专利名称：乙型肝炎病毒多聚酶蛋白ymdd功能区的抑制肽及应用的制作方法
技术领域：
本发明属生物技术的分子生物学和生物化学等领域，涉及从噬菌体肽库中筛选到的乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽，可抑制乙型肝炎病毒复制，适用于抗乙型肝炎病毒药物的研究以及乙型肝炎病毒的分子病毒学研究。
背景技术：
慢性乙型病毒性肝炎是由乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)引起的，严重危害人类健康的常见病，慢性乙型肝炎的防治是一个全球性公共卫生问题，已引起世界各国的关注。开发切实有效的抗乙型肝炎病毒的治疗药物，是当前亟待解决的重大课题。
在HBV复制周期中，肝细胞核中的HBV共价闭合环状DNA(cccDNA)分子是HBV mRNA和前基因组RNA的合成模板，它是HBV持续感染的主要因素，因此抑制HBV cccDNA的合成是根治乙型肝炎的关键所在。乙型肝炎不能彻底治愈的根本原因在于目前所用的抗病毒药物无法抑制肝细胞核内HBV cccDNA的合成。HBV逆转录酶抑制剂能阻断大部分新的HBV DNA合成，但对核内多达50或更多拷贝的cccDNA池影响甚微。这也是目前临床使用的拉米呋啶(Lamivudine，3TC)等核苷类似物不能根治乙型肝炎的原因。并且，已经发现部分病人在使用拉米呋啶治疗后出现了病毒多聚酶P蛋白YMDD的功能区出现变异，导致病毒对拉米呋啶耐药。因此，有必要开发能抑制HBV cccDNA，且能与拉米呋啶作用互补的药物。
大多数开发成功或正在开发的直接作用于病毒的药物为核苷类似物，其抑制多聚酶功能的机制为竞争性抑制作用。根据竞争性抑制作用的原理，作用的药物必须有较高浓度才起作用。理想的抑酶药物应该是能与酶促反应中间产物结合，产生反竞争性抑制作用或非竞争性抑制作用。抑制肽与靶蛋白(多聚酶)的结合，并非酶与底物的关系，而是类似抗原抗体反应的分子间作用力。亲合力高的抑制肽有可能达到这种效果。
应用噬菌体展示技术筛选抑制肽，是将外源蛋白或多肽与噬菌体外壳蛋白融合，展示在噬菌体表面并保持特定的空间构象，利用特异性亲和作用以筛选与靶分子特异性结合的多肽的一项新技术。它将基因型与表型、分子结合活性与噬菌体的可扩增性结合在一起，是一种高效的筛选技术。将待选基因插入噬菌体信号肽序列与主要衣壳蛋白基因之间，每一个噬菌体只含有一个外源基因，即每一个噬菌体只表达一种外源肽或蛋白，且呈现在噬菌体表面，而且不影响噬菌体的完整性。利用展示的多肽与目的蛋白(主要是抗体、抗原及一些细胞生长因子受体等)或其他生物大分子亲和的性质可高效率的筛选出特异多肽。噬菌体展示的有特异性结合力的多肽可以用固定的配体从肽库中筛选出来，筛选出来的多肽的序列可以从被包裹着的DNA序列推论出。
发明内容
本发明是利用噬菌体表面展示技术，筛选到与乙肝病毒多聚酶(P蛋白)的YMDD功能区能特异性结合的抑制肽，用于抑制HBV复制。该抑制肽适用于抗HBV药物的研制以及HBV的分子病毒学研究。
上述抑制肽有三种，三种抑制肽的氨基酸序列分别为SEQ NO 1Trp Try Thr Asn Asn Ser ThrSEQ NO 2Gly Pro Phe Asn Asn Pro ProSEQ NO 3Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp本发明抑制肽的筛选方法为用乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的短肽作为靶位，利用噬菌体表面展示技术筛选与所述靶位特异性结合的肽，即为本发明的抑制肽。乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区短肽的氨基酸序列为SEQ NO 4Arg Arg Ala Phe Pro HisCys Leu Ala Phe Ser Try Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala。
