另一方面，本发明涉及治疗或预防由Clq和免疫球蛋白之间的结合引起的疾 病，所述方法包括将有效量的能够结合免疫球蛋白的肽或者包含这种肽的融合蛋白给予受试者。下文给出实施例，对本发明作具体且详细的描述，但是不应将这些实施例理解为 限制本发明。实施例1Clq中的为免疫球蛋白所识别的氨基酸序列的鉴定材料和方法人Clq的亚单位A链、B链和C链的氨基酸序列在SEQ ID NO :17_19中显示，核苷 酸序列在SEQ ID N0:20-22中显示。基于各个氨基酸序列，在玻璃阵列上合成出这样的具 有氨基酸序列的序列作为合成肽它们从每个具15个氨基酸(残基)的亚单位的氨基酸序 列，每次以三个氨基酸的间隔移位(依次为肽编号1-78、97-117和193-270)。每个肽的合 成是在阵列上的特定位置进行，以制备出包含着涵括Clq亚单位的全体氨基酸序列的合成 肽的肽阵列。说明阵列的制作外包给JPT进行。用在PBS(10mM磷酸盐缓冲溶液，pH 7.0,0. 1M NaCl)中稀释1000倍的Cy3标记 山羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG) (lmg/ml ；ZymedLaboratories制造)330iU包被肽阵列，密封 后在4°C下温育12小时。然后用甲醇洗涤阵列一次，用Milli-Q水洗涤5分钟X5次。将 阵列载片离心干燥，用荧光扫描仪(Agilent DNA微阵列扫描仪；Agilent制造)进行扫描， 用软件(Feature Extraction软件；Agilent制造)定量阵列上的每个肽斑点的荧光强度。 检测到几个显示强烈荧光强度的斑点。其中，显示荧光强度比背景水平高60，000倍或更高的肽斑点的氨基酸序列(SEQ ID NO 3-7)在表1中示出。说明在本文中氨基酸是用相关 领域公知的单字母符号来表示。[表1] *背景荧光强度为2. 6结果肽No. 149和No. 150具有衍自Clq B亚单位(B链)的序列，肽No. 244-No. 246具 有衍自Clq C亚单位(C链)的序列。从这些序列预测到，Clq和免疫球蛋白之间的结合所 需的序列是具有CKVPGLYYF(SEQ ID NO 2)这9个残基作为核心的序列。另外观察到，若该 序列含有这个核心序列，其N末端或C末端一侧附加上氨基酸残基并不妨碍其与免疫球蛋 白的结合。肽No. 149、150和244-246的核苷酸序列在SEQ ID NO 12-16中显示。实施例2能够结合免疫球蛋白的肽对免疫球蛋白和Clq之间的结合的抑制抑制活性的检 查⑴材料和方法研究了据认为是Clq和免疫球蛋白(IgG)之间的结合所必需的9残基肽 CKVPGLYYF(SEQ ID NO 2)是否能抑制Clq和免疫球蛋白之间的结合。具有SEQ ID NO 2 的氨基酸序列的肽(R2)、具有比这个肽短的氨基酸序列PGLYYF(SEQ ID N0:1)的肽(Rl)、 以及含有SEQ IDN0 2所示的氨基酸序列的以下肽具有氨基酸序列SGKFTCKVPGLYYFT (SEQ ID NO 3)的肽(R3)、具有氨基酸序列 FTCKVPGLYYFTYHA(SEQ ID NO 4)的肽(R4)、 具有氨基酸序列STGKFTCKVPGLYYF(SEQ ID NO 5)的肽(R5)和具有氨基酸序列 CKVPGLYYFVYHASH(SEQ ID NO 7)的肽(R6)，外包给 GL Biochem(上海)制备。这些肽在表 2中示出。将每个肽溶于二甲亚砜中至10mg/ml的浓度并保存。[表 2] 将人Clq 蛋白(Carbiochem 制造)溶于 10mM HEPES，300mMNaCl 和 40%甘油(pH 7.2)中，制备200iig/ml人Clq蛋白溶液。