生产用于皮下使用的高度浓缩的免疫球蛋白制品的方法

专利名称：生产用于皮下使用的高度浓缩的免疫球蛋白制品的方法
生产用于皮下使用的高度浓缩的免疫球蛋白制品的方法相关申请的交叉引用本申请要求于2009年5月27日申请的美国临时申请No. 61/181，606的优先权， 明确地将其全部内容并入本文以供参考以用于所有目的。
背景技术：
来自人血浆的免疫球蛋白产品首先在1952年被使用，来治疗免疫缺陷。最初， IgG的肌内或者皮下给药是选择的方法。然而，为了注射为有效治疗多种疾病所必需的大量IgG，人们开发了具有较低浓度IgG(50mg/mL)的静脉内给药产品。静脉内免疫球蛋白 (IVIG)通常含有来自超过一千个血液供体的血浆的汇集的免疫球蛋白G(IgG)型免疫球蛋白。IVIG典型地含有超过95%未修饰的IgG，其具有完整的Fc依赖性效应子功能、以及仅为痕量的免疫球蛋白A(IgA)或者免疫球蛋白M(IgM)，IVIG被灭菌，提纯的IgG产品主要用于治疗如下三个主要类型的医学适应症1.免疫缺陷，比如χ-连锁无丙种球蛋白血症、低丙种球蛋白血症(原发性免疫缺陷)、以及获得性损害免疫状况(继发性免疫缺陷)，特征是低抗体水平；2.炎症性疾病和自身免疫疾病；以及3.急性感染。许多IVIG商品供应商提供了多种IVIG产品。与先前的在再溶解之后溶液中仅含有50mg/mL蛋白质的冷冻干燥IVIG产品相比，最近开发的产品是含有100mg/mL即用型灭菌的、高度提纯和浓缩的人IgG抗体的液体制品。因为IgG产品比如IVIG是用汇集的人血浆制造的，所以来自供体血液的病菌(尤其是可在人身上引起多种疾病的已知病毒)污染是生产工艺中的严重问题。在IgG产品中另一个重要的考虑项目是它们、尤其是作为即用型制品在储存期间的稳定性。与IVIG相比，皮下给药的免疫球蛋白制品在家庭护理治疗可行性和较小副作用方面占优势。为了减少每位点小注射体积的缺点，更高浓度的IgG(例如，含有200mg/mL而不是100mg/mL)将具有明显优势。在一系列发表的关于血清和血浆蛋白制备方法和特性的重要论文的第四期中， Cohn等(J. Am. Chem. Soc.，1946，68 C3) :459-475)首次描述了一种用于醇分级分离血浆蛋白的方法(方法6)，该方法允许用于分离来自人血浆的富含IgG的组分。几年之后，Oncley 等(J.Am. Chem. Soc.，1949，71 (2) =541-550)发展了 Cohn方法，公开了一种可导致分离出更纯的IgG制品的方法(方法9)。这些方法虽然为整个血浆来源血液因子工业奠定了基础，但不能提供出具有足够高浓度的IgG制品来用于治疗数种与免疫相关的疾病，包括川崎综合症、免疫性血小板减少性紫癜、以及原发性免疫缺陷。这种情况下，人们使用多种技术比如离子交换层析开发出附加的方法来提供更高纯度和更高浓度的IgG剂型。Hoppe等(Munch Med Wochenschr 1967(34) :1749-1752)和 Falksveden (瑞典专利 No. 348942)、以及 Falksveden 和 Lundblad(Methods of Plasma Protein Fractionation(血浆蛋白质分级分离方法)1980) 首先使用离子交换层析法用于该目的。多种现代方法采用沉淀步骤，比如与柱层析相结合的辛酸盐沉淀法(Lebing et al.，Vox Sang 2003(84) :193-201)和 Cohn 组分(1+)11+111 乙醇沉淀法(Tanaka et al.，Braz J Med Biol Res 2000(33)37-30)。最近，Teschner 等(Vox Sang, 2007 (92) :42-55) 描述了一种生产10% IVIG产品的方法，其中首先从汇集的血浆中除去冷冻沉淀物，然后进行改进的Cohn-Oncley冷乙醇分级分离，接着进行中间体的S/D处理、离子交换层析、纳滤、 以及任选的超滤/渗滤。然而，尽管通过这些IgG生产方法可得到提高的纯度、安全、以及产率，但仍然需要适用于皮下和/或肌内给药的高度浓缩的IgG制品。本发明可满足这些其他的需要，并且描述了制造具有高浓度IgG的稳定的、高度提纯的、病毒灭活的、即用型的产品的方法。

发明内容
在一个方面，本发明提供了一种含水组合物，其每升组合物包含超过大约180克的蛋白质，并且至少95%的蛋白质是IgG比如人IgG。在一些实施方式中，该组合物是通过用于获得适用于皮下和静脉内给药的产品的方法制造的，并且能够在最终容器中在升高的温度下进行处理，以使病毒灭活，而其浓度可在10至22%蛋白质的范围之间任意调节。在某些情况下，在组合物中的蛋白质浓度为20% (w/v)或者大约20% (w/v)。在其他情况下， 组合物可以进一步包含大约0. 1-0. 3M的甘氨酸。本发明的组合物的pH可以变化，比如大约3-6、或大约4-6。在另一个方面，本发明提供一种用于由血浆制备浓缩IgG的组合物的方法，改进之处包括下述步骤(1)通过超滤，将血浆制品中的蛋白质浓缩至5% (w/v)或者大约5% (w/v)；以及⑵通过渗滤，将制品中的蛋白质进一步浓缩为20% (w/v)或者大约20% (w/ ν)。组合物中至少95%的蛋白质指的是IgG，比如人IgG。在一些实施方式中，通过使用标称截止分子量(NMWCO)为IOOkDa以下的超滤膜进行步骤(1)。在其他实施方式中，相对于 PH 4. 2 士0. 1的甘氨酸渗滤缓冲液进行步骤( 。在一些情况中，渗滤缓冲液具有0. 25M的甘氨酸和PH 4.0。在一些特定的实施方式中，在步骤(2)之后的蛋白质浓度高于20% (w/ ν)，并且随后用渗滤缓冲液调节为20% (w/v)或者大约20% (w/v) 0在另一个方面，本发明提供了一种用于由血浆制备浓缩IgG的组合物的方法，其包括下述步骤
(1)通过离心，从血浆中分离出液体和沉淀物；
(2)将预冷的乙醇与来自步骤(1)的液体混合，从而形成混合物，其乙醇浓度为8%(ν/ ν)或者大约8% (ν/ν)；
(3)通过离心，从来自步骤O)的混合物中分离出液体和沉淀物；
(4)将来自步骤(3)的液体的pH和乙醇浓度分别调节为7.0或者大约7.0和20-25% (ν/ν)或者大约20-25% (ν/ν)，借此形成混合物；
(5)通过离心，从来自步骤的混合物中分离出液体和沉淀物；
(6)将来自步骤(5)的沉淀物用缓冲液以1比15或者大约1比15的重量比再悬浮，从而形成悬浮液；
(7)将二氧化硅(SiO2)与来自步骤(6)的悬浮液相混合，并通过过滤得到滤液；
(8)将洗涤剂和冷的醇与来自步骤(7)的滤液相混和，并通过离心得到沉淀物；
(9)将沉淀物溶解于含有溶剂或者洗涤剂的水溶液中，并保持溶液至少60分钟；
(10)在步骤(9)之后，使溶液通过阳离子交换层析柱，并且将吸附在柱子上的蛋白质洗脱于洗脱液中；
(11)使来自步骤(10)的洗脱液通过阴离子交换层析柱，产生流出液；
(12)使流出液通过纳滤器，产生纳滤滤液；
(13)使纳滤滤液通过超滤膜，产生超滤液；
(14)相对于渗滤缓冲液对超滤液进行渗滤，产生蛋白质浓度为20%(w/v)或者大约 20% (w/v)的溶液；以及
