专利名称：用于治疗或预防眼病的TNFα拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合的制作方法
用于治疗或预防眼病的TNF α拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合
背景技术：
视力损耗(Vision loss)已经成为发达经济的一个主要健康问题。失明或视力不良影响着超过300万40岁以上的美国公民，且这随着年龄显著增加。例如，年龄为80岁或以上的那些人占美国人口的约8%，但是尽管如此，占失明的几乎70%。通常与年龄有关的眼病包括年龄相关性黄斑变性(AMD)、白内障、糖尿病黄斑水肿、视网膜静脉阻塞(RVO)和青光眼。年龄相关性黄斑变性(AMD)是发达国家中失明的主要原因。AMD存在2个主要的临床表现。萎缩性(干燥性)AMD的特征在于视网膜色素上皮(RPE)和视神经视网膜的变性。萎缩性AMD的早期与玻璃疣在RPE细胞层下的形成有关。早期的萎缩性AMD可以发展成晚期疾病，其中RPE彻底变性，并在黄斑区域中形成边界清楚的RPE萎缩区域“地理性萎缩”。在该疾病形式中，RPE的变性导致黄斑视杆和视锥的继发性死亡，且在这些情况下，这会导致严重的年龄相关的视力损耗。一部分AMD患者会发展，可以视作所述疾病的不同形式或另一种并发症。大约10-20%的AMD患者会发展脉络膜新血管生成(CNV)。当发生时， 该疾病形式称作“湿性AMD”，且这可以与一些最严重的视力损耗相关联。在湿性AMD中，新的脉络膜血管生长穿过玻璃膜中的裂缝，并增殖进入RPE和视神经视网膜中以及下面。目前没有确定的方式用于治疗非常流行的萎缩型AMD，也没有确定的方式用于防止早期干燥的 AMD 发展成地理性萎缩或湿性 AMD (Petrukhin K, Expert Opin Ther Targets (2007) 11: 625-639)。糖尿病黄斑水肿(DME)是糖尿病患者的阅读视力损耗的最常见的原因。01^在四岁或以上的已经具有糖尿病的个体中的患病率是大约30% (Klein R等人Ophthalmology 1984: 91; 1464-1474)。DME与IL-6、VEGF和其它细胞因子的水平的增加有关，存在血液-视网膜屏障的泛化故障，从异常的视网膜毛细血管渗漏，并在视网膜下空间形成微动脉瘤。当前的DME治疗的目标是，减轻水肿和渗漏，产生提高的视敏度。良好的血糖控制和激光光凝术或抗血管生成治疗的目标是，防止或延迟糖尿病眼的中央黄斑区的进一步衰退。还已经使用皮质类固醇的玻璃体内注射。在穿过视网膜静脉的血流阻塞以后，发生视网膜静脉阻塞。这可能是由于紧密关联的视网膜动脉中的血块形成或压力增加(由糖尿病、青光眼或高血压引起)。流出视网膜的血流量的减少，会导致眼血管中血压的泛化增加和眼中氧水平的降低。这又会导致异常的血管生长、出血和水肿、组织损伤和视力损耗。RVO存在2个主要形式视网膜分支静脉阻塞(BRVO)和视网膜中央静脉阻塞(CRVO)。突然的视力模糊或视力损耗是RVO的常见特征。眼内的皮质类固醇已经被用于治疗RV0，尽管具有相关的白内障发展和眼内压升高的危险(Kiernan DF 等人 Exp Opinion in Pharmacotherapy 2009 10(15) 2511-2525)。RVO 的患病率是 0. 2% (CRVO)至 0. 7% (BRVO)。葡萄膜炎主要影响工作年龄的人，且包括葡萄膜(虹膜、睫状体和脉络膜)的炎症。前葡萄膜炎是葡萄膜炎的最常见形式，占葡萄膜炎病例的约75%，它主要影响虹膜和睫状体。葡萄膜炎被视作一种自身免疫病，并且病原学仍然未知。在约50%的病例中，存在与HLA-B27的关联。涉及后葡萄膜(即脉络膜)的炎症被称作后葡萄膜炎，且视网膜的继发累及是常见的。葡萄膜炎主要是，⑶4 T-细胞浸润进眼隔室中的炎性疾病(Paroli MP等人2007 17(6) 938-942 Eur J Ophthalmology) 0皮质类固醇仍然是治疗的主要药物，局部地眼周地或全身地给药。