用免疫球蛋白治疗粘膜炎的制作方法

用免疫球蛋白治疗粘膜炎的制作方法
【专利摘要】本发明涉及包含免疫球蛋白的组合物，所述免疫球蛋白用于由局部应用治疗粘膜炎。尤其是，本发明涉及用于治疗粘膜炎的包含含有J链的IgA和分泌组分的组合物。
【专利说明】用免疫球蛋白治疗粘膜炎 【【技术领域】】
[0001] 本发明涉及包含免疫球蛋白的组合物，所述免疫球蛋白用于由局部应用治疗粘膜 炎。尤其是，本发明涉及用于治疗粘膜炎的包含含有J链的IgA和分泌组分的组合物。 【【背景技术】】
[0002] 癌患者患各种治疗-相关的后遗症。食道粘膜炎化学治疗和放射是最致衰弱 的不利效果之一（Sonis ST(2009)Oral Oncol 45,1015-20)。疼痛，粘膜溃疡形成，及需 要肠胃外营养的食品摄取困难严重影响患者舒适性及增加局部以及系统性感染的风险 伍1^叩，1^的 &1(2003)0&11(3抓98:1531-9)。此外，粘膜炎造成随后化学治疗或放射治疗 周期延迟。其可使需要化学治疗的治疗中断或剂量减小，其可对总体存活具有有害效应。粘 膜炎也作为经济问题新出现，由于其管理需要昂贵的治疗及延长的住院。
[0003] 粘膜炎的当前标准治疗主要依赖于控制减轻疼痛程度，但不致粘膜炎中涉及的病 理机制。
[0004] 理解粘膜炎的复杂的病理生理学对于作出预防性和/或治疗性策略是关键的。当 前概念涉及5个重叠期（Sonis ST(1998)0ral Oncol 34:39-43) :(1)粘膜炎在施用细胞毒 性药物或放射期间起始。损伤在第1次可见和临床可定量的可能由DNA损伤和/或活性氧 导致的变化发生（例如粘膜红斑）之前的天开始。（2)损伤应答通路和促-炎性级联被活 化。⑶随这些信号传导通路的扩增的恶性循环，例如TNF-α释放，NF-κΒ活化，及活性 氧，其被认为增强细胞死亡和由此介导粘膜损伤。（4)可见溃疡形成发展，受粘膜表面上多 种微生物性菌群的存在负面地影响，增强促炎细胞因子释放（Ratner，AJ等人（2005)Proc Natl Acad Sci USA 102:3429-34)。口腔和消化道的共生或兼性病原体侵袭溃疡和可导致 菌血症。（5)粘膜屏障的再生会仅在毒性刺激和促炎信号减弱，及嗜中性粒细胞计数恢复了 之后发生。
[0005] 这些阶段和病理生理事件中的一些可用体外研究及在动物模型中再造。上皮细胞 暴露于放射或一般用于化学治疗的化学品（例如甲氨喋呤）是模拟抗-癌治疗对局部存在 的上皮细胞的效应和潜在侧损伤的适当的方法。此对应于口腔粘膜炎的早期/起始阶段 (上述阶段1，2和3)。可用于此的上皮细胞包括角质化的上皮细胞系（例如.底特律532) 和非-角质化的上皮细胞系（例如.H376)。类似地，上皮细胞暴露于存在于口腔小型生物 群的机会性病原体模拟口腔粘膜炎的晚期阶段（阶段3和4)，尤其由局部存在的微生物导 致的发炎永存可在该系统中研究。存在于口腔微生物群系的典型机会性病原体包括链球菌 属（Streptococcus)物种，特别缓症链球菌（S.mitis)及肺炎链球菌（S. pneumoniae)及也 在某种程度上包括莫拉菌属（Moraxella)物种，包括粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)(The Human Microbiome Project Consortium(2012)Nature 486:207-214)(Dewhirst FE(2010) J. Bacteriol 192:5002-5017)。
[0006] 此外，仓鼠，大鼠和小鼠中的各种体内模型被良好建立，常使用及也被调控机构接 受。最通常使用的模型基于暴露于放射或放射和化学治疗的组合的金色叙利亚仓鼠；已在 模型中描述预防性和治疗性干预（Watkins B(2010)Oral Dis 16:655-660)。
[0007] 在癌治疗强度和粘膜炎发展风险之间有直接关联。已在之前治疗周期中，在发展 粘膜炎的患者中观察到增加的风险。应激因素诸如焦虑也增加风险。粘膜微生物区系的性 质和程度和存在的微生物区系由癌治疗的可能的修饰也可增强炎性刺激。
[0008] 促-炎性信号的破坏和微生物负荷的减小已被鉴定为治疗和/或预防粘膜炎的 潜在靶。在多于一个比较性，随机化的试验中测试的仅7种剂被发现具有显著效应，但 观察的改善微小。含有多粘菌素，妥布霉素和两性霉素 B的口腔锭剂被发现具有有利的 效应（Stokman MA et al (2003)J Cancer 88:1012-6 ;Wijers OB et al (2001) Int J Radiot Oncol Biol Phys 50:343-52)，尽管在粘膜炎中使用局部抗微生物剂不被常规建议 (Donelly JP et al (2003)Lancet Infect Dis 3:405-12)。目前认为，微生物可不导致粘 膜炎起始，但可在随后阶段起到作用。最近，重组角质形成细胞生长因子（KFG)被显示显著 地改善粘膜炎（Blijelevens N &Sonis，S(2007)Ann Oncol 18:817-26)。
[0009] 因此，对于由癌-相关的治疗方案导致的粘膜炎的有效治疗有强需求。迫切地需 要预防和治疗食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎的新方法。
[0010] 【发明概述】
[0011] 本发明人意外地发现，食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎，可由局部施用免疫球蛋 白，尤其是IgA和/或IgM有效治疗。
[0012] 因此，本发明的一方面是包含免疫球蛋白的组合物，所述免疫球蛋白用于通过在 受试者中局部施用预防或治疗食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎。
[0013] 优选地，免疫球蛋白包含IgA和/或IgM，更优选地，免疫球蛋白包含含有J链的 IgA或含有J链的IgM或其组合。优选地，免疫球蛋白可获自血或其组分，诸如血浆或血浆 级分。更优选地，本发明的组合物也包含分泌组分。优选分泌组分是重组体分泌组分。
[0014] 在本发明的优选的方面，组合物包含分泌-样IgA。组合物也可包含与另一免疫球 蛋白组合的分泌-样IgA,优选组合IgM,优选分泌-样IgM。
[0015] 本发明的再一方面是上述组合物，其被配制以提供与受粘膜炎影响的（或处于受 影响的风险的）粘膜区的长接触时间。优选地，组合物被制成霜剂，凝胶，糖浆，胶冻剂，在 受影响的粘膜附近溶解的固体形式，或其组合。另一优选的组合物是被配制成适宜于在吞 咽或吐出之前在口中保留几分钟的液体组合物。优选地，液体制剂包含调味物质，从而味道 是舒适的。该物质可赋予水果诸如草莓，苹果，桃，蓝莓的味道；焦糖，巧克力的味道；也可 使用香味道，诸如干酪或番茄。组合物也可包含其他适合的赋形剂，例如增强免疫球蛋白的 稳定性的稳定化剂。
[0016] 本发明的仍另一方面是上述组合物，其中局部应用于粘膜减少微生物，诸如细菌 或真菌的附着和/或侵入。微生物可为粘膜表面上微生物区系的部分。
[0017] 本发明的再一方面是上述组合物，其中局部应用于粘膜促进粘膜创伤治愈。优选 地，本发明的组合物刺激上皮细胞以分泌生长因子，例如角质形成细胞生长因子。
[0018] 本发明的仍再一方面是本发明的组合物，其中局部应用于粘膜发挥抗-炎性效 应。抗-炎性效应可为：
[0019] (a)抑制促-炎性细胞因子表达；和/或
[0020] (b)刺激抗-炎性细胞因子的表达。
[0021] 本发明的另一方面是上述组合物，其中受试者是处于发展食道粘膜炎的风险，诸 如经历或即将经历化学治疗和/或放射治疗的癌患者。尤其是，处于发展粘膜炎的风险的 受试者是作为之前化学治疗和/或放射治疗法治疗的结果而发展粘膜炎的癌患者。之前化 学治疗和/或放射治疗法治疗可为在接收化学治疗和/或放射治疗之后缓解，但其中癌已 再现及显示另一系列化学治疗和/或放射治疗的患者中一系列治疗周期中治疗的早先周 期，或一系列治疗周期的治疗部分。优选地，当患者的嗜中性粒细胞计数开始降低时开始施 用组合物。优选地，治疗在患者的嗜中性粒细胞计数在正常以下的时期维持。
[0022] 本发明的组合物被施用给受试者达6次/天，优选达5次/天，更优选达4次/天， 甚至更优选达3次/天，最优选2次/天或甚至更低频度。