(15)通过使溶液通过0.2μπι以下的过滤器进行过滤，来对来自步骤(14)的溶液进行灭菌，借此得到浓缩IgG的组合物。在一些实施方式中，步骤(2)在大约-2至0°C的温度下进行；或者步骤O)的混合物被混合至少15分钟，然后在大约-2至0°C的温度下保持至少2小时。在一些实施方式中，步骤(4)被混合至少15分钟，然后在_7°C或者大约_7°C的温度下保持至少8小时。 在一些实施方式中，步骤(6)的悬浮液在2°C至8°C的温度和5.0或者大约5.0的pH下被搅拌大约40-160分钟；或者步骤(7)中二氧化硅的浓度为40g/kg步骤(6)的悬浮液，并且在大约2-8°C的温度下进行混合至少大约50分钟。在一些实施方式中，步骤(8)在大约-5 至-10°C的温度下进行。在一些实施方式中，步骤(9)的溶液包含1.0% (ν/ν)的TRITON X-100、0· 3% (ν/ν)的吐温-80、以及0. 3% (ν/ν)的磷酸三(正丁)酯(TNBP)。在一些实施方式中，步骤(9)的溶液在大约18至25°C的温度下被保持。在一些实施方式中，步骤(10) 的阳离子交换层析柱用PH 5. 5士0. 1的IOmM醋酸缓冲溶液洗涤，并且用35mM磷酸二氢钠、 IOmM Tris、pH 8. 5士0. 1、导电率5. 0士0. anS/cm的缓冲液洗脱。在一些实施方式中，在步骤(11)之前，来自步骤(10)的洗脱液被调节至pH为6. 4士0.2、导电率为约1.5至2. 5mS/ cm。在一些实施方式中，在步骤(1 之前，使步骤(11)的流出液穿过孔径为0.2μπι或更小的过滤器。在一些实施方式中，步骤(1 的超滤液的蛋白质浓度为5士 (w/v)或者大约5士 (w/v) 0在其他实施方式中，步骤(1 的超滤膜具有50kDa以下的标称截止分子量(NMWCO)。在一些实施方式中，步骤(14)的渗滤缓冲液是pH为4. 2士0. 1的0. 25M甘氨酸溶液。在其他实施方式中，来自步骤(14)的溶液的蛋白质浓度大于20% (w/v)，并且随后被用渗滤缓冲液调节至20. 4士0. 4% (w/v)或者大约20. 4士0. 4% (w/v)。在一些实施方式中，步骤(1 和(14)是在大约2至8°C的温度下进行。在其他实施方式中，制备方法还包括如下步骤在容器被密封之前，在灭菌条件下，将步骤(1 的灭菌溶液分配入容器中。在其他的实施方式中，如上所述方法可以进一步包含如下步骤在大约30至32°C 下将密封后的容器储存大约21至22天；或者该方法可以进一步包含配制步骤，从而使 20% IgG产品与含量为10%的现有技术静脉内剂型一样稳定。在另一个方面，本发明提供一种通过如上所述制备方法生产的含水组合物，并且包含至少18% (w/v)的免疫球蛋白，例如至少20% (w/v)的免疫球蛋白。在另一个方面，本发明提供一种用于治疗罹患免疫缺陷、自身免疫病、或急性感染的病人的方法，包括将有效量的如上所述组合物给药于病人。


图1是新的超滤/渗滤体系的图解说明。 定义
术语“抗体”指的是基本上由免疫球蛋白基因编码的多肽、或者其片段，其可特异性地结合并识别分析物(抗原)。被识别的免疫球蛋白基因包含κ、λ、α、Υ、Δ、ε禾口 μ恒定区基因，以及种种免疫球蛋白可变区基因。轻链被分为κ或者λ类。重链被分为 Y、μ、α、Δ、或ε类，它们依次分别限定免疫球蛋白类为IgG, IgM, IgA, IgD、以及IgE0一个示例性的免疫球蛋白(抗体)结构单元由两对多肽链组成，每个配对都具有一个“轻链”(大约25kD)和一个“重链”(大约50-70kD)。每个链的N-端限定一个可变区，该可变区包含主要决定着抗原识别的约100至110个以上氨基酸。术语可变轻链和可变重链(Vh)分别指的是这些轻链和重链。术语“超滤(UF) ”包括多种膜滤方法，其中朝向半透膜向液体施加流体静压力。悬浮的固体和高分子量溶解物被保留，而水和低分子量溶解物则穿过滤膜。该分离过程经常被用于提纯和浓缩大分子(IO3-IOfiDa)溶液，尤其是蛋白质溶液。许多超滤膜是可利用的， 取决于它们要保留的分子的尺寸。超滤典型的特征在于滤膜孔径大小在1和IOOOkDa之间， 工作压力在0. 01和IObar之间，并且对于将胶体比如蛋白质与小分子比如蔗糖和盐分离开来特别有用。可使用与超滤一样的滤膜进行术语“渗滤”，后者是切向流(tangential flow)过滤。在渗滤期间，缓冲液被导入再循环罐，同时滤液被从单元操作中移去。在产品存在于滞留物中(例如IgG)的工艺中，渗滤从产品汇集液中洗出组分进入滤液，借此交换缓冲液并降低不期望有的物质种类的浓度。在此使用的用语“大约”表示从给定值加或减10%的近似范围。例如，用语“大约 20%”包括18-22%的范围。术语“混合”描述了一种通过任何形式搅拌以引起两种以上不同的化合物或者物质在溶液或者悬浮液中相等分布的行为。在本申请中使用的术语“混合”的结果并不需要所有组分在溶液或者悬浮液中完全相等的分布。在本申请中，术语“溶剂”包括任何能够溶解或者分散一种以上其他物质的液体物质。溶剂可以是性质上无机的溶剂，比如水；或者可以是有机液体，比如乙醇、丙酮、乙酸甲酯、乙酸乙酯、己烷、石油醚等。在此使用的术语“溶剂洗涤剂处理”中，溶剂表示有机溶剂 (例如磷酸三丁酯)，其是用于灭活溶液中脂质包膜病毒的溶剂洗涤剂混合物的一部分。在本申请中使用的术语“洗涤剂”可与术语“表面活性剂”或者“表面活性试剂”互换。表面活性剂典型地是有机化合物，其是两亲性的，即，同时含有疏水基团(“尾部”)和亲水基团(“头部”)，它们使得表面活性剂可溶于有机溶剂和水。表面活性剂能够通过其头部存在的形式上带电基团被分类。非离子型表面活性剂在其头部没有电荷基团，而离子型表面活性剂在其头部携带有净电荷。两性离子表面活性剂含有具有两个相反带电基团的头部。普通表面活性剂的一些实施例包括阴离子型(以硫酸根、磺酸根或者羧酸根阴离子为基础)全氟辛酸盐(PF0A或PF0)、全氟辛烷磺酸盐(PFOS)、十二烷基磺酸钠(SDS)、月桂烷硫酸铵、以及其他的烷基硫酸盐、月桂基醚硫酸钠(亦称月桂基乙醚硫酸钠、或SLES)、烷基苯磺酸盐；阳离子型(以季铵阳离子为基础)十六烷基三甲基溴化铵(CTAB，亦称溴化十六烷基三甲铵)、以及其他的烷基三甲基铵盐、十六烷基氯化吡啶鐺(CPC)、聚乙氧基化牛油脂肪胺类(POEA)、苯扎氯铵(BAC)、氯化苄乙氧铵(BZT)；长链脂肪酸和它们的盐包括辛酸盐、辛酸、庚酸盐、己酸、庚酸、壬酸、癸酸等；两性离子型(两性型)十二基甜菜碱；椰油酰胺丙基甜菜碱；椰油两性甘氨酸酯(COCO ampho glycinate)；非离子型烷基聚环氧乙烷，烷基酚聚环氧乙烷，聚环氧乙烷和聚环氧丙烷的共聚物(已知商品有Poloxamers或 Poloxamines)，烷基多葡糖苷，包括辛基葡糖苷、癸基麦芽糖苷、脂肪醇(例如，鲸蜡醇和油醇)、椰油酰胺MEA、椰油酰胺DEA、聚山梨酸酯(吐温20、吐温80等)，TRITON洗涤剂、以及
十二基二甲胺氧化物。在此使用的术语“静脉内IgG”或者“IVIG”治疗一般是指通过静脉内、皮下、或肌内将IgG免疫球蛋白组合物给药于病人以便用于治疗许多适应症比如免疫缺陷、炎性疾病、以及自身免疫疾病的治疗方法。IgG免疫球蛋白典型是由血浆汇集并制备的。能够使用完整抗体或者片段。IgG免疫球蛋白能够被配制成较高的浓度(例如，大于10% )用于皮下给药，或者被配制呈用于肌内给药。这对于特异性IgG制品而言特别平常，其是以高于特异性抗原(例如，Rho D因子、百日咳毒素、破伤风毒素、肉毒杆菌毒素、狂犬病等)的平均滴度来制备。为便于论述，在本申请中，这些皮下或者肌内剂型的IgG组合物也被包含在术语 “IVIG” 中。术语“治疗有效(的)量或剂量”或者“足够(的)量/有效(的)量或剂量” 是指对给药对象产生效果的剂量。精确的剂量将取决于治疗的目的，并且将可由本领域的技术人员通过使用已知的技术而确定(参见，例如，Lieberman, Pharmaceutical Dosage Forms (第 1-3 卷，1992) ；Lloyd, The Art, Science and Technology of Pharmaceutical Compounding(1999) ；Pickar, Dosage Calculations(1999)；禾口 Remington :The Science and Practice of Pharmacy,第 20版，2003, Gennaro 编，Lippincott, Williams & Wilkins。 在此将其公开内容全部并入本文以供参考以用于所有目的)。