TNF-α (肿瘤坏死因子-α)是一种促炎细胞因子，其已经与许多眼炎症相关联 (Theodossiadis ^A , Am. J. Ophthalmol. (2009) 147: 825—830)。已知VEGF (血管内皮生长因子)和VEGF-受体会刺激脉络膜血管和视网膜血管的血管生成，并调节这些血管的血管渗透性(Gragoudas ，N. Engl. J. Med (2004) 351: 2805)。新生血管形成和渗漏是湿形式的年龄相关性黄斑变性的突出特征。现在已经批准使用适体培加尼布(Macugen ，其中和VEGF-A亚型165)和ranibizumab (Lucentis ,其阻断VEGF-A的所有亚型)。炎症应答也在新生血管形成中起重要的病理生理学作用(&ikuri藥乂，^west Ophthalmol Vis Sci (2003) 44: 5349-5354; Oh ^ Λ Invest Ophthalmol Vis Sci (1999) 40: 1891-1898; Shi ^A , Exp Eye Res (2006) 83: 1325-1334。与TNFa拮抗剂有关的参考文献包括01son等>1，Arch Opthalmol (2007) 125: 1221-1224; Shi ^A , Exp Eye Res (2006) 83: 1325_1334Kociok 箏yl，Invest Ophthalmol Vis Sci (2006) 11: 5057-5065Markomichelakis ^ A km J Ophthalmol (2005) 139: 537-540。研究表明，英夫利昔单抗的玻璃体内注射可能引起严重的眼内炎症反应，所述炎症反应表现为剂量相关的。使用阿达木单抗没有观察到这种不利事件(计划4247， 海报D913，用于治疗顽固性糖尿病黄斑水肿的玻璃体内的TNF抑制剂来自泛美共同视网膜研究组的一项初步研究Gntravitreal TNF inhibitors in the Treatment of Refractory Diabetic Macular Edema: A Pilot Study from the Pan American Collaborative Retina Study Group)，和计划4749，海报D1087,玻璃体内的TNF 抑制剂的眼的和全身的安全性来自泛美共同视网膜研究组、视力和眼科学研究协会(ARVO)的一项初步石if究(Ocular and Systemic Safety of Intravitreal TNF Inhibitors: A Pilot Study From the Pan American Collaborative Retina Study Group, The Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) )，2010 年 5 月 2—6 日· Ft. Lauderdale USA)。需要可有效地预防眼疾病进展并为更广泛的患者群体提供改善的视力的治疗方案。
发明内容
本发明涉及TNF α拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合，具体地，所述组合用于治疗眼病。抗-VEGF方案和抗-TNF方案都具有治疗AMD的基础，这些模态在机理上可能不重叠，所以对抗-VEGF方案疗法没有成功地做出应答的患者可能对抗-TNF治疗做出应答，反之亦然。与抗-VEGF分子的抗-血管生成活性相组合的抗-TNF的抗炎益处，会在治疗这样