[0023] 在本发明的另一方面，组合物包含用于治疗粘膜炎的另外的有效剂，诸如生长因 子或防腐剂。也包括在本发明中的是包含本发明的组合物和第2活性剂的产品，其作为用 于在食道粘膜炎治疗中同时，分离或连续使用的组合的制备物。该第2活性剂可为，例如， 促进创伤治愈的剂，诸如生长因子，抗微生物剂诸如防腐剂，例如防腐漱口水，或抗-炎性 剂。
[0024] 【发明详述】
[0025] 如上所述，癌患者中的粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎，仍被认为是主要医疗问题，及 有对有效治疗的需求。本发明人现在意外地发现，食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎，可由局 部施用免疫球蛋白，尤其是IgA和/或IgM来有效治疗。
[0026] 因此，本发明的一方面是包含免疫球蛋白的组合物，所述免疫球蛋白通过在受试 者中局部施用而用于预防或治疗食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎。优选免疫球蛋白是人免 疫球蛋白。
[0027] 优选地，免疫球蛋白包含IgA或IgM或其组合，更优选地，免疫球蛋白包含含有J 链的IgA或含有J链的IgM或其组合。优选地，免疫球蛋白可获自血或其组分，诸如血浆， 冷冻的差的血浆或血浆级分。更优选地，免疫球蛋白纯化自在为纯化其他血浆蛋白，例如免 疫球蛋白G而处理血浆期间获得的侧级分。优选免疫球蛋白不获自乳或初乳。优选地，免 疫球蛋白在纯化之后未通过体外改变糖基化，例如由糖残基，例如甘露糖或唾液酸或半乳 糖的酶促添加或去除来修饰。优选地，免疫球蛋白不是纯抗-TNF抗体或就抗-TNF富集的 或纯化自用TNF- α免疫的人或动物供体的免疫球蛋白。
[0028] 在本发明的另一方面，组合物也包含分泌组分。优选分泌组分是重组体分泌组分， 优选在哺乳动物细胞系中产生的分泌组分。
[0029] 本文所用的术语"分泌组分"指称特异性结合于含有J-链的免疫球蛋白的蛋白， 及涉及或可源于或相同于多聚体免疫球蛋白受体（plgR)，优选哺乳动物plgR，更优选灵长 类动物plgR，最优选人plgR的细胞外部分。优选地，分泌组分赋予含有J-链的免疫球蛋白 增加的稳定性。分泌组分以其传统，狭义（在本文被称为"天然的分泌组分"）是多聚体免 疫球蛋白受体（PlgR)的细胞外部分，其通常在分泌期间与包含J链的二聚体或多聚体IgA 或五聚体IgM结合。含有J链的IgA/IgM在上皮细胞的基底外侧表面结合于多聚体免疫球 蛋白受体及由胞吞转运被摄入细胞。此受体复合物然后在运输到上皮细胞的腔表面之前通 过细胞隔室运输。胞吞转运的IgA/IgM-pIgR复合物然后通过蛋白水解释放，及多聚体免疫 球蛋白受体（PlgR)的部分（被称为天然的分泌组分）保持与含有J链的IgA/IgM结合，释 放分泌IgA/IgM。但是，有证据表明，IgA的反向胞吞转运（即从腔表面到基底外侧表面） 也可发生。
[0030] 人plgR被克隆及测序，其序列作为SwissProt登录号P01833可利用，及显示于 SEQ ID N0:1。人plgR是具有764个氨基酸残基的糖蛋白，其含有信号肽（残基1?18)， 细胞外部分（残基19?638)，跨膜区（残基639?661)，及细胞质区（残基662?764)。 残基19?603被认为结合于上述含有J链的IgA或含有J链的IgM，及此糖蛋白的此部分 通常被称为分泌组分（"天然的分泌组分"）。
[0031] 在本发明的组合物中使用的分泌组分可包含任何能与含有J链的IgA结合的细胞 外PlgR序列。例如，分泌组分可包含来自哺乳动物源，例如来自灵长类动物，牛，马，猫，狗， 兔，豚鼠，大鼠或小鼠的PlgR的细胞外结构域，或其变体。也涵盖来自几种哺乳动物物种的 细胞外结构域或其变体的功能杂交体以在本发明中使用，例如通过将来自不同物种的免疫 球蛋白-样结构域融合进分泌组分-样蛋白而制备的。功能分泌组分也可通过融合一系列 正常存在的免疫球蛋白-样结构域而形成，例如兔分泌组分是仅由结构域1，4和5组成的 有功能的。但是，优选使用人分泌组分或其功能变体。
[0032] 因此在本发明的组合物中使用的分泌组分优选包含SEQ ID NO: 1的残基19?603 或其功能变体。功能变体可包括缺失，插入和/或取代，优选取代是保守性取代，例如碱性 氨基酸残基用另一碱性氨基酸代替，疏水氨基酸用另一疏水氨基酸代替，等。变体分泌组分 在序列上与SEQ ID NO: 1的残基19?603具有至少50%同一性，优选与SEQ ID NO: 1的残 基19?603具有至少55%，60%，65%，70%，75%，80%，更优选至少85%或甚至90%，甚 至更优选至少92 %，94 %，95 %，97 %，98 %或甚至99 %同一性。最优选，分泌组分包含SEQ ID NO: 1的残基19?603或甚至由SEQ ID NO: 1的残基19?603组成。
[0033] 本领域技术人员熟知如何由重组技术产生分泌组分。CH0细胞中人分泌组分的表 达的一例已被 Phalipon 等人（Phalipon A 等人（2002) Immunity 17:107-115)描述，但本 发明不限于由此系统产生的分泌组分。例如，期望的cDNA序列可合成产生或使用从表达 PlgR的细胞或组织分离的RNA作为模板经RT-PCR克隆。然后可将cDNA插入哺乳动物表达 载体诸如PCDNA3-许多替代性的表达载体是可利用的及为本领域技术人员熟知。然后会将 重组表达载体导入适合的宿主细胞系，诸如CH0, Cos，HEK293或BHK。其他细胞系是可利用 的和也可使用。将该载体导入细胞系的方法包括脂转染，电穿孔和本领域技术人员熟知的 其他技术。通常然后选择及克隆带有表达载体及表达目标蛋白的细胞。也可使用病毒表达 系统，例如，痘苗病毒可用于在哺乳动物细胞中以高水平表达蛋白，杆状病毒表达系统可用 于在昆虫细胞中以高水平表达蛋白。也可采用酵母或细菌表达系统，及该表达系统已由本 领域技术人员所知。植物表达系统也可使用及已由本领域技术人员所知。
[0034] 在本发明的组合物中使用的分泌组分或其变体也可包含标签，诸如六-组氨酸标 签，其可辅助纯化得到的蛋白。如果该标签经可切割的接头附接，标签可在本发明中使用之 前切割下。类似地，分泌组分可作为融合蛋白产生。再次，可使用可切割的接头，从而融合 偶体可在本发明中使用之前自分泌组分切割下。
[0035] 本领域技术人员可然后用标准方法纯化表达的蛋白。
[0036] 分泌组分也可从天然的源，优选从乳，唾液或粘液得到。优选分泌组分具有人来 源，但来自其他物种的分泌组分也可在本发明中使用。
[0037] 组合物之中分泌组分和J链之间的摩尔比在1:10和10:1之间，优选在1:5和5:1 之间，更优选在1:2和2:1之间。
[0038] 在组合物中使用的分泌组分的量可为在组合物中1部分（以重量计）分泌组分比 至少50部分（以重量计）蛋白，优选在组合物中1部分比至少40,30,20，15，10，最优选1 部分分泌组分比至少5部分蛋白。
[0039] 在本发明的优选的方面，组合物包含分泌-样IgA。组合物也可包含与另一免疫球 蛋白组合的分泌-样IgA，优选组合IgM，优选分泌-样IgM。在另一优选的本发明的方面， 组合物也可单独包含分泌-样IgM或组合其他免疫球蛋白。
[0040] 本发明的再一方面是上述组合物，其被配制为提供与受粘膜炎影响的（或处于受 影响的风险的）粘膜区的长接触时间。"接触时间"指称组合物或其部分在受影响的粘膜表 面或处于风险的粘膜表面保持有活性的时间量。优选地，接触时间相比几分钟，更优选几小 时，甚至更优选几天更久，最优选对于发挥预防或治疗粘膜炎的生物学效应足够长。优选， 组合物制成霜剂，凝胶，糖浆，胶冻剂，在受影响的粘膜附近溶解的固体形式，或其组合。组 合物也可制成片剂，以单独或组合形式包含一种或更多适合的赋形剂诸如蔗糖，乳糖，麦芽 糊精，淀粉（例如来自玉米的），纤维素衍生物，例如羟乙基纤维素，甲基纤维素，或丙烯酸 月旨，甲基丙烯酸树脂，油（例如，橄榄油），蜂蜡或类似剂。其也可包含泡腾组分。凝胶可， 例如，使用猪明胶或基于淀粉的材料，丙二醇，PEG 40,山梨酸钾，苯甲酸钠，苯扎氯铵，蔗 糖，透明质酸钠，羟乙基纤维素或类似剂形成。糖浆可通过添加一种或更多糖，糖多元醇如 甘油或山梨糖醇，防止糖的再结晶的酸，缓冲剂，螯合剂，调味剂和香料增强剂，着色剂来形 成。胶冻剂可，例如，通过使用明胶，例如猪明胶形成。