本发明的三种抑制肽可应用于抗HBV药物的制备。
本发明抑制肽的筛选方法具体包含以下的步骤1、HBV多聚酶YMDD功能区活性位点短肽的合成，合成的序列为RRAFPHCLAFSYMDDVVLGA。
2、噬菌体肽库筛选、滴度的测定、噬斑的扩增噬菌体多肽库筛选的方法，参见实施例一。
3、模板序列测定方法参见实施例一。根据提供的载体信息，三种抑制肽核苷酸序列测定的结果分别为AGTCGAATTATTCGTATACCA，AGGCGGATTATTAAAAGGACC，ATCAGGAGGAGGCAACCAACC，其反向互补序列是多肽的编码序列，推出该抑制肽的氨基酸序列为SEQ NO 1Trp Try Thr Asn Asn Ser ThrSEQ NO 2Gly Pro Phe Asn Asn Pro ProSEQ NO 3Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp4、抑制肽抑制HBV多聚酶复制的生物学功能测定方法参见实施例二。
具体实施例方式
本发明结合实施例作进一步说明。
实施例一 乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽的筛选
(一)乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区短肽的合成根据HBV ayw基因型序列设计(genbank access noU95551)，在杭州中肽生化有限公司合成短肽，序列为Arg Arg Ala PhePro His Cys Leu Ala Phe Ser Try Met Asp Asp Val Val Leu Gly Ala。短肽的纯度＞85％，溶解度＞0.5mg/ml。
(二)噬菌体肽库筛选1.第一天1.1.以0.1M NaHCO3(PH 8.6)制备的靶分子溶液乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区短肽配成150μg/ml的溶液，先以DMSO助溶，再加0.1M NaHCO3(PH 8.6)溶解。
1.2.包被在每孔内加入150μl靶分子溶液，重复涡旋直至表面完全湿润。在湿盒中，4℃温和振荡孵育过夜。4℃保存于湿盒中备用。
2.第二天2.1.将ER2537接种至10ml LB培养基中。如果是在同一天扩增洗脱的噬菌体，也可以将ER2537过夜培养物接种于含有20ml LB培养基的250ml锥形瓶中(比例为1∶100)。37℃剧烈振摇4.5~5hrs(至A600值约0.5)。
2.2.将平皿反扣在洁净的纸巾上，去除包被液，加满封闭液，4℃孵育至少1hr。
2.3.去除包被液。用TBST(TBS+0.1％Tween-20)快速洗涤6次。反复旋转确保孔底及孔侧面都被洗涤。每次更换纸巾，以避免交叉污染。
2.4.用100μl TBST稀释2×1010噬菌体(10μl原库)，加至包被后的平皿内，室温下轻缓摇动10-60min。
2.5.以步骤2.3的方法去除未结合的噬菌体。
2.6.以步骤2.4的方法用TBST洗涤板子10次，每次换用洁净的纸巾，避免交叉污染。
2.7.用1ml的洗脱缓冲液洗脱结合的噬菌体。洗脱液可以是含有配体(0.1-1mM)的TBS，或是含有靶蛋白(100μg/ml)的TBS以和固化在平皿上的靶蛋白竞争结合噬菌体。室温下轻缓摇动10-60min。将洗脱液转入微量离心管中。
2.8.使用通用缓冲液(酸洗脱液)100ul
。轻缓摇动不超过10min，将洗脱液转入微量离心管中，以150μl 1M Tris-HCl(PH 9.1)中和。