6的眼病中提供提高的效能。本发明涵盖了施用单独的TNF α拮抗剂和单独的VEGF拮抗剂的组合(即分开的 TNFa和VEGF拮抗剂分子)。另外，本发明涵盖了施用具有双靶向功能性的单个构建体，所述构建体起TNFa拮抗剂和VEGF拮抗剂的作用(即能够结合和抑制、优选地阻断TNF α或 TNFa受体的功能，并结合和抑制、优选地阻断VEGF或VEGF受体的功能)。单个构建体可以基于抗体骨架或其它这样的合适的骨架。受体-Fc融合体也被视作本发明的一部分。本发明具体地涉及抗原结合蛋白。具体地，本发明涉及TNF a /VEGF双靶向单个构建体，其中所述TNF α拮抗剂部分是或源自人抗-TNFa抗体。所述TNFa抗体可以是阿达木单抗或戈利木单抗。本发明具体地涉及用于治疗眼病的抗原结合蛋白，其包含与一个或多个表位-结合域相连的蛋白骨架，其中所述抗原结合蛋白具有至少2个抗原结合位点，其中的至少一个是来自表位结合域，且其中的至少一个是来自成对的VH/VL结构域，且其中至少一个抗原结合位点能够结合TNF α或TNF α受体例如TNFR1，且至少一个抗原结合位点能够结合 VEGF或VEGF受体例如VEGFR2。与一个或多个表位-结合域相连的受体-Fc融合体也是本发明的一部分，例如与 VEGF或VEGF受体-结合域相连的TNF α受体-Fc融合体，或与TNF α或TNF α受体-结合域相连的VEGF受体-Fc融合体。本发明提供了一种双靶向抗原结合分子，其包含TNFa拮抗剂部分、VEGF拮抗剂部分以及使所述TNF α拮抗剂部分与所述VEGF拮抗剂部分相连的连接物，其中所述TNF a 拮抗剂部分包含在表1中列出的任一种TNFa拮抗剂的氨基酸序列；所述VEGF拮抗剂部分包含在表2中列出的任一种VEGF拮抗剂的氨基酸序列；所述连接物是长度为1 - 150个氨基酸的氨基酸序列；且所述双靶向分子不是DMS4000或DMS4031。连接物也可以是基于非肽的连接物，包括，例如，聚乙二醇(PEG)和基于PEG的连接物。本发明也提供了一种编码本发明的抗原结合蛋白的多核苷酸序列，例如编码本文所述的任意抗原结合蛋白的重链的多核苷酸序列，和编码本文所述的任意抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸。这样的多核苷酸代表与等效多肽序列相对应的编码序列。但是，应该理解，可以将这样的多核苷酸序列与起始密码子、适当的信号序列和终止密码子一起克隆进表达载体中。本发明也提供了一种转化的或转染的重组宿主细胞，其包含一个或多个编码本发明的抗原结合蛋白(例如本文所述抗原结合蛋白的重链和轻链)的多核苷酸。本发明另外提供了一种用于生产本文所述的任意抗原结合蛋白的方法，所述方法包括下述步骤在合适的培养基(例如无血清的培养基)中培养宿主细胞，所述宿主细胞包含至少一种含有编码本发明的抗原结合蛋白的多核苷酸的载体，例如第一载体和第二载体，所述第一载体包含编码本文所述的抗原结合蛋白的重链的多核苷酸，且所述第二载体包含编码本文所述的抗原结合蛋白的轻链的多核苷酸。本发明提供了一种适合全身递送或向眼局部递送的药物组合物，其包含本文所述的抗原结合蛋白和药学上可接受的载体。本发明的药物组合物可以另外包含其它的活性剂。本发明提供了一种用于预防或治疗眼病的选自下述的TNFa拮抗剂阿达木单抗、英夫利昔单抗、依那西普、ESBA105、PEP1-5-19、PEP1-5-490、PEP1-5-493、SEQ ID NO: 2 的adnectin、戈利木单抗、塞妥珠单抗、ALK-6931以及包含SEQ ID NO:30的重链和SEQ ID N0:31的轻链的抗体，其中所述TNFa拮抗剂将与选自下述的VEGF拮抗剂组合施用 贝伐单抗、ranibizumab、r84、afliberc印t、CTOU D0M15-10-11、D0M15-26-593、PRS-050、 PRS-051、MP0012、CT-322、ESBA903、EPI-0030、EPI-0010 和 DMS1571。