将人Clq蛋白溶液每次2 yl (400ng)点滴到 5mmX 15mm大小的硝酸纤维膜(Hybond C ；Amersham制造)上，在室温下风干大约1小时。 将硝酸纤维膜浸入TBS中，温育5分钟，然后用含有5%封闭剂(AmershamECL封闭剂；GE Healthcare 制造)的 TBS(20mM Tris-HCl pH 7. 5,150mM NaCl)在室温下封闭 1 小时。该 膜在TBS中稍微洗涤后，浸入碱性磷酸酶(ALP)标记人免疫球蛋白(IgG) (BECKMAN COULTER 制造)1000倍稀释于TBS中且使各肽浓度达到500 u g/ml所得的混合溶液20 yl中，让其 在室温下反应1小时。在TTBS溶液(其中加入Tween 20至0. 05%的最终浓度的TBS)中 稍微洗涤后，将膜在相同溶液中洗涤10分钟，期间振荡三次。使用ALP标记免疫球蛋白(IgG)的检测方法硝酸纤维膜在ALP着色缓冲液(含有lOOmM NaCl,5mM MgCl2，pH 9. 5 的 Tris-HCl) 中稍微洗涤后，将其浸入含有BCIP/NBT溶液(Promega制造)的30 yl ALP着色缓冲液中， 在室温下着色10分钟。一旦获得染色像，将硝酸纤维膜浸入足量的蒸馏水中洗去着色缓冲 液。洗涤后，将硝酸纤维膜风干，用Multi Gauge (FUJIFILM)采集染色像。结果结果在图1中显示。不仅具有据认为是Clq和免疫球蛋白(IgG)之间的结合所必 需的9个氨基酸的肽R2以及具有这个肽作为核心序列的肽(肽R3-6)抑制了该结合，而且 具有更短的氨基酸序列的肽(肽R1)也抑制了该结合，由这个事实可知具有6氨基酸残基 PGLYYF(SEQ ID N0:1)作为核心的序列对于免疫球蛋白和Clq之间的结合是重要的。另外 还发现这些肽通过抑制Clq和免疫球蛋白之间的结合，有可能治疗或预防由这个结合引起 的疾病。抑制活性的检查(2)材料和方法除了实施例2的抑制活性的检查⑴中所示的肽之外，还研究了它们的突变肽是 否能抑制Clq和免疫球蛋白之间的结合。表3中示出的肽是外包给GL Biochem(上海)制 备。将每个肽溶于二甲亚砜中至10mg/ml的浓度并保存。说明实验是用与实施例2的抑制活性的检查(1)同样的方法进行，且还对作为对照的肽R1、R2和R5进行了试验。[表 3] 结果结果在图2中显示。其中特定的氨基酸被丙氨酸置换的肽充分抑制了 Clq和免疫 球蛋白之间的结合。因此，由于这些突变肽或者含有这些突变肽作为核心的肽也能抑制Clq 和免疫球蛋白之间的结合，可知有可能治疗或预防由这个结合引起的疾病。实施例3能够结合免疫球蛋白的肽的关节炎抑制作用的研究(1)能够结合免疫球蛋白的肽的对关节炎诱发小鼠的关节炎抑制作用-1材料和方法使用混合单克隆抗体(monoclonal antibody cocktail)诱发的关节炎小鼠 (BALB/c Cr Slc (SPF))，研究了实施例2标示为R5的肽的关节炎抑制作用。静脉内给 予2mg/个体的关节炎诱发用混合单克隆抗体，三天后腹膜内给予50 μ g/个体的脂多糖 (LPS)，诱发关节炎。自LPS给予后次日(第4天)起直到第14天，每天一次或每天分两次 腹膜内给予10mg/kg的肽R5。从第4天起每天一次口服给予0. lmg/kg的阳性对照药甲氨喋 呤。从第0天至第14天双日测量四肢的临床分数。在麻醉下，用含有肝素的生理盐水进行 脱血，连续注入冰冷的4%多聚甲醛溶液以灌注固定全身。灌注固定后，切取两后肢膝关节 (切断大腿骨中部和胫骨中部；除去皮肤和肌肉)和踵关节(从胫骨中部到趾头)，再用4% 多聚甲醛溶液过夜(4°C)浸渍固定。