专利名称：卵黄免疫球蛋白的提取方法
技术领域：
本发明涉及一种卵黄免疫球蛋白的提取方法。
技术背景禽类(如母鸡)接受特定抗原的免疫后，在卵黄成熟期，血液中的免疫球蛋白IgG选择性地转移到卵黄中，形成卵黄免疫球蛋白，通常称为IgY。 IgY分子 量约为180kD，具有一些不同于哺乳动物IgG的生物学特性，比如IgY对哺乳动物 的补体成分无固定作用，也不与Fc受体结合，更突出的是IgY不与血清中的类风 湿因子反应，这在许多免疫学检测中可有效地避免由补体成分引起的假阴性结 果，以及由类风湿因子引起的假阳性结果，有利于提高免疫检测诊断的准确率。 另外，IgY具有耐热、耐酸、价廉易得、稳定性好、可口服等优点，可代替哺乳 动物来源的抗体，在免疫治疗剂、食品添加剂、疾病防治等方面均有广泛的用 途禽类蛋(如鸡蛋)提供了廉价易得的IgY来源，产量高， 一枚鸡蛋中约含有 100 250mg的IgY。如何将大量的卵黄免疫球蛋白高效地提取出来，是决定IgY 能否获得广泛应用的前提。鸡卵黄中约含有脂肪30.5%、蛋白质17.8%和水48%。 分离的第一步一般需要除去高浓度的脂类物质，得到水溶性组份(WSF)，最常 用的方法是水稀释抽提法。在纯化阶段，常采用盐析与离子交换结合、疏水层 析与凝胶过滤结合等方法，然而分离效果均不好，不适于大规模的生产。近年来发展了一种新型的层析技术——混合模式吸附层析，功能配基同时 含有疏水基团和离子交换基团，兼具疏水作用和静电相互作用，可以通过静电 相吸来强化吸附或静电排斥来协助解吸。另外，配基密度通常比较高，吸附容 量大，且具有典型的耐盐吸附特性，特别适合于大规模的分离纯化。本发明选 用了Pall Biosepara公司开发的商业化的混合模式吸附介质MEP HyperCel，进行 IgY的分离和纯化。本发明将混合模式吸附层析与盐析分离相结合，用MEPHyperCel混合模式 吸附直接处理卵黄稀释液盐析沉淀的溶解液，充分利用混合模式吸附的高吸附 容量、抗体选择性和耐盐吸附的特性，建立起一个卵黄免疫球蛋白的经济高效 分离方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种卵黄免疫球蛋白的提取方法。 包括如下步骤1) 水稀释法去除脂类物质将卵黄用水稀释6 8倍，混匀，保持搅拌，用0.1MHCl和0.1MNaOH溶 液调节卵黄稀释液pH到5.0 5.5，置于4°C过夜，用离心机以8000 10000rpm转速离心25 30分钟，去除沉淀，得到含有卵黄免疫球蛋白的卵黄稀释液；2) 无机盐沉淀法粗提卵黄免疫球蛋白将饱和无机盐溶液缓缓倒入步骤l)得到的卵黄稀释液，保持搅拌，直至溶 液中无机盐饱和度达到40 50%，溶液置于4°C静置2 3小时，使用离心机以 8000 10000rpm转速离心25 30分钟，收集沉淀，得到卵黄免疫球蛋白粗品；3) 混合模式吸附层析纯化卵黄免疫球蛋白将步骤2)得到的卵黄免疫球蛋白粗品用平衡缓冲液溶解，0.2pm滤膜过滤 后，上样到填充有MEPHyperCel的层析柱，平衡缓冲液冲洗，用洗脱缓冲液进 行洗脱，收集洗脱峰，得到卵黄免疫球蛋白溶液；4) 脱盐和干燥将步骤3)得到的卵黄免疫球蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到95.6 99.8% 高纯度的卵黄免疫球蛋白。所述的卵黄来自新鲜的禽类蛋。无机盐为硫酸铵或硫酸钠。平衡缓冲液为 Tris-HCl缓冲液，pH值为8.5~8.9。洗脱液为柠檬酸钠缓冲液，pH值为4.2 4.4。本发明将混合模式吸附层析用于卵黄抗体的分离纯化。与盐析分离相结合， 用MEPHyperCd混合模式吸附直接处理卵黄稀释液盐析沉淀的再溶解液，充分 利用混合模式吸附的高吸附容量提高过程的处理量，抗体的高选择性提高分离 的效率，以及耐盐吸附的特性简化分离步骤，得到一个经济高效的卵黄免疫球 蛋白提取方法。本发明的优点在于1)工艺简单，易于放大，成本较低廉；2) 过程处理量大，分离效率高；3)所得卵黄免疫球蛋白的纯度高。
图1是本发明MEPHyperCd混合模式吸附层析纯化卵黄免疫球蛋白的电泳图谱。
具体实施方式
本发明提供一种卵黄免疫球蛋白的提取方法。将卵黄用水稀释得到含有卵 黄免疫球蛋白的上清液，用无机盐沉淀得到卵黄免疫球蛋白沉淀，将沉淀重新 溶解，进一步使用混合模式吸附层析进行分离纯化，得到高纯度的卵黄免疫球 蛋白。通过本发明法分离得到的卵黄免疫球蛋白纯度为95.6 99.8%。 卵黄免疫球蛋白的提取方法包括如下步骤-1) 水稀释法去除脂类物质将卵黄用水稀释6 8倍，混匀，保持搅拌，用0.1MHCl和0.1MNaOH溶 液调节卵黄稀释液pH到5.0 5.5，置于4T过夜，用离心机以8000 10000rpm 转速离心25 30分钟，去除沉淀，得到含有卵黄免疫球蛋白的卵黄稀释液；卵 黄为新鲜的禽类蛋。2) 无机盐沉淀法粗提卵黄免疫球蛋白将饱和无机盐溶液缓缓倒入步骤l)得到的卵黄稀释液，保持搅拌，直至溶 液中无机盐饱和度达到40 50%，溶液置于4。C静置2 3小时，使用离心机以 8000 10000rpm转速离心25 30分钟，收集沉淀，得到卵黄免疫球蛋白粗品； 无机盐为硫酸铵或硫酸钠。3) 混合模式吸附层析纯化卵黄免疫球蛋白将步骤2)得到的卵黄免疫球蛋白粗品用平衡缓冲液溶解，0.2^滤膜过滤 后，上样到填充有MEPHyperCd的层析柱，平衡缓冲液冲洗，用洗脱缓冲液进 行洗脱，收集洗脱峰，得到卵黄免疫球蛋白溶液；层析所用的平衡缓冲液为 Tris-HCl缓冲液，pH值为8.5~8.9,洗脱液为柠檬酸钠缓冲液，pH值为4.2 4.4。