[0041] 或者，使用液体组合物，其被配制为适宜于在吞咽或吐出之前在口中保留几分钟。 优选地，液体制剂包含调味物质，从而味道是舒适的。该物质可赋予水果诸如草莓，苹果， 桃，蓝莓的味道；焦糖，巧克力，坚果或类似味道；也可使用香味，诸如干酪或番茄。组合物 也可包含其他适合的赋形剂，例如增强免疫球蛋白的稳定性的稳定化剂，着色剂，缓冲剂物 质等。
[0042] 组合物可直接应用于口中，如果受试者处于发展口腔粘膜炎的风险，其也可以被 设计为在食道的其他部分释放的制剂经口摄取。其也可经肛门递送，及可以用于此递送形 式的适合的制剂供给。其可以控制其在食道的特定区释放的制剂递送。本领域技术人员能 如期望配制本发明的组合物而达到与粘膜期望的接触时间。
[0043] 本发明的仍另一方面是上述组合物，其中局部应用于粘膜减少微生物，诸如细菌 或真菌的附着和/或侵入。微生物可为粘膜表面上微生物区系的部分，例如口腔小型生 物群或肠小型生物群。优选地，组合物包含与微生物和/或由微生物产生的毒素结合的 免疫球蛋白。优选地，由微生物附着和/或侵入完整或损伤的粘膜表面降低至少25%，优 选至少30 %，35 %，40 %，45 %，更优选至少50 %，理想地至甚至更大程度诸如至少60 %， 70 %，80 %，90 %，例如，以阻止细胞内促-炎性下游级联的活化，其在特定微生物表面组 分（例如，PAMP，病原体关联的分子模式）与暴露的表面或细胞内PRR(模式识别受体，例 如，Toll-样受体）结合后发生。
[0044] 本发明的再一方面是上述组合物，其中局部应用于粘膜促进粘膜创伤治愈。优 选地，本发明的组合物刺激上皮细胞分泌一种或更多生长因子，例如角质形成细胞生长因 子（KGF)，或其他创伤治愈促进因子诸如上皮生长因子（EGF)，成纤维细胞生长因子（例 如.bFGF)，粒细胞-巨噬细胞集落-刺激因子（GM-CSF)，转化生长因子（例如.TGF- α或 β)，源于血小板的生长因子（PDGF)和血管内皮生长因子（VEGF)。组合物可由此刺激上皮 细胞和固有层的成纤维细胞分泌细胞外基质组分，诸如胶原，层粘连蛋白或纤连蛋白及促 进血管发生。
[0045] 优选地，刺激分泌生长因子是生物学显著的，例如生长因子的分泌被刺激达到对 靶细胞的显著效应的程度。
[0046] 本发明的仍再一方面是本发明的组合物，其中局部应用于粘膜发挥抗-炎性效 应。本发明的组合物的抗-炎性效应可还表征为：
[0047] (a)抑制促-炎性细胞因子表达；和/或
[0048] (b)刺激抗-炎性细胞因子的表达。
[0049] 优选地，粘膜中一种或更多关键促-炎性细胞因子的表达被本发明的组合物减 少，更优选地，2种或更多关键促-炎性细胞因子的表达减少，甚至更优选，3种或更多 促-炎性细胞因子的表达减少。优选地，促-炎性细胞因子选自IL-1，IL-6, IL-8, IL-17， IFN-γ，TNF-a，MCP-1，IP10。优选地，表达的减小是减小至少25%，优选至少30%，35%， 40 %，45 %，更优选至少50 %，理想地至甚至更大程度诸如至少60 %，70 %，80 %，90 %或甚 至更高。
[0050] 优选地，一种或更多关键抗-炎性细胞因子的表达被本发明的组合物刺激，更优 选地，2种或更多抗-炎性细胞因子的表达被刺激，甚至更优选，3种或更多抗-炎性细胞 因子的表达被刺激。优选地，抗-炎性细胞因子选自IL-IRa，IL-4, IL-10, IL-11，IL-13， TGF- β。优选地，表达的刺激是刺激至少2倍，更优选至少5,10,20, 50倍甚至更优选至少 100倍，最优选高于500倍或甚至更高。
[0051] 更优选地，通过本发明的组合物提供促-炎性细胞因子的表达的减小和抗-炎性 细胞因子的表达的刺激。
[0052] 本发明的另一方面是上述组合物，其中处于发展食道粘膜炎的风险的受试者是经 历或即将经历化学治疗和/或放射治疗的癌患者。尤其是，处于发展粘膜炎的风险的受试 者是作为之前化学治疗和/或放射治疗法治疗的结果而发展粘膜炎的癌患者。之前化学治 疗和/或放射治疗法治疗可为一系列治疗周期中的早先治疗周期，或在接收化学治疗和/ 或放射治疗之后缓解，但其中癌已再现及另一系列的化学治疗和/或放射治疗被指示的患 者中一系列治疗周期的治疗部分。
[0053] 本发明的组合物可预防性地或作为对有活性的，存在的粘膜炎的治疗而给出。优 选地，治疗在粘I吴炎症状发生之如起始。治疗可在开始化学治疗和/或放射治疗之如，冋时 或之后起始。优选地，在接收化学治疗的患者中，当患者变得中性粒细胞减少（即，绝对嗜 中性粒细胞计数（ANC)〈0.5X10 9/L)，从而处于发展粘膜炎的风险时开始施用组合物。优选 地，贯穿中性粒细胞减少时期持续治疗，直到ANC开始恢复或达到0. 5X 109/L和粘膜炎临 床上消退。常诱导粘膜炎的化学治疗剂包括，尤其是，甲氨蝶呤，蒽环类抗生素，5-氟尿嘧啶 和骨髓摘除化学治疗方案。优选地，在接收局部放射治疗的患者中，在治疗的整个持续时间 期间施用组合物和直到粘膜炎消退。
[0054] 本发明的组合物被施用给受试者达6次/天，优选达5次/天，更优选达4次/天， 甚至更优选达3次/天，最优选2次/天或甚至更低频度。
[0055] 在本发明的另一方面，组合物包含用于治疗粘膜炎的另外的有效剂，诸如生长因 子或防腐剂。也包括在本发明中的是产物，其包含本发明的组合物和第2活性剂作为组合 的制备物，所述第2活性剂用于在治疗食道粘膜炎中同时，分离或连续使用。该第2活性剂 可为，例如，促进创伤治愈的剂，诸如生长因子，抗微生物剂诸如防腐剂，例如防腐漱口水， 或抗-炎性剂。
[0056] 本发明会在以下非限制性例中，参照以下图例证： 【【专利附图】

【附图说明】】
[0057] 图1.用0. 5 μ g/ml的蛋白/mm凝胶槽免疫印迹分析（10 %十二烧基硫酸钠-聚 丙烯酰胺凝胶电泳），随后蛋白印迹转移和使用mAbl7C7 (特异于三聚体和单体UspAl和 UspA2)[小图A]，mAb24B5(特异于单体UspAl)[小图B]，及mAblOF3(特异于CopB)[小图 C]检测0ΜΡ。缀合了 HRP的第二山羊抗-小鼠 IgG抗体用于第一抗体检测。
[0058] 图2.用0. 4μ g/ml的蛋白/mm凝胶槽免疫印迹分析（10%十二烧基硫酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳），随后蛋白印迹转移和作为第一抗体源使用人合并的唾液（〇. 3g/l)[小 图A]，血浆IgA F4[小图B]或合并的血浆IgG ( Privigen? )[小图c]，及用于使用化 学发光可视化的适当的缀合了 HRP的第二抗体来检测抗体结合。
[0059] 图3.使用IgA F4的附着抑制测定。将MEM和MEM-PBS用作阴性对照。将补充5mg/ ml的IgA F4的035E. 1和035. 1用作阳性对照。总体p值（单因素 AN0VA)是〈0. 0001 ;* 指示显著性水平〈0.05。
[0060] 图4.使用IgA F5A的附着抑制测定。将MEM和MEM-PBS用作阴性对照。将补充 5mg/ml的IgA F5A的035E. 1和035. 1用作阳性对照。总体p值（单因素 AN0VA)是〈0· 001 ; *指示显著性水平〈0.05。
[0061] 图5.使用IgG ( Privigen? )的附着抑制测定。将ΜΕΜ,ΜΕΜ-脯氨酸和MEM-PBS 用作阴性对照。将补充l〇mg/ml的IgG的035E. 1和035E. 1用作阳性对照。总体p值（单 因素 AN0VA)是0.009 ;柱间差异未达到统计学意义。
[0062] 图6.使用IgM F5A的附着抑制测定。将MEM和MEM-PBS用作阴性对照。将补充 5mg/ml的IgM F5A的035E. 1和035. 1用作阳性对照。总体p值（单因素 AN0VA)是〈0· 001 ; *指示显著性水平〈0.05。
[0063] 图7.展示10mg/ml浓度的IgA F4显著地抑制细菌穿透上皮细胞的粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis)侵入测定。总体p值（单因素 AN0VA)是0. 014 指示显著性水平〈0. 05。 无法利用显示细胞侵入的完全抑制的可靠的对照。
[0064] 图8.展示10mg/ml浓度的合并的人血浆IgG ( Privigen? )显著地抑制细菌 穿透上皮细胞的粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)侵入测定。总体p值（单因素 AN0VA)是 0. 015 ;*指示显著性水平〈0. 05。无法利用显示细胞侵入的完全抑制的可靠的对照。