本发明也提供了一种用于预防或治疗眼病的选自下述的VEGF拮抗剂贝伐单抗、 ranibizumab、r84、afliberc印t、CTOU D0M15-10-11、D0M15-26-593、PRS-050, PRS-051、 MPOO12, CT-322、ESBA903、EPI-0030, EPI-0010 和 DMS1571，其中所述 VEGF 拮抗剂将与选自下述的TNFa拮抗剂组合施用阿达木单抗、英夫利昔单抗、依那西普、ESBA105、 PEP1 -5-19, PEP1 -5-490, PEP1 -5-493, SEQ ID NO: 2 的 adnectin、戈利木单抗、塞妥珠单抗、 ALK-6931以及包含SEQ ID NO:30的重链和SEQ ID N0:31的轻链的抗体。本发明也提供了一种双靶向抗原结合分子，其包含TNFa拮抗剂部分、VEGF拮抗剂部分以及使所述TNFa拮抗剂部分与所述VEGF拮抗剂部分相连的连接物，其中
所述TNFa拮抗剂部分包含在表1中列出的任一种TNFa拮抗剂的氨基酸序列； 所述VEGF拮抗剂部分包含在表2中列出的任一种VEGF拮抗剂的氨基酸序列； 所述连接物是长度为1 - 150个氨基酸的氨基酸序列；且所述双靶向分子不是DMS4000或DMS4031。本发明也提供了一种双靶向抗原结合分子，其包含TNFa拮抗剂部分、VEGF拮抗剂部分以及使所述TNFa拮抗剂部分与所述VEGF拮抗剂部分相连的连接物，其中
所述TNFa拮抗剂部分包含在表1中列出的任一种TNFa拮抗剂的氨基酸序列； 所述VEGF拮抗剂部分包含在表2中列出的任一种VEGF拮抗剂的氨基酸序列； 所述连接物是长度为1 - 150个氨基酸的氨基酸序列；且其中所述双靶向抗原结合分子是用于预防或治疗眼病，且每4-6周玻璃体内地给药。本发明也提供了一种抗原结合蛋白，其包含SEQ ID N0:69、70、71或72的重链序列和SEQ ID NO: 12的轻链序列。也提供了一种预防或治疗遭受眼病的患者的方法，所述方法包括全身地或局部地向患者的眼施用预防或治疗有效量的本文公开的组合物或双靶向蛋白。
图 1 显示了抗-TNF α / 抗-VEGF mAb-dAb DMS4000 的 SDS-PAGE 分析。图2显示了抗-TNF α /抗-VEGF mAb-dAb DMS4000的尺寸排阻色谱曲线。图3显示了 DMS4000的抗-VEGF活性。图4显示了 DMS4000的抗-TNF α活性。图5显示了 DMS4000的药代动力学(PK)性质。图6显示了 ELISA的结果，并证实了双特异性的BPC1821会结合VEGFR2和Β7-1。图7显示了 ELISA的结果，并证实了双特异性的BPC1825显示出与VEGF和Β7-1 的结合。图8描述了用于构建本发明的双靶向抗原结合分子的矩阵。图9显示了 PEP-DOM构建体的BIAcore分析。
图10显示了 PEP-DOM构建体的BIAcore分析(图9结合曲线的TNF/VEGF结合区的放大图)。图11是表10所示数据的图解表示。以2μ1的体积，通过玻璃体内注射，施用所有化合物。黑色条表示第7天的结果。白色条表示第14天的结果。图12是表11所示数据的图解表示。以2μ1的体积，通过玻璃体内注射，施用所有化合物。黑色条表示第7天的结果。白色条表示第14天的结果。图13显示了在激光PC以后7天(第1次FS)和14天(第2次FS)时的红外 (IR，左上图)、自发荧光(AF，左下图)和荧光素血管造影术(FS，大图)——显示了实施例图像。1.媒介物治疗的眼，2.用DMS1571治疗的眼，8.用Enbrel 治疗的眼。 值得注意的是，CNV损伤显得比与DMS1571治疗相对应的损伤更突出和弥散性更低。图14是表12所示数据的图解表示。以2μ1的体积，通过玻璃体内注射，施用所有化合物。图15显示了用EDl单抗(mab)染色的平坦固定的视网膜的实施例显微照片。图 1A-1B 和图 Enbrel 8. 4 显示了来自用抗-VEGF (DMS1571) (IA)、仅媒介物(IB)或 Enbrel (Enbrel 8.4)处理过的眼的视网膜的平坦固定。用EDl (⑶68，黑色)X20显影与激光烧伤部位有关的巨噬细胞。图ID显示了视网膜的恒冷箱切片(20Mm)，它显示了已经渗入视网膜的内核层(INL)中的与激光烧伤部位有关的巨噬细胞(ED1+，黑色)。RGC，视网膜神经节细胞层；BV，血管。x20。定义