具体实施例方式根据现代医学中的惯常实践，浓缩的免疫球蛋白(尤其是IgG)的灭菌制品被用于治疗归入三个主要种类的医学适应症免疫缺陷、炎性疾病和自身免疫疾病、以及急性感染。一种通常使用的IgG产品一静脉内免疫球蛋白或者IVIG，被配制得例如以10%的浓度用于静脉内给药。浓缩的免疫球蛋白还可以被配制得例如以20%或者大约20%的浓度用于皮下或肌内给药。在一个方面，本发明涉及一种新的和改进的方法，用于由汇集的血浆生产高度提纯并高度浓缩的免疫球蛋白组合物。与此前使用的IgG纯化和浓缩方法相比，本发明人合并了超滤和配制步骤，可得到更高的IgG浓度而没有造成显著的IgG损失，并且在最终的配方中保持低PH。典型地，该产品的蛋白质浓度为至少18%重量/体积(w/v)，其中大多数蛋白质(通常不少于95%)是IgG，并且pH在pH 3-6的范围内，这样便于病原体比如可能存在于血浆的病毒的灭活。由于本发明的产品的较高IgG浓度和因此减小的体积，它们适合于皮下和/或肌内给药。在一些实施方式中，IgG产品的粘度不大于18毫帕斯卡-秒 (mPascal-second)，并且可以因此同样适合于静脉内给药。由于有可能将用于静脉内产品的质量属性与皮下用产品和肌内用产品所需要的高浓度相结合，所以简单的稀释也能够进行静脉内给药。本发明的IgG组合物的进一步优点是，它们在储存期间具有出色的稳定性。在某些方面，本发明提供了用于制备高度浓缩的IgG制品的方法，该制品的最终蛋白质浓度为大于大约17%并且IgG纯度为至少大约95%。在特定的实施方式中，该制品具有延长的稳定性，并且被配制成用于静脉内、皮下、和/或肌内给药。在另一个方面，本发明提供了根据在此提供的改进的制造方法而制备的药物组合物和IgG组合物配方。在特定的实施方式中，这些该组合物和配方可给出与目前市场上的其他IVIG组合物相比改进的特性。例如，在特定的实施方式中，在此提供的组合物和配方在延长的时间内是稳定的。在另一个实施方式中，在此提供的组合物和配方具有与目前市场上的其他IVIG组合物相比更高的IgG浓度。在其他的实施方式中，在此提供的组合物和配方具有更高的IgG浓度，并且在延长的时间内是稳定的。在另一个方面，本发明提供了用于治疗免疫缺陷、炎性疾病和自身免疫疾病、以及急性感染的方法，包括给药通过使用在此提供的改进方法制备的IgG组合物。
I.生产浓缩的、提纯的IgG制品已经描述了包含完整抗体的IVIG组合物被用于治疗特定的自身免疫状况(参见， 例如，美国专利公开 US 2002/0114802,US 2003/0099635、以及 US 2002/0098182)。在这些参考文献中公开的IVIG组合物包括多克隆抗体。一般地，根据本发明的免疫球蛋白制品能够由任何合适的起始原料例如回收的血浆或者原料血浆来制备。在典型实例中，由健康的供体收集血液或血浆。通常，由与免疫球蛋白制品给药对象相同的种类的动物收集血液(典型地被称作“同源”免疫球蛋白)。可通过合适的工艺将免疫球蛋白从血液中分离出来，这些工艺比如是沉淀法(醇分级分离或者聚乙二醇分级分离)、层析法(离子交换层析、亲和层析法、免疫亲和层析法)，超速离心法、 以及电泳制备法等(参见，例如，Cohn 等，J. Am. Chem. Soc. ,68 :459-75(1946) ；Oncley 等， J.Am· Chem. Soc.，71 :541-50(1949) ； Barundern 等，Vox Sang，7 157-74 (1962) ；Koblet 等， Vox Sang, 13 :93-102(1967)；美国专利Nos. 5，122，373和5，177，194 ；在此将它们的全部公开内容并入本文以供参考以用于所有目的)。不同于如上所述的方法，在一个方面，本发明提供了利用缺少冷冻的(cryo-poor) 起始原料制备浓缩的IgG组合物的方法。一般来讲，在此提供的方法同时利用改进的 Cohn-Oncley醇分级分离步骤和离子交换层析来提供优良的IgG产率，同时保持与在目前市售商品IVIG制品中发现的相同的(未进行改进时的)质量。在很多情况下，通过本领域技术人员熟知的醇分级分离和/或离子交换和亲和层析方法，由含有Y球蛋白的产品制备免疫球蛋白。通常使用纯化的Cohn组分II。起始 Cohn组分II糊剂典型地为95%或者大约95%的IgG，并且由四个IgG亚型组成。这些不同的亚型大致以与在汇集的人血浆中发现的相同的比率存在于组分II中，所述亚型由所述人血浆中获得。组分II在配制成可给药的产品之前被进一步提纯。例如，能够将组分II 糊剂溶于冷的提纯的酒精水溶液中，并且经由沉淀和过滤除去杂质。在最终过滤后，免疫球蛋白悬浮液能够进行透析或者渗滤(例如，使用标称分子量限制为小于或等于100，000道尔顿的超滤膜)来除去醇。该溶液能够被浓缩或者稀释，从而得到期望的蛋白质浓度，并且能够通过本领域技术人员熟知的技术被进一步纯化。制备步骤能够被用于富集免疫球蛋白的特定同种型或者亚型。例如，蛋白质A、蛋白质G或者蛋白质H琼脂糖凝胶层析法能够被用于富集IgG、或者特定IgG亚型的免疫球蛋白混合物(一般可参见Harlow和Lane，Using Antibodies，冷泉港实验室出版社(1999)； Harlow和Lane ,Antibodies, A Laboratory Manual (抗体实验手册)，冷泉港实验室出版社(1988)；美国专利 No. 5，180，810)。如同在下文进行的详细描述，通过具有与在生产IVIG的工艺中许多相同或者相似步骤的工艺，可生产本发明的高浓度IgG产品。具有特别设计的后洗涤和接近生产工艺结束时的配制的使用开放通道型膜(open channel membranes)的附加超滤/渗滤步骤，使得所得到的IgG组合物中蛋白质浓度与现有技术IVIG(例如GAMMAGARD LIQUID)相比要高大约两倍O00mg/mL)，且不影响产率和储存稳定性。大多数可商业购买的超滤膜不能够在没有较大蛋白质损失的情况下达到200mg/mL IgG的浓度。这些滤膜早期会被阻塞，并且因此难以实现充分的后洗涤。因此不得不使用开放通道型膜构造。即使具有开放通道型膜， 也不得不使用特定设计的后洗涤工序，以用于在没有显著的蛋白质损失的情况下(损失小于2%)得到所需要的浓度。甚至更令人惊奇的事实是，较高的蛋白质浓度200mg/mL并不影响低PH储存步骤中的病毒灭活能力。生产高浓度IgG组合物的一般工艺包括如下步骤
A.分离冷冻沉淀物纯化工艺典型地从解冻此前被冷冻的汇集的血浆开始，该血浆已经进行过安全检查和质量考察。解冻典型地在不高于6°C的温度下进行。然后通常在与解冻时一样低的温度下，在血浆刚一解冻就于冷却下进行离心或过滤以便分离固体和液体。液体部分(也称作“缺少冷冻的血浆”，在通过离心或者过滤将冷不溶性蛋白从刚解冻血浆中除去以后得至IJ)然后在下一步骤中被加工。在此时可以采用不同的附加步骤，用于分离因子VIII抑制剂旁路活性(FEIBA)、因子IX-复合物、因子VII-浓缩物、或者抗凝血酶III-复合物，在实施例1中有详细描述。
B.获得分级分离I的上清液在这一步骤中，缺少冷冻的血浆典型地被冷却至0士 1°C或者大约0士 1°C，并且其 PH被调节至7. 0或者大约7. 0。在特定的实施方式中，pH被调节至大约7. 0和大约7. 5之间、优选在7. 1或者大约7. 1与7. 3或者大约7. 3之间、最优选7. 2或者大约7. 2。在一种实施方式中，PH被调节至7. 0或者大约7. 0。在另一个实施方式中，pH被是调节至7. 1或者大约7.1。在另一个实施方式中，pH被调节至7. 2或者大约7. 2。在另一个实施方式中， PH被是调节至7. 3或者大约7. 3。在另一个实施方式中，pH被是调节至7. 4或者大约7. 4。 在另一个实施方式中，PH被是调节至7. 5或者大约7. 5。然后加入预冷的乙醇，同时搅拌血浆至乙醇为8% ν/ν的目标浓度。同时，温度被进一步降低至大约-4和大约0°C之间、优选大约-2°C，从而沉淀出污染物比如Ci2-巨球蛋白、β 1A-球蛋白和β 球蛋白、纤维蛋白原、以及因子VIII。典型地，沉淀步骤将包括保持至少大约1小时的时间，虽然可以采用较短的或者较长的保持时间。接着，然后通过离心、过滤、或者另一种合适的方法，收集理想地含有在缺少冷冻的血浆中存在的全部IgG含量的上清液(上清液I)。