4) 脱盐和干燥将步骤3)得到的卵黄免疫球蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到95.6 99.8%高纯度的卵黄免疫球蛋白。以下通过实施例对本发明作进一步的描述 实施例1取新鲜鸡蛋一只，分离得到卵黄，用蒸馏水冲洗卵黄1~2次。用滤纸上吸 干卵黄表面的水分，剌破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄85ml用蒸馏水 稀释6倍，用0.1M的HC1溶液和0.1M的NaOH溶液调节pH至5.2，放入4 "C冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体8000rpm离心30分钟，去除沉淀，得 到上清液。将420ml上清液用40%饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4°C静置2小时， 8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀6.5g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9) 溶解至20ml， 0.2pm滤膜过滤，取2ml作为进样样品。层析柱(内径lcm)中 填充5mlMEPHyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，洗脱 液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到 卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为99.8%。 取新鲜鸡蛋一只，分离得到卵黄，用蒸馏水冲洗卵黄1~2次。用滤纸上吸干卵黄表面的水分，刺破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄72ml用蒸馏水 稀释6倍，用0.1M的HC1溶液和0.1M的NaOH溶液调节pH至5.2，放入4 。C冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体10000rpm离心30分钟，去除沉淀， 得到上清液。将400ml上清液用40。/。饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4。C静置2小 时，8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀5.6g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)溶解至20ml， 0.2lam滤膜过滤，取2ml作为进样样品。层析柱(内径1 cm) 中填充5ml MEPHyPerCel,平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.5)，洗 脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得 到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为95.6%。 实施例3取新鲜鸡蛋一只，分离得到卵黄，用蒸馏水冲洗卵黄1~2次。用滤纸上吸 干卵黄表面的水分，刺破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄90ml用蒸馏水 稀释8倍，用0.1M的HC1溶液和0.1M的NaOH溶液调节pH至5.5，放入4 "C冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体10000rpm离心25分钟，去除沉淀， 得到上清液。将650ml上清液用50%饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4 °C静置3小 时，10000rpm离心25分钟分离得到湿沉淀7.1g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)溶解至25ml， 0.2pm滤膜过滤，取10ml作为进样样品。层析柱(内径1.6 cm)中填充10ml MEP HyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.9)， 洗脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥， 得到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为96.2%。取新鲜鸡蛋一只，分离得到卵黄，用蒸馏水冲洗卵黄1~2次。用滤纸上吸 干卵黄表面的水分，剌破卵黄膜，使卵黄流出。将收集到的卵黄96ml用蒸馏水 稀释6倍，用O.IM的HCl溶液和O.IM的NaOH溶液调节pH至5.0，放入4 'C冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体8000rpm离心30分钟，去除沉淀，得 到上清液。将460ml上清液用40%饱和硫酸铵沉淀，溶液置于4°C静置2小时， 8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀7.4g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9) 溶解至25ml， 0.2(im滤膜过滤，取2ml作为进样样品。