[0065] 图9.展示5和2. 5mg/ml浓度的IgM F5A显著地抑制细菌穿透上皮细胞的粘膜炎 莫拉菌（M. catarrhalis)侵入测定。总体p值（单因素 AN0VA)是〈0· 0001 ;*指不显著性 水平〈0. 05。无法利用显示细胞侵入的完全抑制的可靠的对照。
[0066] 图10.通过使用用粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)外膜蛋白（0ΜΡ)刺激的底特律 562细胞评定IgA F4的抗-炎性活性。在0ΜΡ刺激时，将增加的浓度的IgA应用于细胞。 在刺激起始时（t = 〇)和24h后（t = 24)，使用多重悬浮液阵列（Luminex technology)测 量由底特律562细胞分泌MCP-1 (A)，IL-8 (B)和IL-6 (C)。阴性对照是未添加0ΜΡ的样品。
[0067] 图11.通过使用H376和HGF-1细胞评定IgA F4的抗-炎性活性。增加浓度的IgA 应用于静止H376和HGF-1细胞或在刺激时应用（HGF-1细胞）。在刺激之后24h，使用多重 悬浮液阵列（Luminex technology)测量由 H376 分泌 IP-10(A)和 G-CSF(B)和由 HGF-l(C) 细胞分泌IP-10。
[0068] 图12.使用IgA F4的附着抑制测定。IgA F4干扰肺炎链球菌（S. pneumoniae) R6(A)和缓症链球菌（S.mitis) (B)向H376细胞的附着能力。
[0069] 图13.使用IgA F4的细胞毒性测定。对H376细胞的γ -辐射-诱导的细胞死亡 的IgA F4的剂量效应减小。（A)如在时间线上描绘实施实验。（B)在辐射之后24h，通过使 用CytoTox-Glo?细胞毒性测定（Promega)测量细胞死亡。数对应于在用毛地黄皂苷处理 的H376细胞样品中测量的与总细胞毒性相关的比细胞死亡。
[0070] 图14.使用IgA F4的创伤治愈测定。（A)如在时间线中描绘实施实验。（B，C，D)通 过以不同时间间隔捕获划痕的像记录单层细胞中人工间隔的闭合，和测量间隔尺寸。100% 创伤表皮细胞再生对应于人工间隔的全恢复。
[0071] 图15.上皮细胞系上IgA受体的分析。对H376和底特律细胞实施⑶71和⑶89(或 关联同种型对照）的染色及通过使用流式细胞仪分析。
[0072] 图16.由ELISA评定IgA F4和IgG制备物中的抗-TNF活性。将来自ELISA板的 孔用TNFa (lyg/ml)包被和进一步阻断。将增加的浓度IgA F4，IgG和抗-TNFa抗体（单 克隆，英利昔单抗）应用于孔。在一些孔中，加入游离的TNFa以抑制测试的抗体的特异 性结合（竞争测定；条）。在洗涤之后，结合TNF a的免疫球蛋白用HRP-标记的特定第二 抗体揭示。 【实施例】
[0073] 实施例中包括的研究显示，免疫球蛋白可具有组合的抗微生物和抗-炎性/ 促-创伤治愈效应，及因此是有效预防和治疗食道粘膜炎，尤其是口腔粘膜炎的有吸引力 的选项。
[0074] 为了模拟口咽腔的粘膜上皮细胞层，使用上皮细胞系。用于该研究的适合的细胞 系的一例是人咽细胞系底特律562(ATCC CCL138)。使用的其他适合的细胞系是H376,源于 口底的鳞状癌细胞系，及HGF-1，牙龈成纤维细胞细胞系。作为粘膜微生物区系的部分的微 生物的一例，我们使用了粘膜炎莫拉菌（Moraxella catarrhalis)，其是典型鼻-及口咽病 原体，以及口腔小型生物群中发现的其他细菌，诸如链球菌属（Streptococcus)物种。此模 型实验系统被认为对于初步体外实验适合，因为该细胞系的来源对应于经口施用的免疫球 蛋白的旨在的（优选的）作用位点。此外，底特律细胞已之前显示在暴露于细菌（活的或 灭活的全细菌或细菌表面组分）后呈现促炎活化。选择粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)，其 是兼性病原体，其唯一的天然的栖息地是人咽，，因为其体外粘附于及穿透底特律细胞的能 力，及因为其诱导促炎介质诸如IL-6, IL-8, TNFa，MCP-1和GM-CSF分泌。此外，粘膜炎莫 拉菌（M. catarrhalis)的特定外膜蛋白（例如，UspAl和UspA2)均通过与CEACAM1和TLR2 结合来介导附着和侵入及引发促炎级联。这些外膜蛋白的等基因敲除突变体是可利用的。 粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)的UspAl和UspA2是被人免疫系统识别的知道的免疫原及 在健康个体中诱导特定血楽和唾液IgA和IgM。此外，将链球菌属（Streptococcus)物种， 尤其是缓症链球菌（S.mitis)及肺炎链球菌（S. pneumoniae)用作存在于口腔中的典型机 会性病原体。由此，此体外模型适合于评定人免疫球蛋白制备物对细菌附着和侵入及对发 炎的细菌诱导的效应。
[0075]【实施例1 :源于血浆和源于唾液的免疫球蛋白制备物包含识别粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis)的抗体】
[0076] 为了测试是否我们的免疫球蛋白制备物可具有抗-微生物效应，我们首先要建立 是否它们含有识别在口-咽道的粘膜表面上发现的潜在病原体的抗体。作为该微生物的一 例，我们使用了粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)。
[0077] 1. 1.细菌株和人细胞系。粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)株25238购自美国典型 培养物保藏中心（ATCC)。实验室株035E是自患中耳炎的儿童的中耳分离物。在脑-心脏 输注（BHI)琼脂板（Difco,底特律，MI)上，于37°C，在5% C02气氛中或于37°C和200旋 转/分钟（rpm)，在BHI肉汤中培养细菌。在一些实验中，通过将活细菌重悬浮于PBS和于 60°C温育60min来将细菌热-灭活。在补充10%的热灭活的胎牛血清（FCS)，2mM的L-谷 氨酰胺，ImM丙酮酸钠 （Sigma, St. louis，M0)，IX非必要氨基酸（Sigma)，100U/ml青霉素， 及 100 μ g/ml 链霉素的 Eagle 氏最小必要培养基（MEM ;Invitrogen, Basel, Switzerland) 中，于37°C，在5%C02中维持人咽细胞系底特律562(ATCC CCL 138)。
[0078] 【1.2.试剂】合并的人免疫球蛋白同种型（IgA( "IgA F4" [50mg/ml]，"IgA F5A"[50mg/ml)]IgG( Privigen? [lOOmg/ml]和 IgM( "IgM F5A"[10mg/ml])，分别）获 自CSL Behring, Bern, Switzerland。IgG制备物是可商购的人静脉内IgG(IVIG)制备物 (Privigen? )。纯化的人血浆IgA和igM级分是实验产物。由mphq柱的连续洗脱和由 亲和层析的随后分离从血楽产生IgA。自CSL Behring AG(Berne, Switzerland)的IVIg制 备过程的AIEX层析步骤，在用pH6. 5的10mM磷酸盐/30mM乙酸盐进行Macro-Prep High Q(Bi〇-Rad，Hercule，CA)柱的后洗涤之后，通过用pH7. 6的55mM酒石酸盐/5mM乙酸盐洗 脱获得级分F4。将级分F5随后用pH5. 0的50mM磷酸盐/25mM柠檬酸盐洗脱。使F4和F5 在PBS中由超滤/渗滤达到大致lmG/mL，然后由亲和层析，使用IgSelect树脂（GE Healt hcare, Glattbrugg, Switzerland)耗尽IgG。在F4负荷的IgSelect层析的流通物中直接 收获IgA F4。为了获得IgA F5,由亲和层析，使用CaptureSelect人IgM树脂（Bioaffinity Company BAC)使F5负荷的IgSelect流通物耗尽IgM。此CaptureSelect人IgM树脂的洗 脱产生这里使用的IgM F5级分。使IgA F4, IgA F5和IgM F5由超/渗滤达到终浓度。