C.分级分离II+III的沉淀物为了进一步提高级分的IgG含量和纯度，对上清液I进行第二次沉淀步骤。一般来讲，溶液的PH被是调节至pH在大约6. 8和大约7. 2之间、优选7. 0或者大约7. 0。然后将醇类、优选乙醇加入至溶液中，同时搅拌至终浓度在大约20%和大约25% (ν/ν)之间。在一种实施方式中，醇的终浓度为20%或者大约20%。在另一个实施方式中，醇的终浓度为 21%或者大约21%。在另一个实施方式中，醇的终浓度为22%或者大约22%。在另一个实施方式中，醇的终浓度为23%或者大约23%。在另一个实施方式中，醇的终浓度为或者大约M%。在另一个实施方式中，醇的终浓度为25%或者大约25%。液体部分，也称作组分Π+ΙΙΙ上清液，能够被进一步加工，以提取(凝血)因子V。来自该步骤的沉淀物在下一步骤中被进一步加工。在一种实施方式中，步骤B和C还可以一起进行。 P.从分级分离II和III沉淀物中提取冷萃取缓冲液被用于以在15份萃取缓冲液中1份沉淀物的典型比率来再悬浮组分Π+ΙΙΙ沉淀物。一种示例性的萃取缓冲液含有5mM磷酸二氢钠和5mM醋酸盐，pH为 4. 5士0. 2或者大约4. 5士0. 2，并且电导率为0. 7-0. 9mS/cm或者大约0. 7-0. 9mS/cm。在一种实施方式中，萃取缓冲液的电导率为0. 7mS/cm或者大约0. 7mS/cm。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的电导率为0. 8mS/cm或者大约0. 8mS/cm。在又一个实施方式中，萃取缓冲液的电导率为0. 9mS/cm或者大约0. 9mS/cm。该提取工艺在2_8°C或者大约2_8°C的温度下进行。可以采用其他合适的再悬浮比率，例如从大约1 8至大约1 30、或者从大约1 10至大约1 20、或者从大约1 12至大约1 18、或者从大约1 13至大约 1 17、或者从大约1 14至大约1 16。在特定的实施方式中，再悬浮比率可以为或者大约为 1 8、1 9、1 10、1 11、1 12、1 13、1 14、1 15、1 16、1 17、 1 18、1 19、1 20、1 21、1 22、1 23、1 24、1 25、1 26、1 27、1 28、 1 29、1 30、或者更高的比率。用于提取II+III沉淀物的合适溶液一般具有在大约4. 0和大约5. 5之间的pH。 在特定的实施方式中，溶液的PH在大约4. 0和大约5. 0之间。在另一个实施方式中，溶液的 PH为大约4. 5和大约5. 0之间。在其他的实施方式中，萃取溶液的pH为约4. 0,4. 1,4. 2、 4. 3,4. 4,4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0,5. 1,5. 2,5. 3,5. 4、或者5. 5。在一种实施方式中，萃取缓冲液的pH为4. 5或者大约4. 5。在另一个实施方式中、萃取缓冲液的pH为4. 6或者大约4.6。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的pH为4.7或者大约4.7。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的pH为4. 8或者大约4. 8。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的pH为4. 9 或者大约4. 9。在另一个实施方式中，萃取缓冲液的pH为5. 0或者大约5. 0。萃取缓冲液将优选具有从大约0. 5mS. cnT1至大约2. OmS. cnT1的电导率。例如，在特定的实施方式中，萃取缓冲液的电导率为0. 5mS. cm—1或者大约0. 5mS. cm—1，或者该电导率为或者大约为 0. 6,0. 7,0. 8,0. 9,1. 0,1. 1、1. 2,1. 3,1. 4,1. 5,1. 6,1. 7,1. 8,1. 9、或大约 2. OmS. cnT1。本领域的普通技术人员应知道如何产生具有适当电导率的萃取缓冲液。
E.热解法二氧化硅处理和过滤在一些实施方式中，将热解法二氧化硅(例如，Aerosil 380或等效物)加至来自最后步骤的悬浮液中，达到浓度为40g/kg悬浮液或者大约40g/kg悬浮液、或者相当于 1. Sg/升缺少冷冻的血浆。在大约2至8°C下发生混合至少50至70分钟。某些情况下，力口入助滤剂(例如，购自World Minerals的Hyflo-Supper-Cel，使用浓度为0. 5kg/kg悬浮液或者大约0. ^g/kg悬浮液)以便于随后的通过过滤进行液/固分离的步骤。萃取缓冲液被用于压滤的后洗涤。该过滤工序保持在大约2-8°C的温度。
F.沉淀物G的分级分离然后在大约2°C至8°C温度下搅拌至少30分钟，将来自最后步骤的滤液与聚山梨酸酯-80混合至浓度为0. 2% w/v或者大约0. 2% w/Vo然后在大约2°C至8°C温度下另外搅拌30分钟，将无水柠檬酸钠混合入溶液中，至浓度为Sg/升或者大约Sg/升。然后将溶液的PH调节至7. 0士0. 1或者大约7. 0士0. 1。在特定的实施方式中，用氢氧化钠或醋酸调节PH。然后将冷的醇加入溶液中，至浓度为25% ν/ν或者大约25% ν/ν,并且进行类似于 Cohn II的沉淀步骤。
G.沉淀物G的悬浮溶解来自最后步骤的沉淀物，并且用标称孔径为0. 2 μ m的深度过滤器(例如， Cuno VR06过滤器或等效物)进行过滤，以得到清澈的滤液。在另一个实施方式中，溶解沉淀物，然后离心，以回收澄清的上清液。
H.溶剂和洗涤剂处理来自最后步骤的滤液被用于溶剂/洗涤剂处理。典型的溶剂/洗涤剂处理混合物包含 1.0% (ν/ν)的 TRITON x-100,0. 3% (ν/ν)的吐温-80、以及 0· 3% (ν/ν)的 ΤΝΒΡ，并且该混合物被典型地在大约18°C至25°C的温度下保持至少60分钟。血浆来源组分的洗涤剂处理方法为本领域技术人员所熟知。一般来讲，任何标准的非离子型洗涤剂处理方法可以与在此提供的方法结合起来使用。
I.阳离子交换层析为了进一步从S/D(溶剂/洗涤剂)处理的PptG(沉淀物G)滤液中纯化和浓缩 IgG，可以使用阳离子交换和/或阴离子交换层析法。使用离子交换层析用于纯化和浓缩 IgG的方法为本领域技术人员所熟知。例如，美国专利No. 5，886，IM描述了一种方法，其中组分Π+ΙΙΙ沉淀物在低pH(在大约3. 8和4. 5之间)下被萃取，接着使用辛酸来沉淀IgG， 最后实施两个阴离子交换层析步骤。美国专利No. 6，069，236描述了一种层析法IgG纯化流程图，根本不依赖于醇沉淀。PCT申请公开号WO 2005/073252描述了一种IgG纯化方法，其包括组分Π+ΙΙΙ沉淀物的提取、辛酸处理、PEG处理、以及单一阴离子交换层析步骤。美国专利No. 7，186，410描述了一种IgG纯化方法，其包括提取组分I+II+III沉淀物或者组分 II沉淀物两者之一、接着在碱性PH下进行单一阴离子交换步骤。美国专利No. 7，553，938 描述了一种方法，其包括提取组分I+II+III沉淀物或组分II+III沉淀物两者之一、辛酸盐处理、以及一个或两个阴离子交换层析步骤。美国专利No. 6，093，324描述了一种纯化方法，其包括在大约6. 0和大约6. 6之间的pH下使用大孔阴离子交换树脂进行操作。美国专利No. 6，835，379描述了一种纯化方法，其在没有醇分级分离的情况下依赖于阳离子交换层析。在一种实施方式中，使含有来自最后步骤的蛋白质溶液的溶剂/洗涤剂然后经过阳离子交换柱，以除去溶剂和洗涤剂。在洗出SD试剂(溶剂洗涤剂)后，被吸附的蛋白质然后被用高PH洗脱缓冲液洗脱。在一种实施方式中，洗脱缓冲液的pH在大约7. 5和大约 9. 5之间。在另一个实施方式中，洗脱缓冲液的pH在大约8.0和大约9.0之间。在一种优选的实施方式中，洗脱缓冲液的PH为8.5士0. 1或者为大约8.5士0. 1。