之后，将两膝关节和两踵关节转移到50mM PBS (4°C), 然后从两个方向(内侧面方向和上面方向)进行踵关节的软X射线照相。肽溶液的制备基于动物的体重计算肽的必要量。用0.5%甲基纤维素溶液制备肽溶液，达到 lmg/ml的浓度，并将制备得到的肽溶液冷藏保存。甲氨喋呤溶液的制备如下制备甲氨喋呤称取lmg，放入玛瑙研钵中，用研棒粉碎，徐徐加入0.5%甲基 纤维素溶液进行悬浮，达到0.01mg/ml的浓度。然后将制备物冷藏保存。
体重测量、一般状态观察和分组在试验期间，以给予关节炎诱发用混合单克隆抗体的日期为第0天，在第0、3、6、9、12和14天测量动物的体重。一般状态观察则是每天进行。关节炎模型的制作在第0天给20只7周龄小鼠静脉内给予2mg/个体的关节炎诱发用混合单克隆抗 体，在第3天腹膜内给予LPS 50 μ g/个体。肽溶液的给予从第4天起，每天一次(早上)或者每天分两次(早上和下午)腹膜内给予肽溶 液10mg/kg。作为对照，从第4天起，每天一次(早上)腹膜内给予0.5%甲基纤维素溶液。 使用注射针(26G，Terumo)和注射筒(1. Oml容量，Terumo)进行给予。用量为10ml/kg。从 第4天起，每天一次(早上)口服给予甲氨喋呤0. lmg/kg。使用经口探头(小鼠用经口探 头，Fuchigami器械店)和注射筒(1. Oml容量，Terumo)进行给予。用量为10ml/kgo临床分数观察按以下方案从第0天到第14天双日观察临床分数。四肢合计最大12分。〈临床分数〉0:正常关节1 轻度炎症和发红2 手足全体严重红斑和肿胀，妨碍手足的使用3 手足或关节变性伴强直、关节硬直、机能丧失统计分析处理方法试验结果以平均值士标准偏差表示，用EXSAS (Version 7. 1. 6，ArmSystex Co.， Ltd.)进行分析。对临床分数进行Wilcoxon检验。足部的肿胀情况直接用肉眼观察。结果结果在图3中显示。在每天一次给予和每天分两次给予之间，没有观察到肽R5的 有效性的显著差异，但观察到对关节炎抑制的效果。另外，关节炎抑制水平比甲氨喋呤高。 从这个结果可知，本发明的肽比已经临床使用的药物具有更好的关节炎抑制作用，可用于 治疗和预防关节炎及相关疾病。(2)能够结合免疫球蛋白的肽的对关节炎诱发小鼠的关节炎抑制作用_2材料和方法使用混合单克隆抗体诱发的关节炎小鼠，研究了实施例2标示为R1、R2和R5的肽 的关节炎抑制作用。对小鼠静脉内给予2mg/个体的关节炎诱发用混合单克隆抗体，三天后 腹膜内给予50μ g/个体的LPS，诱发关节炎。对于每种肽，从给予关节炎诱发用混合单克隆 抗体的当天(第0天)起，分别每天分两次给予10mg/kg，持续14天，通过临床分数研究关 节炎抑制作用。说明实验是用与实施例3(1)同样的方法进行。肽溶液的制备基于动物的体重计算每种肽的必要量。用0. 5%甲基纤维素溶液制备肽溶液，达到 lmg/ml的浓度，并冷藏保存。体重测量和一般状态观察在试验期间，以给予关节炎诱发用混合单克隆抗体的日期为第0天，在第0、3、6、9、12和14天测量动物的体重。一般状态观察则是每天进行。关节炎模型制作和分组在开始给予前一天测量体重，用分组软件随机分配，使得每组的平均体重值大约相等。在第0天给20只7周龄小鼠静脉内给予2mg/个体的关节炎诱发用混合单克隆抗体， 在第3天腹膜内给予LPS 50 μ g/个体。肽溶液的给予从第0天起，每天分两次即早上和下午腹膜内给予每种肽溶液。作为对照，从第0 天起，每天分两次腹膜内给予0.5%甲基纤维素溶液。