本文使用的术语‘蛋白骨架’包括、但不限于免疫球蛋白(Ig)骨架，例如IgG骨架，其可以是4链或2链抗体，或者其可以仅包含抗体的Fc区，或者其可以包含一个或多个抗体恒定区，所述恒定区可以属于人或灵长类动物来源，或者其可以是人和灵长类动物恒定区的人工嵌合体。除了一个或多个恒定区以外，这样的蛋白骨架可以包含抗原结合位点，例如其中所述蛋白骨架包含完整的IgG。这样的蛋白骨架将能够与其它蛋白结构域相连，例如具有抗原结合位点的蛋白结构域，例如表位-结合域或^Fv结构域。本文使用的术语‘受体-Fc融合体’表示，与抗体的Fc区相连的受体或细胞表面蛋白的可溶性配体或胞外结构域。在该定义内包括受体或细胞表面蛋白的这种可溶性配体或胞外结构域的片段，只要它们保留全长蛋白的生物学功能，即只要它们保留抗原结合能力。 “结构域”是折叠的蛋白结构，其具有独立于蛋白的其余部分的三级结构。通常，结构域负责蛋白的离散的功能性质，并且在许多情况下，可以添加、去除或转移给其它蛋白，而不丧失该蛋白的其余部分和/或该结构域的功能。“抗体单个可变结构域”是折叠的多肽结构域， 其包含抗体可变结构域特有的序列。因此，它包括完整的抗体可变结构域和修饰的可变结构域(例如，其中一个或多个环已经被不是抗体可变结构域特有的序列所置换)，或者已被截短或包含N-端或C-端延伸的抗体可变结构域，以及至少保留全长结构域的结合活性和特异性的可变结构域的折叠片段。“人源化的抗体”表示一类工程化的抗体，其具有源自非人供体免疫球蛋白的CDR， 该分子的其余的免疫球蛋白-衍生的部分源自一种或多种人免疫球蛋白。此外，框架支持残基可以被改变，以保持结合亲和力(参见，例如，Queen等人Proc. Natl Acad Sci USA, 86:10029-10032 (1989)，Hodgson 等人 Bio/technology, 9:421 (1991))。合适的人接受体抗体可以是选自常规数据库的一种(通过与供体抗体的核苷酸和氨基酸序列的同源性)， 所述常规数据库例如KABAT 数据库、Los Alamos数据库和Swiss蛋白数据库。特征在于与供体抗体的框架区的同源性(在氨基酸的基础上)的人抗体，可以适合提供重链恒定区和 /或重链可变框架区，用于插入供体CDR。以类似的方式，可以选择能够供给轻链恒定或可变框架区的合适的接受体抗体。应当指出，接受体抗体重链和轻链不需要源自相同的接受体抗体。现有技术描述了生产这样的人源化抗体的几种方法，参见例如EP-A-0239400和 EP-A-054951.在一个实施方案中，本发明的抗体是人源化的抗体。“⑶R”被定义为抗原结合蛋白的互补性决定区氨基酸序列。这些是免疫球蛋白重链和轻链的高变区。在免疫球蛋白的可变部分中，存在3个重链和3个轻链CDR (或CDR 区)。因而，本文使用的“⑶R”表示所有3个重链⑶R、所有3个轻链⑶R、所有重链和轻链 ⑶R或至少2个⑶R。“⑶R变体”包括被至少一个氨基酸修饰的氨基酸序列，其中所述修饰可以是氨基酸序列的化学改变或部分改变(例如改变了不超过10个氨基酸)，所述修饰允许变体保留未修饰的序列的生物学特征。例如，所述变体是结合和中和IL-18的功能变体。CDR氨基酸序列的部分改变可以是删除或置换1个至几个氨基酸，或添加或插入1个至几个氨基酸， 或它们的组合(例如改变了不超过10个氨基酸)。所述CDR变体可以在氨基酸序列中含有1、2、3、4、5或6个氨基酸置换、添加或删除的任意组合。所述CDR变体或结合单位变体可以在氨基酸序列中含有1、2或3个氨基酸置换、插入或删除的任意组合。氨基酸残基的置换可以是保守置换，例如，用一个疏水氨基酸置换一个被替代的疏水氨基酸。例如可以用缬氨酸或异亮氨酸置换亮氨酸。术语“人抗体”表示源自人免疫球蛋白基因序列的抗体。