T.阴离子交换层析来自最后步骤的洗脱液被调节至pH 6，并且被稀释至适当的电导率，用于下述平衡后的阴离子交换柱。收集在加样和洗涤期间的柱子流过液(flow-through)，用于进一步加工。
K.纳滤
为了进一步降低在此提供的IgG组合物的病毒载量，可以使用合适的纳滤装置对阴离子交换柱流出液进行纳滤。在特定的实施方式中，纳滤装置将具有在大约15nm和大约200nm之间的平均孔径。适合这一应用的纳滤器的例子包括，但不限于DVD、DV 50、DV 20 (Pall)、Viresolve NFP, Viresolve NFR(MiIlipore 公司)、Planova 15N、20N、35N、以及 75N(Planova)。在一个特定的实施方式中，纳滤器的平均孔径可以在大约15nm和大约72nm 之间、或者在大约19nm和大约35nm之间、或者为或大约为15nm、19nm、35nm或72nm。在一种优选实施方式中，纳滤器的平均孔径为35nm或者大约35nm，比如Asahi PLANOVA 35N过滤器或其等效物。
L-超滤和渗滤在纳滤之后，通过超滤将滤液进一步浓缩至蛋白质浓度为5士 w/v。在一些实施例中，在具有开放通道筛(open channel screen)的盒中进行超滤，并且超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)为50kDa以下。在一种实施方式中，纳滤滤液可以通过超滤被浓缩至蛋白质浓度在大约2% (w/ ν)和大约10% (w/v)之间。在特定的实施方式中，在具有开放通道筛的盒中进行超滤，并且超滤膜的标称截止分子量(NMWCO)小于大约IOOkDa或低于大约90、80、70、60、50、40、30、 或更小kDa。在一种优选的实施方式中，超滤膜的NMWCO不超过50kDa。当超滤步骤完成后，浓缩物可以相对于适合于静脉内给药或肌内给药的溶液经由渗滤被进一步浓缩。在特定的实施方式中，渗滤溶液可以包含稳定剂和/或缓冲剂。在一种优选实施方式中，稳定和缓冲剂是适当浓度的甘氨酸，该浓度例如在大约0. 20M和大约 0. 30M之间、或者在大约0. 22M和大约0. 28M之间、或者在大约0. 24M和大约0. ^mM之间， 或者该浓度为或者大约为2. 0,2. 1,2. 2,2. 3,2. 4,2. 5,2. 6,2. 7,2. 8,2. 9、或者3. O。在优选的实施方式中，渗滤缓冲液含有0. 25M或者大约0. 25M的甘氨酸。在一种优选的实施方式中，在完成超滤步骤后，浓缩物相对于低pH的0. 25M甘氨酸溶液进行渗滤。典型地，最小的交换体积是6倍于原始浓缩物的体积，并且溶液被浓缩至蛋白质浓度超过20% w/v。在渗滤和浓缩工艺结束时，溶液的pH典型地是在4. 4至4. 9之间。典型地，最小交换体积是至少大约3倍于原始浓缩物体积、或者至少大约4、5、6、 7、8、9倍、或者更多倍于原始浓缩物体积。IgG溶液可以被浓缩至最终蛋白质浓度在大约 5%和大约22% (w/v)之间、或者在大约10%和大约22% (w/v)之间、或者在大约15%和大约22% (w/v)之间、或者在大约18%和大约22% (w/v)之间、或者在大约20%和大约 22%之间，或者被浓缩至最终蛋白质浓度为或者大约为S^j^j^^S^j^UO^Ul^、 12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、或更高。在一种优选实施方式中，IgG溶液将被浓缩至最终蛋白质浓度在20%或者大约20%和大约22%或者22% 之间。典型地，在浓缩过程结束时，溶液的PH是在大约4. 6至5. 1之间。
M.配制在渗滤步骤完成后，溶液的蛋白质浓度被用渗滤缓冲液调节至终浓度在大约5% 和大约20% (w/v)之间、或者在大约10%和大约20% (w/v)之间、或者在大约15%和大约20% (w/v)之间、或者在大约18%和大约20% (w/v)之间，或者被调节至终浓度为大约 5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、或 20%。在一种优选实施方式中，溶液的最终蛋白质浓度在19%或者大约19%和21%之间或者大约21 %。在一种优选实施方式中，在渗滤完成后，溶液的蛋白质浓度被用渗滤缓冲液调节至稍微高于20% w/v，例如，为20. 4 士 04% w/v或者大约20. 4 士 04% w/v。 N.讲一步灭菌配制的整体溶液通过首次经过具有0. 2微米以下绝对孔径的膜滤器过滤而被进一步灭菌。然后溶液被无菌地分配入最终的容器中，进行适当的密封，取样用于测试。最后的步骤是在30至32°C下将密封的容器储存一段延长的时间例如21至22天。
II.浓缩的IgG组合物在一个方面，本发明涉及通过在此提供的方法制备的含水的IgG组合物。一般来讲，通过在此描述的新颖方法制备的IgG组合物将具有较高的IgG含量和纯度。例如，在此提供的IgG组合物可以具有至少大约15% (w/v)的蛋白质浓度，并且IgG含量大于90%纯度。这些高纯度IgG组合物适合于治疗性给药，例如，用于皮下给药和/或肌内给药。在一种实施方式中，在此提供的IgG组合物适合于例如在给药之前通过稀释用于静脉内给药。 在一种实施方式中，IgG的浓度为20%或者大约20%，并且用于皮下给药或者肌内给药。在一种实施方式中，本发明提供一种通过包括下述步骤的方法制备的含水的IgG 组合物
(1)通过离心，从血浆中分离出液体和沉淀物；
(2)将预冷的乙醇与来自步骤(1)的液体混合，从而形成混合物，其乙醇浓度为8%(ν/ ν)或者大约8% (ν/ν)；
(3)通过离心，从来自步骤O)的混合物中分离出液体和沉淀物；
(4)将来自步骤(3)的液体的ρΗ和乙醇浓度分别调节为7.0或者大约7.0、和20-25% (ν/ν)或者大约20-25% (ν/ν)，借此形成混合物；
(5)通过离心，从来自步骤的混合物中分离出液体和沉淀物；
(6)将来自步骤(5)的沉淀物用缓冲液以大约1比15的重量比再悬浮，从而形成悬浮
液；
(7)将二氧化硅(SiO2)与来自步骤(6)的悬浮液相混合，并通过过滤得到滤液；
(8)将洗涤剂和冷的醇与来自步骤(7)的滤液相混和，并通过离心得到沉淀物；
(9)将沉淀物溶解于含有溶剂或者洗涤剂的水溶液中，并维持溶液至少60分钟；
(10)在步骤(9)之后，使溶液通过阳离子交换层析柱，并且将吸附在柱子上的蛋白质洗脱于洗脱液中；
(11)使来自步骤(10)的洗脱液通过阴离子交换层析柱，产生流出液；
(12)使流出液通过纳滤器，产生纳滤滤液；
(13)使纳滤滤液通过超滤膜，产生超滤液；
(14)相对于渗滤缓冲液，对超滤液进行渗滤，产生蛋白质浓度为20%(w/v)或者大约 20% (w/v)的溶液；以及
(15)通过使来自步骤(14)的溶液经过0.2μπι以下的过滤器过滤来对溶液进行灭菌， 借此获得浓缩IgG的组合物。在一种实施方式中，本发明提供的含水的IgG组合物所包含的蛋白质浓度在大约 150g/L和大约250g/L之间。在特定的实施方式中，IgG组合物的蛋白质浓度是在大约175g/L和大约225g/L之间、或者在大约200g/L和大约225g/L之间、或者是这些范围内的任何合适浓度，例如浓度为或者大约为 150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180g/L、 185g/L、190g/L、195g/L、200g/L、205g/L、210g/L、215g/L、220g/L、225g/L、230g/L、235g/L、 240g/L、M5g/L、250g/L、或更高。在一种优选实施方式中，含水的IgG组合物包含的蛋白质浓度为200g/L或者大约200g/L。在尤其优选的实施方式中，含水的IgG组合物包含的蛋白质浓度为204g/L或者大约204g/L。在此提供的方法允许IgG组合物制品具有非常高水平的纯度。例如，在一种实施方式中，在此提供的组合物中至少大约95%的总蛋白是IgG。在其他实施方式中，至少大约 96%的蛋白质是IgG，或者组合物的总蛋白中至少大约97^^98^^99^^99. 5%、或者更多是 IgG0类似地，在此提供的方法允许IgG组合物制品含有极低水平的污染剂。例如，在特定的实施方式中，IgG组合物只含有少于大约100mg/L的IgA。在其他实施方式中，IgG组合物含有少于大约50mg/L的IgA、优选少于大约35mg/L的IgA、最优选少于大约20mg/L的 IgA。