[0079] 【1. 3.免疫印迹分析】由 EDTA-缓冲剂方法（Murphy TF & Loeb MR(1989)Microb Pathog 6 :159-74)制备株25238和035E的外膜蛋白（0ΜΡ)制备物，及分别以图1和2中 0. 5和0. 4μ g/mm的凝胶槽的蛋白浓度由SDS-PAGE(10%聚丙烯酰胺）解析。随后将凝胶 电转移至 PVDF 膜（Imm〇bil〇n-P?，Millipore 公司，Bedford，MA)。通过使用单克 隆抗体（17C7(Aebi C 等人（1997) Infect Immun65:4367-77)，24B5 (Cope LD 等人（1999) J Bacteriol 181 :4026-34)，10F3(Aebi C 等人（1998) Infect Immun 66 :3113-9) [0.5% 的mAb上清液，不知道绝对浓度])和唾液或上述的合并的人IgA或IgG(0. 4μ g/ml)作 为第一抗体和1:4000-稀释的用辣根过氧化物酶（Sigma Corp.，St. louis, M0)标记的山 羊-抗-人IgA或IgG作为第二抗体实施免疫印迹分析。将SuperSignal West Pico化学 发光底物（Pierce Chemical Co·, Rockford, IL)用于抗体结合的检测。
[0080] 图 1 展不，类似于株 035E (Helminen ME 等人（1993) Infect Tmmun 61 :2003-10 ; Helminen ME 等人（1994) J Infect Dis 170 :867-72 ;Cope LD 等人（1999) J Bacteriol 181 :4026-34)，株 ATCC 25238 的 0ΜΡ 与针对主要 0ΜΡ UpAl (mAb 17C7 和 mAb24B5)， UspA2(mAbl7C7)和CopB(mAblOF3)的3种单克隆抗体强烈反应，从所述株产生这些mAbs， 且其是粘膜炎莫拉菌（Mcatarrhalis)的主要和更临床关联种系发生系1的标准代表 (Meier PS 等人（2005) Vaccine 23 :2000-8)。
[0081] 我们随后使用标准免疫印迹测定（Stutzman等人（2003) Infect Immun 71 : 6793-8)确认，人血浆和唾液含有与来自株ATCC 25238和035E的粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis) 0ΜΡ反应的抗体。图2展示，人唾液和0ΜΡ含有被人IgA (唾液，0ΜΡ)和/ 或IgG识别的多种抗原。
[0082] 重要的是首先确定，株ATCC 25238在表达上皮细胞粘附素 （mAbs 17C7和25B4) 中与标准035E种系发生组1株（其在世界上用作粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)的参照 小儿中耳分离物）类似地发挥作用（Bootsma HJ等人（2000) J Infect Dis 181 :1376-87)， 及用于可利用的单克隆抗体的产生。图1显示这是事实。此外，如显示于图2,血浆来源的 IgA和IgG识别相同的ATCC 25238外膜表位，其还确证此株在我们的实验系列中的有用性。 这里已注意到，UspAl主要粘附素（与mAbs 17C7和24B5具有反应性）含有与人纤连蛋白 反应及与 CEACAM 1 反应的结构域（Brooks MJ 等人（2008) Infect Immun 76 :5322-9)和应 由此能结合广泛的人上皮细胞系。免疫印迹中不同条带的产生支持抗体通过使用它们的特 异性抗原-结合（Fab)结构域结合外膜囊泡的观点。
[0083] 【实施例2 :细菌粘接于上皮细胞的抑制】
[0084] 为了进一步证实我们的免疫球蛋白制备物的抗-微生物效应，测试是否免疫球蛋 白制备物在抑制粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)粘接于咽上皮细胞系底特律562中有效。
[0085] 如之前描述，用以下修改，体外测量粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)粘附于人上 皮细胞的能力（Aebi C等人（1998) Infect Immun 66:3113-9)。将底特律562细胞（? 3X 105细胞/孔）在24孔组织培养板中，在补充0. 1 % FCS但无抗生素的MEM中生长过夜 至铺满单层，之后在MEM中洗涤3次。使细菌生长过夜及调整至适当的感染复数（Μ0Ι)。将 活细菌加入孔中的无 FCS、补充适当的浓度的免疫球蛋白（如以上段落1. 2描述制备的）或 对照（例如对于IgG测定是脯氨酸），但无抗生素的MEM中，以1，500rpm离心5min，及随后 于37°C温育30分钟。然后将孔在MEM中洗涤5次，经胰蛋白酶处理，及将悬浮液定量培养， 以测定附着的细菌数。将株035E. 1(8卩，由等位基因取代产生的等基因 uspAl粘附素敲除 突变体（Aebi C等人（1998) Infect Immun 66 :3113-9))用作阳性（即，附着抑制）对照。 数据表示为粘附于上皮细胞的原接种物的细菌的比例。各测定以一式三份进行和实施至少 3次实验，导致每研究的条件至少9个数据点。由锥虫蓝排除及商业LDH测定（BioChain Institute, Inc.，Hayward, CA)在形态学上查明细胞活力。
[0086] IgA F4 (图3)和IgA F5 (图4)均以5mg/ml的浓度显著地抑制附着。补充5mg/ ml的IgA的阳性对照035. 1和035. 1的附着显著地更低。由合并的人血楽IgG的附着的抑 制是显著总体上的，但柱间差异未达到的统计学意义，尽管图5提示IgG浓度-依赖性抑制 性效应。IgM F5A级分，另一方面，如显示于图6展示强附着-抑制效应。
[0087] 5mg/ml的浓度的IgA F4和IgA F5被发现显著地抑制向底特律细胞附着（见图3 和图4)。似乎有剂量-效应曲线。阳性对照株035. 1 (缺少主要粘附素 UspAl表达的等基因 突变体）的附着也显著地更低（未示出显著性）。这些发现指示，血浆IgA大致在生理学唾 液浓度一个l〇gl〇以上的浓度能抑制粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)与咽上皮细胞体外结 合。这些数据支持其作为中和"粘膜"抗体阻止细菌表面组分（例如，0MP，L0S)的促-炎性 效应的潜力。对纯化的血浆IgM F5A记载了类似发现（图6)。对血浆IgG ( Privigen? ) 也观察到类似趋势（图5)，尽管未获得统计学意义。值得一说的是，结合的IgG (以及IgM) 强烈活化人补体及细菌结合随后杀灭或调理素作用可在防止粘膜炎中是不期望的。但是， 未知补体是否及以何程度在人腔中活动。
[0088] 【实施例3 :上皮细胞的细菌侵入被免疫球蛋白抑制】
[0089] 如之前显示（Spaniol V等人（2008)Microbes Infect 10 :3 ?11)，粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis)能在儿童和年轻成年中穿透上皮细胞和甚至体内定位进粘膜下咽软组织 (Heiniger N等人（2007)J Infect Dis 196:1080-7)。由此，我们研究了人免疫球蛋白体 外抑制咽上皮细胞穿透的潜力，以进一步展示免疫球蛋白制备物的潜在益处。
[0090] 如之前描述，加以下修饰，通过使用庆大霉素保护测定估计细菌侵入（Spaniol V et al(2008)Microbes Infect 10:3-11)。在无抗体的培养基中制备细胞。在洗涤之 后，以30的Μ0Ι添加细菌以及指示的浓度的如以上段落1. 2描述制备的各免疫球蛋白，以 l，500rpm离心5min及于37°C，在5% C02中温育3h。为了测定细胞内细菌数，将感染的单 层在PBS中洗涤3次，及于37°C用硫酸庆大霉素（200μ g/ml)处理2h。在洗涤之后，细胞 通过用0. 25 %胰蛋白酶-EDTA处理而自塑料表面分开，通过添加1 %皂苷裂解，及在PBS中 连续稀释，用于定量细菌培养。通过在庆大霉素暴露之后恢复的cfu数除以接种的cfu数 来计算侵入比。