2.9.取小量洗脱液(1μl)测定滴度。可将第一轮或第二轮测定滴度的噬斑进行测序(见后续操作)。(未用的洗脱物可4℃保存过夜，第二天进行扩增。在这种情况下，用LB过夜培养ER2537，第二天，用LB培养基以1∶100将该培养物稀释至20ml，加入未扩增的洗脱液，在250ml的锥形瓶内，37℃剧烈振摇孵育4.5hrs，进入步骤2.11)。
2.10.将剩余的洗脱物进行扩增将洗脱物加入20ml ER2537培养物中(对数早期)，37℃剧烈振摇孵育4.5hrs。
2.11.将培养物转入50ml离心管中，4℃，10000转离心10min，将上清转入新的离心管中，再次离心。
2.12.将80％的上清转入新的离心管中，加入1/6体积的PEG/NaCl。4℃沉淀噬菌体至少60min或过夜。
3.第三天3.1.4℃，10000转离心PEG的沉淀物15min，倾去上清，再次离心，吸去多余的上清。
3.2.用1ml TBS悬浮沉淀物并转入微量离心管中，4℃离心5min使残留的细胞沉淀。
3.3.将上清转入新的离心管中，用1/6体积的PEG/NaCl再次进行沉淀，冰上孵育15-60min。4℃离心10min，弃上清，再次短暂离心，用微量枪头吸去残留的上清。
3.4.用200μl TBS，0.02％NaN3悬浮沉淀物，离心1min，将上清转入新管中，即为扩增的洗脱液。
3.5.测定洗脱物在扩增后的浓度，贮存于4℃。
3.6.包被平皿进行第二轮筛选，同步骤1-3。
4.第四天和第五天4.1.计数蓝色噬斑，确定噬菌体的滴度，计算对应于1×1011-2×1011pfu的噬菌体体积。如果滴度太低，在筛选时可采用对应于109pfu的噬菌体体积。
4.2.进行第二轮筛选重复步骤2.2-3.4，用含1×1011-2×1011pfu噬菌体的第一轮扩增洗脱液进行筛选，将洗涤液中的Tween 20浓度增至0.5％。
4.3.测定第二轮筛选扩增洗脱液的滴度。
4.4.包被平皿进行第三轮筛选，步骤1.1-2.1。
5.第六天5.1.进行第三轮筛选用第二轮扩增洗脱液中1×1011-2×1011pfu噬菌体进行筛选，洗涤时，Tween 20的浓度仍为0.5％。
5.2.测定未扩增的第三轮洗脱液的滴度。如果不进行第四轮筛选则不必扩增第三轮的筛选洗脱物。滴度测定时的蓝色噬斑可用于测序平板的孵育时间不长于18hrs。将剩余得洗脱物保存于4℃。
5.3.选取单克隆ER2537过夜培养。
(三)噬菌体滴度的测定1.在5-10ml LB培养基中接种单个ER2537克隆，振摇孵育直至对数生长中期(OD600＝0.5)。
2.在细胞生长时，微波融化顶层琼脂糖凝胶，分装至无菌培养管内，每管3ml。维持在45℃备用。
3.37℃预热LB/IPTG/Xgal培养板，备用。
4.以LB培养基10倍比稀释噬菌体。
5.稀释范围对扩增的噬菌体培养上清，108-1011；对未扩增的筛选洗脱液，101-104。每次稀释都换用新的加样枪头。
6.一旦ER2537培养物长至对数生长中期，分装至微量离心管中，每管200μl。
7.将倍比稀释的噬菌体上清加入含细菌培养物的微量离心管中，一支微量离心管中仅加入一种稀释液10μl，快速涡旋，室温孵育1-5min。
8.转移至含有45℃顶层琼脂糖凝胶的管中，快速涡旋混匀，立即倾倒至预热的LB/IPTG/Xgal平板上，轻缓摇动平板使顶层胶均匀分布。
9.冷却平板5min，37℃倒置培养过夜。
10.噬斑计数以噬斑数为100左右的平皿为准，噬斑数乘以稀释度即可获得每10μl噬菌体的滴度-噬斑形成单位(pfu)。
(四)噬斑的扩增1.以LB培养基稀释ER2537过夜培养物。1ml分装至培养管，每管中接种一个克隆。
2.使用消毒牙签或枪头，穿刺噬斑，接种至上述培养管中。
3.37℃振摇孵育4.5-5hrs(不能过长)。
4.测定单个克隆的序列。取10μl未扩增的洗脱物加至1ml宿主菌稀释液中37℃振摇孵育4.5-5hrs。
5.将培养物转至微量离心管，离心30sec，取上清转入新的离心管中再次离心，取上部约80％的上清转至新的离心管。这是扩增的噬菌体贮存液，能4℃保存。