III.药物组合物在另一个方面，本发明提供包含通过在此提供的方法制备的纯化IgG的药物组合物和配方。一般来讲，通过在此描述的新颖方法所制备的药物组合物和配方将具有较高的 IgG含量和纯度。例如，在此提供的药物组合物和配方可以具有至少大约15% (w/v)的蛋白质浓度，并且IgG含量大于90%纯度。这些高纯度IgG组合物适合于治疗性给药，例如， 用于皮下给药和/或肌内给药。在一种实施方式中，在此提供的IgG组合物适合于例如在给药之前通过稀释用于静脉内给药。在一种实施方式中，IgG的浓度为20%或者大约20%， 并且用于皮下给药或者肌内给药。在一种实施方式中，通过配制含水的IgG组合物制备出在此提供的药物组合物， 所述含水的IgG组合物是通过使用在此提供的方法所分离出来的。一般来讲，配制的组合物已经经受过至少一个、优选至少两个、最优选至少三个灭活或除去病毒的步骤。在此提供的方法中可以使用的病毒灭活或除去步骤的非限制性例子包括溶剂洗涤剂处理 (Horowitz et al.，Blood Coagul Fibrinolysis，1994(5 期增补 3) :S21_S28 和 Kreil et al. , Transfusion, 2003 (43) :1023_1028，在此明确地将这两个文献的全部内容并入本文以供参考以用于所有目的)、纳滤(Hamamoto et al.，Vox Sang，1989 (56) 230-236 和 Yuasa et al.，J Gen Virol. 1991 (72 (pt 8)) :2021_2024，在此明确地将这两篇文献的全部内容并入本文以供参考以用于所有目的)、以及高温下低PH温育(Kempf et al., Transfusion. 1991(31)423-427 和 Louie et al.，Biologicals. 1994(22) :13-19)。在特定的实施方式中，提供的药物配方具有在大约175g/L IgG和大约225g/L IgG 之间的IgG含量。一般来讲，通过使用在此描述的方法从血浆中分离IgG组合物、浓缩组合物、以及在适合静脉内给药的溶液中配制浓缩物组合物，制备出这些IVIG配方。可以使用本领域的技术人员已知的任何合适的方法来浓缩IgG组合物。在一种实施方式中，组合物通过超滤/渗滤进行浓缩。在一些实施方式中，用于浓缩组合物的超滤装置将使用标称截止分子量(NMWCO)小于大约IOOkDa或低于大约90、80、70、60、50、40、30、或更小kDa的超滤膜。在一种优选的实施方式中，超滤膜的NMWCO不超过50kDa。可以通过使用本领域的技术人员已知的任何合适的技术来实现缓冲液交换。在一个特定的实施方式中，通过渗滤实现缓冲液交换。在一个特定的实施方式中，提供IgG的药物组合物，其中，通过使用包括下述步骤的方法从血浆中纯化IgG组合物
(1)通过离心，从血浆中分离出液体和沉淀物；
(2)将预冷的乙醇与来自步骤(1)的液体混合，从而形成混合物，其乙醇浓度为8%(ν/ ν)或者大约8% (ν/ν)；
(3)通过离心，从来自步骤O)的混合物中分离出液体和沉淀物；
(4)将来自步骤(3)的液体的ρΗ和乙醇浓度分别调节为7.0或者大约7.0、和20-25% (ν/ν)或者大约20-25% (ν/ν)，借此形成混合物；
(5)通过离心，从来自步骤的混合物中分离出液体和沉淀物；
(6)将来自步骤(5)的沉淀物用缓冲液以大约1比15的重量比再悬浮，从而形成悬浮
液；
(7)将二氧化硅(SiO2)与来自步骤(6)的悬浮液相混合，并通过过滤得到滤液；
(8)将洗涤剂和冷的醇与来自步骤(7)的滤液相混和，并通过离心得到沉淀物；
(9)将沉淀物溶解于含有溶剂或者洗涤剂的水溶液中，并维持溶液至少60分钟；
(10)在步骤(9)之后，使溶液通过阳离子交换层析柱，并且将吸附在柱子上的蛋白质洗脱于洗脱液中；
(11)使来自步骤(10)的洗脱液通过阴离子交换层析柱，产生流出液；
(12)使流出液通过纳滤器，产生纳滤滤液；
(13)使纳滤滤液通过超滤膜，产生超滤液；
(14)相对于渗滤缓冲液，对超滤液进行渗滤，产生蛋白质浓度为大约20%(w/v)的溶液；以及
(15)通过0.2μπι以下的过滤器过滤来自步骤(14)的溶液来对该溶液进行灭菌，借此获得浓缩IgG的组合物。在一种实施方式中，本发明提供的药物IgG组合物所包含的蛋白质浓度在大约 150g/L和大约250g/L之间。在特定的实施方式中，IgG组合物的蛋白质浓度是在大约175g/ L和大约225g/L之间、或者在大约200g/L和大约225g/L之间、或者是这些范围内的任何合适浓度，例如浓度为或者大约为 150g/L、155g/L、160g/L、165g/L、170g/L、175g/L、180g/L、 185g/L、190g/L、195g/L、200g/L、205g/L、210g/L、215g/L、220g/L、225g/L、230g/L、235g/L、 240g/L、M5g/L、250g/L、或更高。在一种优选实施方式中，含水的IgG组合物包含的蛋白质浓度为200g/L或者大约200g/L。在尤其优选的实施方式中，含水的IgG组合物包含的蛋白质浓度为204g/L或者大约204g/L。在此提供的方法允许IgG药物组合物制品具有非常高水平的纯度。例如，在一种实施方式中，在此提供的组合物中至少大约95%的总蛋白是IgG。在其他实施方式中，至少大约96%的蛋白质是IgG，或者组合物的总蛋白中至少大约97^^98^^99^^99. 5%、或者更多是IgG。类似地，在此提供的方法允许IgG药物组合物制品含有极低水平的污染剂。例如， 在特定的实施方式中，IgG组合物只含有少于大约100mg/L的IgA。在其他实施方式中，IgG组合物含有少于大约50mg/L的IgA、优选少于大约35mg/L的IgA、最优选少于大约20mg/L 的 IgA。在此提供的药物组合物将典型地包含一种以上适合静脉内给药的缓冲剂或者pH 稳定剂。适合于配制在此提供的IgG组合物的缓冲剂的非限制性例子包括甘氨酸、柠檬酸盐、磷酸盐、醋酸盐、谷氨酸盐、酒石酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、组氨酸或者其他的氨基酸、葡糖酸盐、苹果酸盐、琥珀酸盐、甲酸盐、丙酸盐、碳酸盐、或者它们的调节至适当PH的任何组合物。一般来讲，缓冲剂将在延长的时间内足以保持配方中合适的pH。在一种优选实施方式中，缓冲剂是甘氨酸。在一些实施方式中，在配方中缓冲剂的浓度是在大约IOOmM和大约400mM之间、优选在大约150mM和大约350mM之间、更优选在大约150mM和大约300mM之间、最优选在大约175mM和大约225mM之间。在尤其优选的实施方式中，浓缩的IgG组合物将包含在大约 150mM和大约250mM之间的甘氨酸、最优选大约200mM的甘氨酸。在另一种优选的实施方式中，浓缩的IgG组合物将含有250mM或者大约250mM的甘氨酸。在特定的实施方式中，配方的pH将是在大约4. 1和大约5. 6之间、优选在大约4. 4 和大约5. 3之间、最优选在大约4. 