这些全人抗体会提供重新工程化的或去免疫的啮齿动物单克隆抗体的替代品(例如人源化的抗体)，作为低免疫原性治疗抗体的来源，且它们通常使用噬菌体展示或转基因小鼠平台来制备。在一个实施方案中，本发明的抗体是人抗体。短语“免疫球蛋白单个可变结构域”表示抗体可变结构域(VH、VffinVJ 其独立于不同的V区或结构域而特异性地结合抗原或表位。免疫球蛋白单个可变结构域可以以含有其它不同的可变区或可变结构域的形式(例如，同源多聚体或异源多聚体)存在，其中其它区域或结构域不是单个免疫球蛋白可变结构域的抗原结合所必需的(即其中免疫球蛋白单个可变结构域与抗原的结合独立于另外的可变结构域)。“结构域抗体”或“dAb”与 “免疫球蛋白单个可变结构域”同义，后者作为本文所用的术语，能够结合抗原。免疫球蛋白单个可变结构域可以是人抗体可变结构域，但是也包括来自其它物种的单个抗体可变结构域，诸如啮齿动物(例如，如在WO 00/29004中所公开的)、铰口鲨和骆驼类Wamelid) VHHdAb。骆驼类Vhh是这样的免疫球蛋白单个可变结构域多肽其源自包括骆驼、骆马、羊驼、 单峰骆驼和原驼在内的物种，且生产天然地缺少轻链的重链抗体。根据本领域可利用的标准技术，可以人源化这样的Vhh结构域，且这样的结构域仍然被视作根据本发明的“结构域抗体”。本文使用的“VH”包括骆驼类Vra结构域。NARV是在包括铰口鲨在内的软骨鱼中鉴别出的另一类免疫球蛋白单个可变结构域。这些结构域也称作新颖的抗原受体可变区(通常缩写为V(NAR)或NARV)。关于其它细节，参见Mol. Immunol. (2006) 44: 656-665和 US20050043519Ao
术语“表位-结合域”表示这样的结构域其独立于不同的V区或结构域而特异性地结合抗原或表位，这可以是结构域抗体(dAb)，例如人、骆驼类或鲨鱼免疫球蛋白单个可变结构域，或它可以是作为选自下述的骨架的衍生物的结构域CTLA-4 (Evibody)； 脂质运载蛋白；蛋白A衍生出的分子诸如蛋白A(亲和体、SpA)的Z-结构域、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白诸如GroEl和GroES ；转铁蛋白(反体)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连接素)；人Y-晶体蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的全蝎毒素kimitz型结构域；和纤连蛋白 (adnectin)；其已经进行蛋白工程化，以便实现与除了天然配体以外的配体的结合。CTLA-4 (细胞毒性的T淋巴细胞-相关的抗原4)是主要在⑶4+ T-细胞上表达的CD28-家族受体。它的胞外结构域具有可变结构域-样Ig折叠。可以用异源序列置换与抗体的CDR相对应的环，以赋予不同的结合性质。被工程化成具有不同的结合特异性的 CTLA-4 分子也称作 Evibodies。关于其它细节，参见 Journal of Immunological Methods (2001) 248 (1-2): 31-45。脂质运载蛋白是运输小疏水分子(诸如类固醇、后胆色素、类视色素和脂质)的胞外蛋白家族。它们具有刚性的折叠二级结构，该结构在圆锥形结构的开放末端处具有许多环，它们可以被工程化成结合不同的靶抗原。Anticalin的长度是160-180个氨基酸， 且源自脂质运载蛋白。关于其它细节，参见Biochim Biophys Acta (2000) 1482: 337-350， US7250297B1 和 US20070224633。亲和体是源自金黄色葡萄球菌的蛋白A的骨架，其可以被工程化成结合抗原。该结构域由大约58个氨基酸的三螺旋束组成。通过表面残基的随机化，已经制备了文库。关于其它细节，参见 Protein Eng. Des. Sel. (2004) 17: 455-462 和 EP1641818A1。Avimer是源自A-结构域骨架家族的多结构域蛋白。