[0091] 图7展示，相比0. lmg/ml，10mg/ml浓度的IgA F4显著地抑制底特律562咽细胞 的穿透。l〇mg/ml与阴性对照（MEM-PBS)的比较未达到显著性。类似地，相比MEM-PBS阴性 对照，l〇mg/ml的人合并的血楽IgG ( Privigen? )显著地抑制侵入。血楽IgM F5也是如 此，其相比MEM-PBS对照和0. lmg/ml的最低IgG浓度，以5mg/ml展示显著的侵入抑制。作 为图7?9中的分散量度，我们使用了平均值（SEM)的标准误差。我们也被迫克制不表示 "阳性"对照在底特律细胞穿透中完全失效，因为得不到那样的细菌。
[0092] 再更典型的细胞外病原体最近已被发现能穿透粘膜上皮细胞层或穿过粘膜上皮 细胞层胞吞转运，例如，非可分型的流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae) (Eldika， N&Sethi S(2006)Curr Opin Pulm Med 12 :118_24)，金黄色葡萄球菌属（Staphylococcus aureus) (Que YA等人（2005) J Exp Med 201 :1627-35)等。细胞内存留可为避免粘膜免疫 及接近宿主的上皮下及-最终-血管空间的手段。此可在患者中与发热中性粒细胞减少症 和粘膜炎具有特定关联。我们使用建立的庆大霉素保护测定测量了上皮穿透的免疫球蛋 白-介导的抑制，并发现，全部3种同种型能抑制底特律细胞的穿透。在IgA F4(图7)和 IgM F5A (图9)的情况中，分别以10mg/ml和5mg/ml观察到显著抑制。再次，血浆IgG (图 8)也发现类似趋势，尽管不统计学地显著。
[0093]【实施例4 :上皮细胞因子/趋化因子释放由免疫球蛋白的调节】
[0094] 为了显示免疫球蛋白的抗-炎性效应的潜力，研究是否免疫球蛋白制备物对由上 皮细胞的细胞因子/趋化因子释放具有效应。
[0095] 制备底特律单层细胞及在增加的浓度的IgA F4的存在下，用不同浓度的粘膜炎 莫拉菌（M. catarrhalis)OMP(关于OMP制备，见实施例1. 3)刺激。阴性对照由含或不含 OMP的培养基组成。在刺激之后0和24小时时间收集个体上清液，然后保持于-80°C直到 分析。在本实验中，在检测之前，将样品温育16小时过夜。作为基质溶液，我们使用了含 0. 1% FCS的RPMI-1640细胞培养基（Sigma, R8758)。在制备样品之后，用Bioplex 200分 析仪（BioRad)获取数据。使底特律细胞的制备物暴露于各种浓度的免疫球蛋白，和在Bern 大学的感染性疾病学会实施OMP。在CSL Behring，Bern进行细胞因子/趋化因子的测定。
[0096] 在0时间，底特律细胞接收补充或未补充0ΜΡ的新鲜培养基和不同浓度的IgA F4。 由于此原因，及如显示于图l〇A，B，C，在此时间，在上清液中几乎检测不到细胞因子。在 24h，无任何0ΜΡ，底特律562细胞分泌可检测的水平的MCP-1，IL-8和IL-6 (图10A，B，C)。 MCP-1是调控单核细胞/巨噬细胞募集的关键趋化因子。其涉及许多疾病（Deshmane SL等 人（2009) J. Int. &Cyt. Res. 29, 6, 313?326)。IL-8(或嗜中性粒细胞趋化因子）是向组织 募集嗜中性粒细胞的趋化因子。其也与口腔前庭中的发炎关联（Ertugrul AS等人（2013) J Periodont Res ;48 :44?51)。最后，还有，IL-6是发炎的重要介质，及已显示在照射的成 纤维细胞中被诱导（Brach MA 等人（1993) J. Biol. Chem. 268:8466 - 8472 ;Rincon Μ (2012) Trends Immunol. 33(11)571-577)。重要的是，培养基中添加0ΜΡ分别增加 MCP-1，IL-8和 IL-6产生约10,3及7倍。而且，尽管低量的IgA F4对0ΜΡ-诱导的趋化因子/细胞因子产 生几乎无效应，l〇mg/ml IgA醒目地减少MCP-1，及在较少程度上，IL-8和IL-6分泌。
[0097] 为了支持这些结果，我们旨在测试对另外的细胞系的IgA F4活性。口底组织代表 在口腔粘膜炎过程期间损伤的组织之一。我们发现了新细胞系，H376(人口腔鳞状细胞癌； HPACC 06092005)，其来源于口底。除了 H376之外，我们选择研究牙龈成纤维细胞（HGF-1 细胞系；ATCC? CRL-2014?)，由于它们位于颊上皮细胞下，和会在口腔粘膜炎过程中感 觉发炎。
[0098] 在以下实验中，我们分析了 H376和HGF-1细胞的细胞因子特征。
[0099] 在2种浓度的IgA F4(在MEM中制备的5和10mg/ml)存在下制备单层细胞。阴性 对照由培养基单独（纯MEM细胞培养基，Life technologies, 51200-046)组成。在24小 时收集个体上清液。将HGF-1细胞用已知刺激成纤维细胞的促-炎性细胞因子（例如重组 IL-Ιβ 和 TNFa,均在 50ng/ml ;分别获自 Milteni(130-093-893)和 P印rotech(300-01A)) 刺激。在刺激之后，然后使上清液保持于-80°C直到分析。作为基质溶液，我们使用了 MEM。 在制备样品之后，用BiopleX200分析仪（BioRad)获取数据。
[0100] H376细胞分泌IP-10,其是与发炎关联的IFN-Y-诱导的蛋白（Liu Μ等人（2011) Cytokine growth Factor Rev. 22(3)，121-130)和分泌G-CSF，其代表能在炎性位点募集嗜 中性粒细胞的炎性介质（Suzuki S(2002)Blood 99:1863-1865)(图 ΙΙΑ,Β)。在图 11A 和 B 中，我们显示，用IgA 5mg/ml治疗H376细胞强烈减少IP-10和G-CSF产生约50%。增加 IgA浓度至10mg/ml未进一步减少G-CSF产生，但相比5mg/ml的IgA稍微更佳地减少IP-10 产生（图11A，B)。H376细胞是肿瘤细胞和可具有活化的表型。我们不可排除，IP-10和 G-CSF水平无法如在原代颊上皮细胞中那么高。
[0101] HGF-1是牙龈成纤维细胞。它们未以稳定状态产生任何IP-10 (图11C)。但是，当 将炎性分子诸如IL-Ιβ和TNF-α应用于它们的培养基（纯MEM)时，有清楚的IP-10产生 的诱导。以相当的浓度，相比IL_13，TNFa在IP-10诱导中更有力。在两个条件下，在刺 激时添加 IgA强烈减少IP-10产生，最高IgA F4浓度显示最强减小。然而，5mg/ml的IgA F4显示非常近似的免疫抑制效应（图11c)。
[0102] 总之，我们的数据首次显示，IgA F4对不是骨髓样细胞的细胞（例如上皮细胞）发 挥免疫抑制效应。这是非常有价值的信息，由于在口腔粘膜炎过程期间，会由上皮细胞和成 纤维细胞响应电离辐射和/或细菌定居而上调促-炎性趋化因子和细胞因子。这些结果指 示，在口腔粘膜炎过程期间，IgA可潜在地将其免疫抑制效应靶向广范围的细胞子集（例如 嗜中性粒细胞，巨噬细胞，上皮细胞，等）。
[0103] 【实施例5 :由免疫球蛋白抑制由除粘膜炎莫拉菌（M. catarrhalis)之外的细菌诱 导的附着，侵入和上皮细胞因子/趋化因子释放的调节】
[0104] 在类似实验中，如描述于实施例1?4,研究了其他微生物诸如除粘膜炎莫拉菌 (M. catarrhalis)之外的细菌，或真菌。它们包括但不限于病原性和机会性病原性物种， 如大肠埃希氏菌（Escherichia coli)，金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus),铜 绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa)，草绿色链球菌（Streptococcus viridans)组， 肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)，奠肠球菌（Enterococcus faecalis)/屎肠 球菌（Enterococcus faecium)，肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae)，产气肠杆菌 (Enterobacter aerogenes)，流感嗜血杆菌（Haemophilus influenza)，嗜麦芽寡养单胞菌 (Stenotrophomonas maltophilia)，酿胺链球菌（Streptococcus pyogenes)，缓症链球菌 (Streptococcus mitis)，白色假丝酵母（Candida albicans)和许多厌氧细菌物种。获得 了如在实施例1?4中描述的类似结果：IgA制备物含有针对上述的细菌或真菌的特异性 抗体；上皮细胞的附着和侵入被抑制；炎性细胞因子应答被抑制。用其他上皮细胞系（胃肠 道和结肠的粘膜衬的代表）获得类似结果。