6和大约5. 1之间。在具体的实施方式中，配方的pH可以是大约 4. 1,4. 2,4. 3,4. 4,4. 5,4. 6,4. 7,4. 8,4. 9,5. 0,5. 1,5. 2,5. 3,5. 4,5. 5、或 5. 6。在一些实施方式中，在此提供的药物组合物可以任选地进一步包含用于调节组合物摩尔渗透压浓度的试剂。摩尔渗透压浓度试剂的非限制性例子包括甘露糖醇、山梨糖醇、 甘油、蔗糖、葡萄糖、右旋糖、果糖、左旋糖、乳糖、聚乙二醇、磷酸盐、氯化钠、氯化钾、氯化钙、葡糖酸葡庚糖酸钙(calcium gluconoglucoh印tonate)、二甲基砜等。典型地，在此提供的配方将具有与生理学摩尔渗透压浓度相当的摩尔渗透压浓度，大约为 285 至 295m0smol/kg(Lacy et al. , Drug Information Handbook-Lexi-Comp, 1999 :1254)。在特定的实施方式中，配方的摩尔渗透压浓度将是在大约200m0Smol/kg和大约350m0smOl/kg之间、优选在大约240和大约300m0Smol/kg之间。在具体的实施方式中，配方的摩尔渗透压浓度将是大约200m0smol/kg、或者210m0smol/kg、220m0smol/kg、 230m0smol/kg、240m0smol/kg、245m0smol/kg、250m0smol/kg、255m0smol/kg、260m0smol/ kg、265m0smol/kg、270m0smol/kg、275m0smol/kg、280m0smol/kg、285m0smol/kg、 290m0smol/kg、295m0smol/kg、300m0smol/kg、310m0smol/kg、320m0smol/kg、330m0smol/ kg、340m0smol/kg、340m0smol/kg、或者 350m0smol/kgo在此提供的IgG配方一般呈液体形式，在延长的时间内是稳定的。在特定的实施方式中，在室温下配方可稳定至少大约3个月、或者在室温下可稳定至少大约4、5、6、7、8、 9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、或 24 个月。在冷藏条件下(典型地在大约2°C和大约8°C之间)该配方一般可稳定至少大约18个月，或者在冷藏条件下可稳定至少大约 21、M、27、30、33、36、39、42 或 45 个月。
IV. IgG制品的给药根据现代医学中的惯常实践，浓缩的免疫球蛋白(尤其是IgG)的灭菌制品被用于治疗归入三个主要种类的医学适应症免疫缺陷、炎性疾病和自身免疫疾病、以及急性感染。这些IgG制品还可以用于治疗多发性硬化(尤其复发-缓解型多发性硬化或RRMS)、阿尔茨海默氏病、以及帕金森氏症。本发明的纯化的IgG制品适合于这些目的，以及其他临床接受的IgG制品的用途。FDA(美国食品与药物管理局)已经批准IVIG治疗多种适应症的用途，这些适应症包括异源骨髓移植、慢性淋巴细胞性白血病、特发性血小板减少性紫癜(ITP)、小儿HIV、 原发性免疫缺陷、川崎氏病、慢性炎性脱髓鞘多神经病(CIDP)、以及具有高抗体受体或者具有ABO不相容供体的肾移植。在特定的实施方式中，在此提供的IVIG组合物可用于治疗或处置这些疾病和适应症。此外，用于IVIG的标示外使用通常被提供给病人用于治疗或处置多种适应症， 例如慢性疲劳综合症、顽固梭状芽孢杆菌结肠炎(Clostridium difficile colitis)、 皮肤肌炎和多肌炎、格雷夫氏眼病(Graves ‘ ophthalmopathy)、吉兰-巴雷综合症(Guillain-Barre)、肌肉萎缩、包含体肌炎、兰伯特-伊顿综合症(Lambert-Eaton syndrome)、红斑狼疮、多灶性运动神经病、多发性硬化(MQ、重症肌无力、新生儿同种免疫血小板减少症、细小病毒B19感染、天疱疮、输血后紫癜、肾移植排斥、自然流产/流产、僵硬人综合症(stiff person syndrome)、眼阵挛肌阵挛、成年危重病人的严重脓毒病和脓毒性休克、中毒性表皮坏死溶解、慢性淋巴细胞性白血病、多发性骨髓瘤、X-连锁无丙种球蛋白血症、以及低丙种球蛋白血症。在特定的实施方式中，在此提供的IVIG组合物可用于治疗或处置这些疾病和适应症。最后，IVIG用于治疗或处置包括原发性免疫缺陷、RRMS、阿尔茨海默氏病、 以及帕金森氏症在内的疾病的试验性应用已经被建议(参见美国专利申请公开 No. 2009/0148463，在此其全部内容并入本文以供参考以用于所有目的)。在特定的实施方式中，在此提供的IVIG组合物可用于治疗或处置原发性免疫缺陷、RRMS、阿尔茨海默氏病、 或者帕金森氏症。在包含每天给药的特定实施方式中，给药于个体的有效量可以由内科医师确定，还应考虑到在年龄、体重、罹病度、给药途径(例如，是静脉内还是皮下)和对治疗的反应中的个体差异。在特定的实施方式中，能够将本发明的免疫球蛋白制品以每天大约 5mg/公斤至大约2000mg/公斤的剂量给药于个体。在附加的实施方式中，免疫球蛋白制品能够以至少大约IOmg/公斤、至少15mg/公斤、至少20mg/公斤、至少25mg/公斤、至少 30mg/公斤、或者至少50mg/公斤的量被给药。在附加的实施方式中，能够将免疫球蛋白制品以直至每天大约IOOmg/公斤、大约150mg/公斤、大约200mg/公斤、大约250mg/公斤、大约300mg/公斤、大约400mg/公斤的剂量给药于个体。在其他实施方式中，免疫球蛋白制品的剂量能够更大或更小。进一步地，能够以每天一个以上剂量给药该免疫球蛋白制品。熟悉通过IgG制品治疗的疾病的临床医生能够根据本技术领域已知的标准来确定用于病人的合适剂量。可配制一个通常使用的IgG产品一静脉内免疫球蛋白或IVIG以用于静脉内给药。因为本发明的IgG制品已经达到格外高的免疫球蛋白浓度(20%W/v以上)，其可显著地降低用于治疗性有效剂量的体积。本发明的组合物特别有利于皮下给药和/或肌内给药于病人，尽管静脉内给药仍然是可选择的给药方式。术语“有效量”指的是免疫球蛋白制品、特别是IgG制品的量，该量可导致在个体中要治疗的医学状况(例如，原发性免疫缺陷、RRMS、阿尔茨海默氏病、帕金森氏症等)的改善或补救。给药于个体的有效量可以由内科医师确定，还应考虑到在年龄、体重、罹病度、 给药途径(例如，是静脉内还是皮下)和对治疗的反应中的个体差异。在特定的实施方式中，能够将本发明的免疫球蛋白制品以每天大约5mg/公斤至大约2000mg/公斤的剂量给药于个体。在附加的实施方式中，免疫球蛋白制品能够以至少大约IOmg/公斤、至少15mg/公斤、至少20mg/公斤、至少25mg/公斤、至少30mg/公斤、或者至少50mg/公斤的量被给药。 在附加的实施方式中，能够将免疫球蛋白制品以直至每天大约IOOmg/公斤、大约150mg/公斤、大约200mg/公斤、大约250mg/公斤、大约300mg/公斤、大约400mg/公斤的剂量给药于个体。在其他实施方式中，免疫球蛋白制品的剂量能够更大或更小。进一步地，能够以每天一个以上剂量给药该免疫球蛋白制品。熟悉通过IgG制品治疗的疾病的临床医生能够根据本技术领域已知的标准来确定用于病人的合适剂量。在特定的实施方式中，能够将浓缩IgG制品以每次给药约5mg/公斤至约2000mg/ 公斤的剂量给药于个体。在特定的实施方式中，剂量可以是至少大约5mg/kg，或者是至少大约 10mg/kg，或者是至少大约 20mg/kg、30mg/kg、40mg/kg、50mg/kg、60mg/kg、70mg/kg、 80mg/kg、90mg/kg、100mg/kg、125mg/kg、150mg/kg、175mg/kg、200mg/kg、250mg/kg、300mg/ kg、350mg/kg、400mg/kg、450mg/kg、500mg/kg、550mg/kg、600mg/kg、650mg/kg、700mg/kg、 750mg/kg、800mg/kg、850mg/kg、900mg/kg、950mg/kg、1000mg/kg、1100mg/kg、1200mg/kg、 1300mg/kg、1400mg/kg、1500mg/kg、1600mg/kg、1700mg/kg、1800mg/kg、1900mg/kg、或至少大约 2000mg/kg。