(五)测序模板的快速纯化1.扩增噬斑，在第一次离心后，将500μl含有噬菌体的上清转入新的离心管中。
2.加入200μl PEG/NaCl，颠倒混匀，室温静置10min。
3.离心10min，倾去上清。
4.再次短暂离心，仔细吸去残留上清。
5.用100μl碘化物缓冲液完全重悬沉淀物，加入250μl乙醇。室温孵育10min，室温短暂孵育将选择性沉淀单链噬菌体DNA，而大部分噬菌体蛋白保留在溶液中。
6.离心10min，倾去上清，用70％乙醇洗涤沉淀物，真空吸干。
7.用30μl TE缓冲液重悬沉淀物。
8.取5μl作为测序模板，送出测序。
(六)测序结果共挑取30个克隆进行测序。其中，有3种克隆的序列重复出现，该3条序列进一步进行抑制病毒复制的研究。另外的序列未出现重复，不作进一步研究。根据提供的载体信息，序列测定的结果分别为AGTCGAATTATTCGTATACCA，AGGCGGATTATTAAAAGGACC，ATCAGGAGGAGGCAACCAACC，其反向互补序列是多肽的编码序列，推出该抑制肽的氨基酸序列并命名为SEQ NO 1Trp Try Thr Asn Asn SerThr(HBV YMDD功能区抑制肽1号)，SEQ NO 2Gly ProPhe Asn Asn Pro Pro(HBV YMDD功能区抑制肽2号)，SEQ NO 3Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp(HBVYMDD功能区抑制肽3号)。
实施例二 抑制肽对乙型肝炎病毒抑制作用的实验(一)细胞培养1、2.2.15细胞的培养 2.2.15细胞为转染HBV全基因的肝癌细胞株，含有完整HBV基因的多倍体，能转录、翻译HBV基因并产生和分泌HbsAg、HbeAg、HBV DNA和HBV颗粒。以RPMI1640培养基、10％新生小牛血清、400mg/L G418加压培养。2.2.15细胞按2×106/平皿接种于60mm细胞培养平皿。实验组为合成的多肽(Trp Try Thr Asn Asn Ser Thr(HBV YMDD功能区抑制肽1#)，Gly Pro Phe Asn Asn Pro Pro(HBV YMDD功能区抑制肽2#)，Gly Trp Leu Pro ProPro Asp(HBV YMDD功能区抑制肽3#)，由杭州中肽生化有限公司合成)，每平皿加30μl抑制肽溶液。拉米夫定对照组每平皿加3μl拉米夫定储存液。所设的阴性对照组，加入30μl PBS。37℃，5％CO2细胞培养箱培养。抑制肽及对照组均设三个复孔。
2、第10天收集细胞上清后，细胞用PBS洗涤2次，用0.25％胰蛋白酶消化，4℃1500g离心5min。PBS洗涤2次。稀释后计数每个平皿的细胞总数。
(二)抑制肽对HBsAg和HBeAg表达抑制效应的测定1、HBsAg和HBeAg测定 放射免疫分析法(radioimmunoassay，RIA)。所用试剂为山东潍坊3V诊断技术公司生产的HBsAg定量放射免疫分析试剂盒和HBeAg定量放射免疫分析试剂盒。
2、抑制肽对HBsAg和HBeAg表达的抑制率，按下列方式计算抑制率＝(实验孔X--对照孔X)/(对照孔X-2.1)×100％(X为HBsAg和HBeAg的RIA S/N值)。计算后的抑制率见表1。
表1 各组对HBsAg和HBeAg表达抑制率
(三)荧光定量PCR检测HBV DNA1、模板处理取细胞培养上清50μl，加50μl病毒提取A液，4℃12000r/min离心10min，弃上清，沉淀加病毒提取B液25μl，100℃煮沸5min，4℃12000r/min离心10min，取上清置-20℃备用。
2、PCR反应抽提好的HBV DNA模板4.0μl，依次加入36.0μl SYBR GREEN I荧光染料、Taq酶、dNTP、Buffer混和物，混匀，在荧光定量PCR仪上扩增。PCR反应程序为95℃预变性5min后按下列程序进行40个循环94℃变性15Sec，56℃退火30Sec，72℃延伸45Sec。采用Single检测，在每一循环后检测DNA量，未次循环后由计算机计算出DNA含量。所用试剂为深圳匹基生物工程股份有限公司生产的HBV核酸扩增荧光定量检测试剂盒，荧光定量PCR仪为Roche Light Cycler。