使用了注射针(26G，TerUmo)和注射 筒(1. Oml容量，Terumo)进行给予。用量为10ml/kg。临床评分观察以给予关节炎诱发用混合单克隆抗体的当天为第O天，按照以下方案在双日观察 所有病例的四肢临床分数，直到第14天为止。四肢合计最大12分。〈临床分数〉O 正常关节1 轻度炎症和发红2 手足全体严重红斑和肿胀，妨碍手足的使用3 手足或关节变性伴强直、关节硬直、机能丧失统计分析处理方法试验结果以平均值(标准偏差表示，用EXSAS士Version 7. 1. 6，ArmSystex Co.， Ltd.)进行分析。对临床分数进行Wilcoxon检验。足部的肿胀情况直接用肉眼观察。结果结果在图4、图5和图6中显示。在所有的每天分两次给予了 10mg/kg的R1、R2或 R5的组中都观察到关节炎抑制作用。因此证明本发明的肽具有关节炎抑制作用，可用于治 疗和预防关节炎及相关疾病。另外，在任何使用的肽中都没有观察到一般状态的异常或者 对体重的作用。此外，在使用小鼠的试验中，本发明的肽没有显示毒性作用。另外，由于本发明的 肽是衍自天然存在于人体内的Clq，且只有短短6-15个残基，预期使用本发明的肽的话，治 疗或预防所伴随产生的副作用会减低。实施例4能够结合免疫球蛋白的肽的免疫复合物疾病抑制作用的研究材料和方法用64只7周龄的Slc =Wistar品系雄性大鼠，分两次即对每一种给予方法(腹膜 内给予和尾静脉内给予)进行肽Rl、R2和R5的试验。连续9天或更长时间给予正常固体 饲料CRF-I进行驯化。在给予前一天，刮掉动物的背毛，在给予当天，将OVA+Evans蓝色染料 混合溶液给予尾静脉。若是腹膜内给予的话在给予OVA+Evans蓝色染料混合溶液30分钟 后，若是尾静脉内给予的话在50分钟后，分别给予每种肽溶液。对于抗OVA溶液的皮内给 予，若是腹膜内腹给予的话在给予试验物质后30分钟，若是静脉内给予的话在10分钟后， 将溶液以0. Iml/部位的用量给予动物的背部，以局部诱发Arthus反应。诱发后4小时，将 动物安乐死，完全放血后剥离背部皮肤。将剥离的皮肤上的Arthus反应部位冲取下来，从这块皮肤过夜提取Evans蓝色染料。通过用分光光度计测量Evans蓝色染料的吸光度和 使用标准曲线，对漏出的染料量进行定量(说明关于实施例4中所用的实验方法，应参考 H. Okamoto, Y. Iwahisa禾口M. Terasawa !Suppression of the Arthusreaction by Y-24180, a potent and specific antagonist of ρlatelet-activatingfactor. Agents Actions, 35 149-158(1992))以下示出本实验中所用的每种肽溶液〈阴性对照物质〉生理盐水<肽溶液>将所定量称量的每种肽(肽Rl、R2和R5)分别溶于生理盐水中，得到20mg/ml溶 液。用生理盐水将20mg/mL溶液进行10倍稀释，制备2mg/ml溶液。5mg/ml溶液是通过将 所定量称量的每种肽溶于生理盐水中获得制备溶液来制备。Arthus 反应将OVA+Evans蓝色染料混合溶液以2ml/kg给予尾静脉内。若是腹膜内给予的话在 给予OVA+Evans蓝色染料混合溶液30分钟后，若是尾静脉内给予的话在50分钟后，分别给 予每种肽溶液。对于抗OVA溶液的皮内给予，若是腹膜内腹给予的话在给予试验物质后30 分钟，若是静脉内给予的话在10分钟后，将溶液以0. Iml/部位的用量给予动物的背部，以 局部诱发Arthus反应。皮内给予是，对于每个动物，PBS部位有两个，抗OVA溶液部分有两 个。诱发后4小时，通过在乙醚麻醉下使动物断头将其安乐死，完全放血后剥离背部皮肤。 