根据本发明，完成一个疗程所需要的时间可以由内科医师确定，并且其范围可以是短至一天至超过一个月。在特定的实施方式中，一个疗程可能是从1个月到6个月。浓缩IgG治疗的剂量和频率尤其取决于如下因素被治疗的疾病或症状、以及病人中疾病或症状的严重程度。一般来讲，对于原发性免疫机能障碍，大约每3至4周在大约 100mg/kg和大约400mg/kg体重之间的剂量将被给药。对于神经学疾病和自身免疫疾病，在 3个至6个月期间实施直至2g/kg体重的剂量，5天一疗程，一月一次。这一般补充有维持治疗，该维持治疗包括大约每3至4周一次给药在大约100mg/kg和大约400mg/kg体重之间的剂量。一般来讲，病人将会接受大约每14至35天一次、或者大约每21至观天一次的剂量或者治疗。治疗的频率尤其取决于如下因素被治疗的疾病或症状、以及病人的疾病或症状的严重程度。在一种优选的实施方式中，提供一种治疗在需要该治疗的人中的免疫缺陷、自身免疫病、或者急性感染的方法，该方法包括给药本发明的药物IgG组合物。
实施例提供的下述实施例仅用于说明，并不用于限定。本领域的技术人员将容易地识别多种非关键性参数，这些参数能够被改变或者变化，以产生基本上相同或者相似的结果。
1.目的该研究的目的是，将在较高蛋白质浓度下的低pH储存稳定性(0.25M甘氨酸，pH 4. 4-4. 9，如在浓缩溶液中所测量的)与目前可用于肌内注射和皮下注射的免疫球蛋白的中性PH配方(22. 5g/l甘氨酸，3g/l NaCl pH 7)的储存稳定性相比较。
2.试验设计所有轮次的试验都从将纳滤滤液浓缩至5%蛋白质开始。相对于0. 15M甘氨酸(所研究的最低甘氨酸浓度)进行十倍的缓冲液交换，接着最后浓缩至高于20%蛋白质的目标值。而对于第一组实验，使用分子截止量为30K的0. 5m2聚醚砜Millipore滤膜(普通筛子)。第二组实验使用具有开放筛的0. 5m2聚醚砜Mi 11 ipore滤膜来进行，该开放筛更适合于较高粘度的溶液，并且后洗涤组分通过具有较低滤膜表面(0. lm2，开放筛)的第二个超滤 /渗滤装置被浓缩，以便降低产率损失。最终的容器或者被以低PH配制并储存，或者以整体形式进行低pH储存，此后在储存之前它们被以中性PH配制。
表1 超滤/渗滤步骤(30K聚醚砜滤膜)和最终的容器pH的概要
权利要求
1.一种含水组合物，其每升组合物包含超过大约180克的蛋白质，其中至少95%的蛋白质是IgG。
2.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，该组合物是通过用于获得适用于皮下和静脉内给药的产品的方法制造的，并且能够在最终容器中在升高的温度下进行处理，以使病毒灭活，而其浓度可在10至22%蛋白质的范围之间任意调节。
3.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述IgG是人IgG。
4.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，所述蛋白质浓度是大约20%(w/v) 0
5.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，还包含大约0.1-0. 3M的甘氨酸。
6.如权利要求1所述的组合物，其特征在于，其PH为约3-6。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，其pH为约4-6。
8.在一种用于由血浆制备浓缩IgG的组合物的方法中，改进之处包括下述步骤(1)通过超滤，将血浆制品中的蛋白质浓缩至约5%(w/v)；(2)通过渗滤，将所述制品中的蛋白质进一步浓缩至约20%(w/v),其中至少95%的蛋白质是IgG。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(1)是使用标称截止分子量(NMWCO)为 IOOkDa以下的超滤膜进行的。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，步骤(2)是相对于pH为4.2 士0. 1的甘氨酸渗滤缓冲液进行。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，所述渗滤缓冲液具有0.25M的甘氨酸，并且pH为4. 0。
12.如权利要求8所述的方法，其特征在于，在步骤(2)之后蛋白质浓度高于20%(w/ ν)，并且随后用渗滤缓冲液调节至约20% (w/v) 0
13.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述IgG是人IgG。
14.一种由血浆制备浓缩IgG的组合物的方法，其包括下述步骤(1)通过离心，从血浆中分离出液体和沉淀物；(2)将预冷的乙醇与来自步骤(1)的液体混合，从而形成混合物，其乙醇浓度为约8% (ν/ν)；(3)通过离心，从来自步骤O)的混合物中分离出液体和沉淀物；(4)将来自步骤(3)的液体的pH和乙醇浓度分别调节为大约7.0、和大约20-25%(ν/ ν)，借此形成混合物；(5)通过离心，从来自步骤的混合物中分离出液体和沉淀物；(6)将来自步骤(5)的沉淀物用缓冲液以大约1比15的重量比再悬浮，从而形成悬浮液；(7)将二氧化硅(SiO2)与来自步骤(6)的悬浮液相混合，并通过过滤得到滤液；(8)将洗涤剂和冷的醇与来自步骤(7)的滤液相混和，并通过离心得到沉淀物；(9)将沉淀物溶解于含有溶剂或者洗涤剂的水溶液中，并维持溶液至少60分钟；(10)在步骤(9)之后，使溶液通过阳离子交换层析柱，并且将吸附在柱子上的蛋白质洗脱于洗脱液中；(11)使来自步骤(10)的洗脱液通过阴离子交换层析柱，产生流出液；(12)使流出液通过纳滤器，产生纳滤滤液；(13)使纳滤滤液通过超滤膜，产生超滤液；(14)相对于渗滤缓冲液，对超滤液进行渗滤，产生蛋白质浓度为大约20%(w/v)的溶液；以及(15)通过使来自步骤(14)的溶液通过0.2μπι以下的过滤器过滤，对所述溶液进行灭菌，借此获得浓缩IgG的组合物。
15.如权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括将密封容器在大约30至32°C下储存大约21至22天的步骤。
16.如权利要求14所述的方法，其特征在于，还包括配制步骤，以使得20%IgG的产品与现有技术静脉内配方的10% IgG的产品一样的稳定。
17.一种通过如权利要求14-15中任一项所述方法生产的含水组合物，其包含至少 18% (w/v)的免疫球蛋白。
18.如权利要求17所述的组合物，其特征在于，包含至少20%(w/v)的免疫球蛋白。
19.一种用于治疗罹患免疫缺陷、自身免疫病、或急性感染的病人的方法，包括将有效量的如权利要求1-6和17-18中任一项所述的组合物给药于病人。
全文摘要
本发明涉及一种用于由汇集的血浆制备用于皮下注射的高度浓缩的免疫球蛋白组合物的新的改进的方法。还描述了一种包含20％以上免疫球蛋白的组合物，适合于皮下使用。
文档编号C07K16/06GK102459331SQ201080032613
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者A·普列夫利亚科维奇, B·克尔布尔, G·珀尔斯勒, H·A·巴特维克, H-P·施瓦茨, J·金德曼, N·尼科利奇, T·F·鲍尔, W·特施纳 申请人:巴克斯特保健股份有限公司, 巴克斯特国际公司