层析柱(内径lcm)中 填充5mlMEPHyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl缓冲液(pH 8.9)，洗脱 液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.4)，收集洗脱组分，脱盐，冷冻干燥，得到 卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为96.8%。 实施例5取卵黄500ml用蒸馏水稀释6倍，用0.1M的HC1溶液和0.1M的NaOH溶 液调节pH至5.2，放入4X:冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体8000rpm离 心30分钟，去除沉淀，得到上清液。将2200ml上清液用40y。饱和硫酸铵沉淀， 溶液置于4°C静置2小时，8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀38.5g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)溶解至125ml, 0.2pm滤膜过滤，作为进样样品。层 析柱(内径5 cm)中填充125ml MEP HyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl 缓冲液(pH8.9)，洗脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2),收集洗脱组分， 脱盐，冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为 99.5%。 实施例6取卵黄800ml用蒸馏水稀释6倍，用0.1M的HC1溶液和0.1M的NaOH溶 液调节pH至5.2，放入4"C冰箱，静置过夜。次日将卵黄稀释液体8000rpm离 心30分钟，去除沉淀，得到上清液。将3800ml上清液用40。/。饱和硫酸铵沉淀， 溶液置于4°C静置2小时，8000rpm离心30分钟分离得到湿沉淀60.4g，用50mM Tris-HCl缓冲液(pH 8.9)溶解至200ml， 0.2pm滤膜过滤，作为进样样品。层 析柱(内径5 cm)中填充200ml MEP HyPerCel，平衡缓冲液为50mM tris-HCl 缓冲液(pH8.9)，洗脱液为20mM柠檬酸钠缓冲液(pH4.2)，收集洗脱组分， 脱盐，冷冻干燥，得到卵黄免疫球蛋白，电泳分析卵黄免疫球蛋白的纯度为 99.3%。
权利要求
1.一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于包括如下步骤1)水稀释法去除脂类物质将卵黄用水稀释6～8倍，混匀，保持搅拌，用0.1M HCl和0.1M NaOH溶液调节卵黄稀释液pH到5.0～5.5，置于4℃过夜，用离心机以8000～10000rpm转速离心25～30分钟，去除沉淀，得到含有卵黄免疫球蛋白的卵黄稀释液；2)无机盐沉淀法粗提卵黄免疫球蛋白将饱和无机盐溶液缓缓倒入步骤1)得到的卵黄稀释液，保持搅拌，直至溶液中无机盐饱和度达到40～50％，溶液置于4℃静置2～3小时，使用离心机以8000～10000rpm转速离心25～30分钟，收集沉淀，得到卵黄免疫球蛋白粗品；3)混合模式吸附层析纯化卵黄免疫球蛋白将步骤2)得到的卵黄免疫球蛋白粗品用平衡缓冲液溶解，0.2μm滤膜过滤后，上样到填充有MEP HyperCel的层析柱，平衡缓冲液冲洗，用洗脱缓冲液进行洗脱，收集洗脱峰，得到卵黄免疫球蛋白溶液；4)脱盐和干燥将步骤3)得到的卵黄免疫球蛋白溶液脱盐，冷冻干燥，得到95.6～99.8％高纯度的卵黄免疫球蛋白。
2. 根据权利要求l所述的一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于所 述的卵黄来自新鲜的禽类蛋。
3. 根据权利要求l所述的一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于所 述的无机盐为硫酸铵或硫酸钠。
4. 根据权利要求l所述的一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于所 述的平衡缓冲液为Tris-HCl缓冲液，pH值为8.5~8.9。
5. 根据权利要求l所述的一种卵黄免疫球蛋白的提取方法，其特征在于所 述的洗脱液为柠檬酸钠缓冲液，pH值为4.2 4.4。
全文摘要
本发明公开了一种卵黄免疫球蛋白的提取方法。具体步骤如下1)水稀释，将卵黄用水稀释后过夜，去除沉淀，取上清液。2)无机盐沉淀，将上清液用饱和硫酸铵沉淀，离心分离，取沉淀。3)柱层析，将沉淀重新溶解，用填充MEPHyperCel的层析柱进行分离，收集洗脱峰。4)脱盐和干燥，收集液脱盐后，冷冻干燥，得到纯度大于95％的卵黄免疫球蛋白。本发明所开发的卵黄免疫球蛋白提取方法的关键步骤在于MEP HyperCel混合模式吸附层析，具有操作步骤简单，分离纯化因子高的优点，并且成本较低。
文档编号C07K16/02GK101125886SQ20071007023
公开日2008年2月20日 申请日期2007年7月27日 优先权日2007年7月27日
发明者何瑜芳, 夏海锋, 姚善泾, 林东强 申请人:浙江大学