用冲压机将剥离的皮肤上的Arthus反应部位冲取下来，用于进行染料提取。染料提取和测量在用冲压机冲取的皮肤条带上几个位置处切出切口，浸入2ml的染料提取溶液 中，振荡搅拌10分钟。之后在室温下静置过夜。静置过夜后，将溶液再振荡10分钟，离心 (1500rpm, 15分钟)，取其上清液用作染料测量样品。用UV-1600 (株式会社岛津制作所) 在OD 620nm波长下进行测量。从染料量标准曲线算出漏出染料量。数据处理和统计学处理对体重测量值和漏出染料量算出组平均值(mean) 士标准偏差(SD)。对于漏出染 料量，每只动物的值是将两个抗OVA溶液给予部位的平均值减去两个PBS给予部位的平均 值所得的值。对漏出染料量进行了以下统计学分析在第一个试验中(腹膜内给予每种肽 溶液)，分别进行第一组对第二和第三组、第一组对第四和第五组以及第一组对第六和第七 组的Bartlett方差齐性检验，如果方差不存在差异的话通过Durmett多重比较检验，或者 如果方差存在差异的话通过Steel多重比较检验，对第一组和其他各组之间的平均值的差 异进行检验；在第二个试验中(尾静脉内给予每种肽溶液)，进行第九组对第十组、第十一 组和第十二组的Bartlett方差齐性检验，如果方差不存在差异的话通过Durmett多重比较 检验，或者如果方差存在差异的话通过Steel多重比较检验，对第九组和其他各组之间的 平均值的差 异进行检验。显著水平对于Bartlett方差齐性检验为5%，对于其他检验为两 侧5%。
结果对于每种肽溶液，分别在图7中示出腹膜内给予的结果，在图8中示出尾静脉内给予的结果。在本实施例所用的III型过敏(Arthus)反应模型系统中，观察到与对照相比Evans蓝色漏出量减少大约30%，这被认为对于抑制诸如SLE、血管球性肾炎、关节炎或血 管炎等的免疫复合物疾病是有效的。在肽溶液的腹膜内给予中，在肽R1、R2和R5都观察到 明确且充分的对免疫复合物疾病的抑制作用。另外，在尾静脉给予中，在肽Rl和R2观察到 明确且充分的对免疫复合物疾病的抑制作用。因此证明本发明的肽具有明确且充分的对免 疫复合物疾病的抑制作用，可用于治疗和预防诸如SLE、血管球性肾炎、关节炎或血管炎等 的免疫复合物疾病。实施例5使用能够结合免疫球蛋白的肽的抗体检测剂的研究材料和方法研究了在蛋白质印迹法中，是否可用生物素酰化的肽取代第二抗体来检测第一抗 体。生物素酰化的肽R5是外包给GL Biochem(上海)制备的。将BSA在12% SDS-PAGE中电泳，然后转移到PVDF膜上。转移后，将PVDF膜在5% 脱脂乳中进行封闭。将PVDF膜浸入抗BSA IgG (兔)的2000倍稀释溶液中，在室温下反应 1小时。在TBST中洗涤三次。将生物素酰化肽R5溶于DMSO中达10mg/ml的浓度，将IOul 的此溶液加到IOml的TBST(1000倍稀释)中，在室温下反应1小时。在TBST中洗涤三次。 用VECTOR laboratories公司制造的ABC kit进行着色。着色溶液中使用了硫酸镍和二氨 基联苯胺，底物中使用了过氧化氢溶液。结果结果在图9中显示。可以用生物素酰化的本发明肽取代第二抗体检出PVDF膜上 的抗体。因此证明本发明的肽经生物素酰化可用于抗体的检测。[实施例6]使用能够结合免疫球蛋白的肽的抗体纯化柱的研究材料和方法对使用能够结合免疫球蛋白的肽的抗体纯化柱进行了研究。说明A蛋白用作对 照。肽柱的制备给PD-10 空柱填充 Iml 的 NHS 活化 Sepharose 4B Fast Flow,用 IOml 的 ImM HCl 洗涤，并用IOml的PBS平衡。