[0105] 【实施例6 :动物模型中粘膜炎的防止】
[0106] 在口腔粘膜炎的动物模型中测试适当配制的免疫球蛋白制备物。在自Ryu等人适 应的CD89-转基因小鼠模型中由同时化学-及放射治疗（CCRT)预防性地应用免疫球蛋白 及随后粘膜炎诱导（J. radiat. Res.，51，595?601，2010)。我们测量了免疫球蛋白治疗对 口腔粘膜炎的程度和严重性，而且对与创伤-治愈和从CCRT得到的组织损伤的分辨率关联 的因素的效应。口腔粘膜炎严重性的实际指标是体重减轻，舌及颊粘膜萎缩（上皮厚度）。 此外，通过测量上皮层厚度，粘膜中基底细胞数，增殖标志物KI-67, mRNA转录物的组织定 量（由组织样品的原位杂交和RT-PCR)和生长因子如KGF，上皮生长因子，纤维细胞生长因 子，血管内皮生长因子A等的蛋白表达来评定治疗效果。该分析会产生关于作为免疫排除 的结果和潜在地也由于IgA与表达CD89的细胞的直接相互作用的细胞内促炎级联下调的 信息。相比非-处理的动物，用IgA处理的小鼠失更少体重和它们的舌和颊粘膜被欠严重 影响。用分泌-样IgA处理的小鼠甚至被更佳地保护。
[0107] 或者，使用口腔粘膜炎的仓鼠模型，类似于描述于Watkins等人（Oral Dis 2010, 16:655-660)。给叙利亚金色仓鼠每天3次预防性地施用（例如起始于第-3天）适 当配制的IgA制备物（或对照是媒质溶液）经研究的整个持续时间达第28天。在急性放 射-诱导的粘膜炎模型中，在第〇天照射（40Gy) -个外翻的颊囊，另一颊囊保持未处理用 于对照。或者，在分次的放射-诱导的粘膜炎模型中，应用60Gy的累积剂量，分为7. 5Gy的 8个部分，如描述于（Watkins, Oral Dis 2010, 16:655-660)。在组合顺钼和急性放射-诱导 的粘膜炎的又另一模型中，通过在第〇天组合顺钼（5mg/kg)和35Gy放射来诱导疾病。从 第6天起始直到研究结束（一般在第28天）每天进行口腔粘膜炎的临床评估及体重监测。 评分系统描述于（Watkins Oral Dis, 201016:655-660)。此外，收集组织和血浆样品及贯穿 组织分析的研究，测定血浆中的炎性标志物及为各种组织的基因表达研究而适当加工。未 处理的/媒质处理的动物发展口腔粘膜炎，疾病峰约第16?18天，自发治愈，通过粘膜炎 消退证明，约第18?20天起始。用IgA治疗的动物相比对照动物具有显著地更低粘膜炎 分值及体重减轻更少，并行欠严重的组织发现及减少的炎性标志物（包括但不限于炎性细 胞因子和趋化因子）水平。由基因-表达分析技术在mRNA表达水平确认了发炎减小和促 进创伤-治愈。用分泌-样IgA治疗甚至更有效。
[0108] 【实施例7 :机会性病原体附着于颊上皮细胞的抑制】
[0109] 为了确证及进一步加强我们的在实施例2中提供的我们的免疫球蛋白制备物的 抗-微生物效应的数据，我们测试了 IgA干扰细菌附着于H376上皮细胞的能力。
[0110] 颊微生物区系由对于硬壁菌门（Firmicutes)优势的广泛的细菌株组成（The Human Microbiome Project Consortium(2012)Nature486:207-214)(Dewhirst FE(2010) J.Bacteriol 192:5002-5017)。重要的是，非-包裹的肺炎链球菌（Streptococcus pneumoniae)及缓症链球菌（Streptococcus mitis)(均来自硬壁菌门（Firmicutes))是遗 传上非常接近的。缓症链球菌（S.mitis)已知代表主要口腔机会性病原体和当上皮屏障破 裂（如可一般在患口腔粘膜炎的患者中发生）时，可潜在地导致感染。非-包裹的肺炎链 球菌（S. pneumoniae)良好粘附于上皮和可导致粘膜感染包括结膜炎，但不是侵袭性疾病。 由此，在此工程的情景中，肺炎链球菌（S. pneumoniae)R6和缓症链球菌（S.mitis)是对于 研究细菌和口腔粘膜上皮之间的相互作用有用的模型生物。
[0111] 体外测量细菌分离物粘附于人上皮细胞的能力，如之前在实施例2中描述及在文 献（Aebi C等人（1998)Infect Immun 66 :3113-9)描述，具有以下修饰。使H376细胞（? 3 X 105细胞每孔）在24孔组织培养板中，在补充0. 1 % FCS，但无抗生素的MEM中生长过 夜至铺满单层，之后在MEM中洗涤3次。使细菌生长过夜及调整至适当的感染复数（Μ0Ι)。 将活细菌加入孔中的无 FCS、补充适当的浓度的免疫球蛋白（如以上段落1.2描述制备的） 或对照（例如对于IgG测定是脯氨酸），但无抗生素的MEM中，以1，500rpm离心5min，及随 后于37°C温育30分钟。然后将孔在MEM中洗涤5次，经胰蛋白酶处理，及将悬浮液定量培 养，以测定附着的细菌数。数据表示为粘附于上皮细胞的原接种物的细菌的比例。各测定 以一式三份进行和实施至少3次实验，导致每研究的条件至少9个数据点。由锥虫蓝排除 及商业LDH测定（BioChain Institute, Inc.，Hayward, CA)在形态学上查明细胞活力。
[0112] 如显示于图12A，肺炎链球菌（S. pneumoniae)R6非常良好地粘附于来源于口底的 H376细胞。在洗涤之后，多于60%的细菌仍附着于细胞。重要的是，添加2mg/ml的IgA F4 足以醒目地阻断上皮细胞上肺炎链球菌（S. pneumoniae)R6的附着。大致75%的细菌可被 预防粘附于细胞。增加的IgA剂量显示，细菌附着的稍微更多抑制。在图12B中，测试了 H376上缓症链球菌（S.mitis)的附着。我们发现，缓症链球菌（S.mitis)以相比肺炎链球 菌（S. pneumoniae)R6更少程度结合于上皮细胞。但是，IgAF4明显以5mg/ml的最大效应 抑制缓症链球菌（S.mitis)附着。由此，在显示口腔粘膜炎症状的患者的口腔前庭中施用 IgA F4可保护颊上皮免于条件致病菌病原体定居。
[0113] 【实施例8 :IgA保护上皮细胞免于离子化照射诱导的细胞毒性】
[0114] 用于治疗带有肿瘤的患者的放射治疗靶向增殖细胞（例如肿瘤细胞）。通过产生 DNA断裂和活性氧，γ-电离辐射通常诱导肿瘤细胞死亡。尽管相信，颊上皮细胞更耐受放 射，因为它们的低周转，重复的放射仍可对这些细胞诱导细胞毒性。为了研究是否在电离辐 射之后，IgA对细胞存活具有影响，我们照射了 H376及在24h之后测量了细胞毒性。
[0115] 如描绘于图13A，将H376以3X104细胞/孔（96孔板）接种于ΜΕΜ(80μ 1)中，及 于37°C保持2小时。然后将IgA F4(5或10mg/ml)和/或MEM加入孔，以达到100μ 1的最 终体积（一式三份）。一天后，将细胞用4Gy照射，及返回37°C。在辐射之后24h，通过使 用CytoTox-Glo?细胞毒性测定试剂盒（Promega，G9291)评定细胞毒性。此试剂盒测量在 细胞死亡过程期间释放的细胞内蛋白酶的量。
[0116] 如显示于图13B，多于30%的H376在接收电离辐射之后死亡。H376细胞用IgA F4 的预防性治疗以剂量依赖性方式减少此细胞毒性。l〇mg/ml的IgA在24h抑制细胞死亡几 乎50%，和5mg/ml的IgA抑制几乎30%。因此，向上皮细胞添加 IgA提供存活优势，和可 减少重复的放射对患者上皮的效应。
[0117] 【实施例9 :对创伤表皮细胞再生的有益效应】
[0118] 尽管在口腔粘膜炎期间控制细菌定居和炎性信号具有关联，逐渐明白口腔粘膜炎 症状的减小需要在颊上皮溃疡形成之后快速伤口闭合。KGF在创伤表皮细胞再生中起到重 要作用。此是为何KGF是目前用于治疗口腔粘膜炎的少数的被许可的药物之一的原因之 一。为了进一步描绘在口腔粘膜炎期间IgA的潜在作用，我们在受伤的上皮上测试IgA。为 了再现放射对细胞上皮的潜在体外损伤效应，我们在划痕测定中使用它们之前照射了单层 细胞。