3、抑制率分析根据各组的HBV DNA的定量值，计算抑制肽对HBV DNA的抑制率，计算公式如下抑制率＝(阴性对照测定值-样品测定值)/阴性对照测定值表2 各组对HBV DNA的抑制率
(四)细胞毒性试验 以0.5％台盼蓝作细胞染色计数观察着色活细胞比例，同时观察培养过程中细胞生长情况。结果表明，实验组、阳性对照组和阴性对照组细胞生长状况无明显差异。
上述实验证明了本发明所筛选的三种对乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD的抑制肽对HBV的DNA有明显的抑制作用。由于其来源于对YMDD功能区靶位特异性结合的噬菌体展示技术，作用机理为抑制HBV复制，为抗HBV药物的制备提供了一种新的有效的源材料。相对现有的作用于阻断HBV DNA合成的核苷酸类药物，本发明的抑制肽从根本上抑制HBV的复制，与现有的拉米呋啶类药物有互补作用。
权利要求
1.乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用，其特征在于所述抑制肽有三种，三种抑制肽的氨基酸序列分别为SEQ NO 1Trp Try Thr Asn Asn Ser ThrSEQ NO 2Gly Pro Phe Asn Asn Pro ProSEQ NO 3Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp
2.按权利要求1所述乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用，其特征在于所述抑制肽的筛选方法为用乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的短肽作为靶位，利用噬菌体表面展示技术筛选与所述靶位特异性结合的肽，即为抑制肽。
3.按权利要求2所述乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用，其特征在于YMDD功能区短肽的氨基酸序列为SEQ NO 4Arg Arg Ala Phe Pro His Cys Leu Ala Phe Ser TryMet Asp Asp Val Val Leu Gly Ala。
4.按权利要求1所述乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用，其特征在于所述三种抑制肽应用于抗HBV药物的制备。
全文摘要
乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的抑制肽及应用属于生物技术的分子生物学和生物化学领域。用乙型肝炎病毒多聚酶蛋白YMDD功能区的短肽作为靶位，利用噬菌体表面展示技术筛选与所述靶位特异性结合的肽，本发明筛选的三种抑制肽其氨基酸序列分别为TrpTry Thr Asn Asn Ser Thr；Gly Pro Phe Asn Asn Pro Pro；Gly Trp Leu Pro Pro Pro Asp。实验证明了本发明所筛选的三种抑制肽对HBV的DNA有明显的抑制作用，为抗HBV药物的制备提供了一种新的有效的药源。相对现有的作用于阻断HBV DNA合成的核苷酸类药物，本发明的抑制肽从根本上抑制HBV的复制，与现有的拉米呋啶类药物有互补作用，适用于抗HBV药物的研制以及HBV的分子病毒学研究。
文档编号A61P31/00GK1786020SQ20051006193
公开日2006年6月14日 申请日期2005年12月12日 优先权日2005年12月12日
发明者朱海红, 周林福, 贾红宇, 陈智 申请人:浙江大学