将5mg的肽R4溶于Iml的PBS后加到柱子，将柱子在室温下 旋转4小时。用5ml的PBS洗涤柱子，然后加入Iml的IM甘氨酸，在室温下将柱子旋转2 小时，以封闭未反应的MHS。除去IM甘氨酸，用IOml的PBS洗涤柱子进行平衡。抗体的纯化向亲和纯化柱加入Img的抗BSA IgG(兔)(抗牛血清白蛋白IgG(兔))，在室温 下旋转柱子2小时。用15ml的PBS进行洗涤。加入5ml的0. IM甘氨酸-HCl (pH 3. 2)将 抗BSA IgG洗脱，收集在5个含有IOOul的IM Tris的微管中各lml。用DC蛋白分析试剂 盒(Protein AssayKit) (Bio-Rad)定量洗脱流份中的蛋白质的量。另外，对人IgG进行同 样的吸附-洗脱试验。结果结果在图10中显示。在使用本发明肽的柱子中，纯化用的兔抗体70-80%得到回收。这个回收率优于对照A蛋白。另外证实使用本发明肽的亲和纯化柱也适用于纯化人IgG(图11)。因此证实其中固定化有本发明肽的用具在抗体纯化中极为有用。工业实用性根据本发明，获得了能够结合免疫球蛋白的肽和该肽的融合蛋白、编码该肽和该 融合蛋白的核酸等，因此，本发明可用于免疫球蛋白的检测、分离和纯化领域，和治疗或预 防由Clq和免疫球蛋白之间的结合引起的疾病用的药物组合物领域，所述疾病例如类风湿 性关节炎或者免疫复合物疾病如SLE、血管球性肾炎、血管炎或关节炎。序列表自由文本SEQ ID NO 1 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 2 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 3 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 4 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 5 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 6 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 7 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 23 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 24 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 25 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 26 免疫球蛋白结合肽SEQ ID NO 27 免疫球蛋白结合肽。
权利要求
一种能够结合免疫球蛋白的肽，所述肽选自以下(a)具有SEQ ID NO1-7氨基酸序列中任何一个序列的肽；(b)具有由SEQ ID NO1-7氨基酸序列中任何一个序列缺失、置换或添加一个或几个氨基酸得到的氨基酸序列的肽；和(c)具有与SEQ ID NO1-7氨基酸序列中任何一个序列有66.7％或更高同源性的氨基酸序列的肽。
2.权利要求1的肽，其具有SEQID NO :1_7氨基酸序列中任何一个序列。
3.权利要求1或2的肽，其具有SEQID NO 1氨基酸序列。