[0119] 用来测试创伤治愈的主要测定是常见的划痕测定。其由划单层细胞及经时捕获图 像以便测量人工创伤的闭合组成。如显示于图14A，我们在MEM(500 μ 1最终体积）中接种? 3Χ 105Η376细胞/孔（24孔板），和将板于37°C保持2h。然后将免疫球蛋白（例如IgA或 IgG或培养基对照）加入孔，和将板于37°C再放置22小时。在此步骤，将板以2Gy，4Gy照 射，或保持未处理，及返回到37°C。24h后，用P1000端，通过各孔的单层细胞制造划痕。为 了防止划的细胞落入人工间隔，移出培养基，将单层细胞用MEM洗涤一次，然后将补充或未 补充免疫球蛋白的MEM加入孔。在不同时间点，使用显微镜捕获像，和测量间隔尺寸。100% 创伤表皮细胞再生对应于人工创伤的全恢复。
[0120] 以2个剂量（10mg/ml和5mg/ml)测试IgA F4,而以10mg/ml使用IgG。有趣的 是，以稳定状态，IgA对人工间隔闭合显示稍微正面效应（图14B)。相反，IgG似乎减慢伤 口闭合。当划照射的单层细胞时，IgA的作用变得更清楚（图14C和D)。IgA F4维持照射 的H376细胞的迁移和分裂，而未处理的照射的细胞未以相同的速度覆盖人工间隔。而且， 当将细胞用4Gy照射时，IgA效应更强。当以2Gy和4Gy照射细胞时，在上皮细胞上观察到 IgG的负面效应（图14C，D)。
[0121] 【实施例10 :IgA与上皮细胞的特异性结合】
[0122] 为了获得IgA在细菌刺激和创伤表皮细胞再生过程中调控上皮细胞功能的潜在 机理的信息，我们分析了底特律562和H376上皮细胞上IgA受体的细胞表面表达。
[0123] 几种受体已被描述结合IgA。它们是⑶89,⑶71 (转铁蛋白受体）， ASGP-R，FCAMR(Fca/mR，CD351)和 pIgR(CD300e)(Monteiro 等人（2003)六111111.1^￥· Immunol. 21:177-204)。CD89在骨髓样细胞上表达，而ASGP-R，FCAMR和plgR分别存在于 肝细胞上，B-淋巴细胞和巨噬细胞上，及肠上皮细胞上。仅⑶89以高特异性结合IgA。
[0124] 因为许多细胞类型需要由转铁蛋白的铁摄取，其被转铁蛋白与其受体（例如 CD71)的结合驱动，由此CD71在许多细胞类型（除了高度分化的细胞外）上潜在地表达 (Pomka P等人（1999) IJBCB 31,1111-1137)。但是，其水平在细胞间显著地改变。至今， CD71 已被显示结合单体 IgA 和分泌 IgA (Moura 等人（2001) J. Exp. Med. 194, 4, 417-425)。因 此，其是颊上皮细胞上IgA的潜在靶。
[0125] 为了控制此受体的表达，我们于37°C用ACCUTASE(eBioscience)轻轻分开PBS IX-洗涤的H376和底特律562细胞10分钟，用1XPBS洗涤它们，及在1XPBS中，在 冰上，使用抗-人CD71(BD Biosciences，克隆A59)抗体将它们染色30分钟。同种型对 照抗体用于评定背景荧光的水平。将CD89(仅在骨髓样细胞上表达）用作阴性对照（BD Biosciences，克隆M-A712)。在2个洗涤步骤之后，在FACS Canto II流式细胞仪（Becton Dickinson)上运行样品。
[0126] 如显示于图15,我们发现底特律562和H376上皮细胞明显表达转铁蛋白受体。相 反，及如预期，在上皮细胞上未检测到⑶89。
[0127] 【实施例11 :IgA F4制备物不与TNFa反应】
[0128] 在最近几年，靶向和/或抑制负责发炎或促进肿瘤发展的关键蛋白的免疫球蛋白 (例如单克隆抗体）的产生强烈增加。在慢性疾病以及自免疫疾病中，抗-TNFa-特异性抗 体已显示减缓被治疗的患者中的发炎。
[0129] 如显示于实施例4(图10和11)，IgA下调由上皮细胞的促-炎性分子产生。为 了排除观察的IgA的抗-炎性效应中抗-TNF活性的涉及，我们测定了我们的多克隆IgA和 IgG制备物中TNFa特异性抗体的水平。
[0130] 于 37°C，在 96_ 孔板（样品板）（Nunc Maxisorb)中以在 PBS(pH7· 4)中 1 μ g/ ml (50 μ L/孔）包被TNF-α经2h。然后将孔用300 μ 1洗涤缓冲剂（IXPBS, 0.05 % (v/ v)吐温-20)洗漆一次，及于37°C用Smart Block (Candor Bioscience)阻断2小时。平行 地，制备无包被的TNF-α的结合对照板（空白板）。洗涤步骤后，将Ig样品（IgA F4/IgG Privigen/英利昔单抗）稀释于 LowCrossBuffer (LCB) (Candor Bioscience)。在一些孔中， 添加游离的TNF-α，以抑制抗体结合。将样品（1〇〇 μ 1)移液到板中，及于37°C温育2小时。 温育后，将孔洗涤3次，和将板于37°C用关联第二抗体（多克隆兔抗-人IgG-HRP(Dak 〇 ; 0. 5yg/ml)或多克隆兔抗-人IgA HRP(Dako;0. 5yg/ml))，在抗体缓冲剂（LCB)中温育 30分钟。如之前所述将孔洗涤4次，和随后用超-敏感TMB (Fitzgerald)显影。用1M盐酸 (Merck)停止反应，和在 450nm 处由 EnVision Multilabel 读取器（Perkin Elmer)测量吸 光度。
[0131] 图16展示，我们的IgG和IgA F4制备物均含有可忽略量的抗-TNFa抗体。以 相当的浓度，IgA和IgG对TNFa的反应性分别是抗-TNFa特异性抗体（英利昔单抗）的 1. 2X 106和1. 1 X 105分之一，由此，IgA免疫抑制活性是不依赖于TNF a的抗-TNF a活性。
【权利要求】
1. 包含免疫球蛋白的组合物，所述免疫球蛋白用于通过在受试者中局部施用来预防或 治疗食道粘膜炎。
2. 权利要求1的组合物，其中食道粘膜炎是口腔粘膜炎。
3. 权利要求1或权利要求2的组合物，其中免疫球蛋白包含IgA或IgM或其组合。
4. 权利要求3的组合物，其中免疫球蛋白包含含有J链的IgA。
5. 前述权利要求之任一项的组合物，其中免疫球蛋白可获自血或其组分。
6. 前述权利要求之任一项的组合物，其也包含分泌组分。
7. 权利要求6的组合物，其中分泌组分是重组体分泌组分。
8. 前述权利要求之任一项的组合物，其中组合物包含分泌-样IgA。
9. 前述权利要求之任一项的组合物，其中组合物包含与另一免疫球蛋白组合的分 泌-样IgA。
10. 前述权利要求之任一项的组合物，其被配制为提供与受粘膜炎影响的或处于受粘 膜炎影响的风险的粘膜区的长接触时间。
11. 权利要求10的组合物，其中制剂选自：霜剂，凝胶，糖浆，胶冻剂，接近受影响的粘 膜溶解的固体形式，或其组合。
12. 前述权利要求之任一项的组合物，其中局部施用于粘膜减少一种或更多微生物的 附着和/或侵入。
13. 权利要求12的组合物，其中微生物是细菌和/或真菌。
14. 前述权利要求之任一项的组合物，其中局部应用于粘膜促进粘膜创伤治愈。
15. 前述权利要求之任一项的组合物，其中局部应用于粘膜发挥抗-炎性效应。
16. 权利要求15的组合物，其中抗-炎性效应是 (a) 抑制促-炎性细胞因子表达；和/或 (b) 刺激抗-炎性细胞因子的表达。
17. 前述权利要求之任一项的组合物，其中受试者是处于发展食道粘膜炎的风险的受 试者诸如经历或即将经历化学治疗和/或放射治疗的癌患者。
18. 权利要求17的组合物，其中处于风险的受试者是作为之前化学治疗和/或放射治 疗法治疗的结果而发展粘膜炎的癌患者。
19. 权利要求17或权利要求18的组合物，其中当患者的嗜中性粒细胞计数开始降低时 开始施用组合物。
20. 权利要求19的组合物，其中治疗在患者的嗜中性粒细胞计数在正常以下的时期维 持。
21. 前述权利要求之任一项的组合物，其中组合物被施用给受试者达6次/天。
22. 前述权利要求之任一项的组合物，其中组合物包含用于治疗粘膜炎的另外的有效 齐U，或其中患者也正使用另一剂，诸如防腐漱口水。
【文档编号】C07K16/12GK104254543SQ201380013092
【公开日】2014年12月31日 申请日期:2013年3月8日 优先权日:2012年3月9日
【发明者】C·艾比, S·C·鲁尔, A·绍布, S·梅斯舍尔, A·祖尔舍尔, C·P·沃纳尔伯格 申请人:瑞士杰特贝林生物制品有限公司, 伯尔尼大学