4.一种编码能够结合免疫球蛋白的肽的核酸，所述核酸选自以下(a)编码根据权利要求1的肽的核酸；(b)具有SEQID NO 8-16核苷酸序列中任何一个序列的核酸；(c)具有由SEQID NO :8-16核苷酸序列中任何一个序列缺失、置换或添加一个或几个 核苷酸得到的核苷酸序列的核酸；(d)可在严格条件下与(b)或(c)的核酸或者它们的互补链杂交的核酸；和(e)具有与SEQID NO :8-16核苷酸序列中任何一个序列有50%或更高同源性的核苷 酸序列的核酸。
5.根据权利要求4的核酸，其具有SEQID NO :8-16核苷酸序列中任何一个序列。
6.根据权利要求4或5的核酸，其具有SEQID NO :8或9核苷酸序列。
7.一种包含根据权利要求4-6中任一项的核酸的载体。
8.一种融合蛋白，其中根据权利要求1-3中任一项的肽附加到靶蛋白的N末端和/或 C末端。
9.一种编码根据权利要求8的融合蛋白的核酸。
10.一种包含根据权利要求9的核酸的载体。
11.一种包含根据权利要求4-6或9中任一项的核酸或者根据权利要求7或10的载体 的细胞。
12.—种产生能够结合免疫球蛋白的肽的方法，所述方法包括以下步骤(a)用根据权利要求7的载体转化细胞；和(b)培养所述细胞以产生所述肽。
13.—种能够结合免疫球蛋白的肽，其可通过根据权利要求12的方法获得。
14.一种产生其中能够结合免疫球蛋白的肽附加到靶蛋白的N末端和/或C末端的融 合蛋白的方法，所述方法包括以下步骤(a)用根据权利要求10的载体转化细胞；和(b)培养所述细胞以产生所述融合蛋白。
15.根据权利要求14的方法，所述方法还包括从融合蛋白获得靶蛋白的步骤。
16.一种融合蛋白，其可通过根据权利要求14或15的方法获得。
17.一种用于结合免疫球蛋白的组合物，所述组合物包含根据权利要求1-3中任一项 的肽或者根据权利要求8的融合蛋白。
18.根据权利要求17的组合物，其用于测定免疫球蛋白的存在或数量，或者用于分离 免疫球蛋白。
19.一种用于结合免疫球蛋白的用具，所述用具上固定化了根据权利要求1-3中任一 项的肽或者根据权利要求8的融合蛋白。
20.根据权利要求19的用具，其用于测定免疫球蛋白的存在或数量，或者用于分离免 疫球蛋白。
21.一种用于结合免疫球蛋白的方法，所述方法包括(a)向样品加入根据权利要求1-3中任一项的肽或者根据权利要求8的融合蛋白；和(b)检查所述肽或融合蛋白与免疫球蛋白的复合物。
22.—种供用于根据权利要求21的方法的试剂盒，所述试剂盒包含能够结合免疫球蛋 白的肽或者含有该肽的融合蛋白。
23.一种用于治疗或预防由Clq和免疫球蛋白之间的结合引起的疾病的药物组合物， 所述药物组合物包含根据权利要求1-3中任一项的肽或者根据权利要求8的融合蛋白。
24.根据权利要求23的药物组合物，其中所述疾病是类风湿性关节炎。
25.根据权利要求23的药物组合物，其中所述疾病是免疫复合物疾病，如系统性红斑 狼疮(SLE)、血管球性肾炎、血管炎或关节炎。
26.根据权利要求1-3中任一项的肽或者根据权利要求8的融合蛋白，其是经标记的。
27.一种用于检测样品中的抗体的方法，所述方法包括使根据权利要求26的经标记的 肽或融合蛋白与样品中的抗体反应，然后检测与抗体结合的所述肽或所述融合蛋白。
全文摘要
本发明公开了能够结合免疫球蛋白的肽；该肽的融合蛋白；分别编码该肽和该融合蛋白的核酸；分别产生该肽和该融合蛋白的方法；用于结合免疫球蛋白的组合物和用具；用于治疗或预防由C1q和免疫球蛋白之间的结合引起的疾病的药物组合物，其包含能够结合免疫球蛋白的肽或该肽的融合蛋白；及其他。
文档编号C12N1/19GK101848926SQ200880112469
公开日2010年9月29日 申请日期2008年8月20日 优先权日2007年8月21日
发明者柴肇一, 真崎修, 越智隆弘 申请人:越智隆弘;露珍细胞再生株式会社;株式会社Mmt