大约35个氨基酸的天然结构域采取确定的二硫键连接的结构。通过A-结构域家族表现出的天然变体的重排 (shuffling)，产生多样性。关于其它细节，参见 Nature Biotechnology (2205) 23(12) 1556 - 1561 禾口 Expert Opinion on Investigational Drugs (June 2007) 16(6): 909-917。转铁蛋白是单体的血清运输糖蛋白。通过将肽序列插入允许的表面环中，可以将转铁蛋白工程化成结合不同的靶抗原。工程化的转铁蛋白骨架的实例包括反体 (Trans-body)。关于其它细节，参见 J. Biol. Chem (1999) 274: 24066-24073 设计的锚蛋白重复蛋白(DARPins)源自锚蛋白，所述锚蛋白是介导完整的膜蛋白与细胞骨架的连接的蛋白家族。单个锚蛋白重复是由2个α-螺旋和1个转角组成的33残基基序。通过将每个重复的第一个α-螺旋和β-转角中的残基随机化，可以将它们工程化成结合不同的靶抗原。通过增加模块的数目，可以增加它们的结合界面(亲和力成熟方法)。关于其它细节，参见 J. Mol. Biol. (2003) 332: 489-503; PNAS (2003) 100(4) 1700-1705;和 J. Mol. Biol. (2007) 369: 1015-1028 和 US20040132028A1。纤连蛋白是可以被工程化成结合抗原的骨架。Adnectin由人纤连蛋白III型 (FN3)的15个重复单位的第10个结构域的天然氨基酸序列主链组成。可以工程化在β -夹心的一个末端处的3个环，以使Adnectin能够特异性地识别目标治疗靶物。关于其它细节，参见Protein Eng. Des. Sel. (2005) 18: 4;35-444、US20080139791、W02005056764和US6818418B1。肽适体是组合的识别分子，其由恒定的骨架蛋白组成，所述骨架蛋白通常是含有插入在活性部位处的受限可变肽环的硫氧还蛋白(TrxA)。关于其它细节，参见Expert Opin. Biol. Ther. (2005) 5: 783-797。微体源自长度为25-50个氨基酸的天然存在的微蛋白，所述微蛋白含有3-4个半胱氨酸桥，微蛋白的实例包括KalataBl和芋螺毒素和knottins。所述微蛋白具有一个环， 该环可以被工程化成包含最多25个氨基酸，而不影响微蛋白的总体折叠。关于工程化的 knottin结构域的其它细节，参见W02008098796。其它表位结合域包括这样的蛋白所述蛋白已经被用作骨架，以工程化不同的靶抗原结合性质，包括人Y-晶体蛋白和人泛素(affilins)、人蛋白酶抑制剂的kimitz类型结构域、Ras-结合蛋白AF-6的PDZ-结构域、全蝎毒素(蝎毒素)、C_型凝集素结构域(四 3^ ), =Handbook of Therapeutic Antibodies (2007, Stefan Dubel H ) ψ 的第 7 章-Non-Antibody kaffolds，和 Protein Science (2006) 15:14-27。本发明的表位结合域可以源自这些替代性的蛋白结构域中的任一种。“双可变结构域免疫球蛋白(DVD-Ig) ”是双特异性的、四价的免疫球蛋白G (IgG)-样分子(Wu 箏yl Nature Biotechnology (2007) 25: 1290_1四7)。可以将 DVD-Ig 定义为包含多肽链的结合蛋白，其中所述多肽链包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VDl是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，C是恒定结构域，Xl代表氨基酸或多肽(连接物)，X2代表Fc区，且η是0或1 (W0 2007024715)。在本发明的上下文中，VDI会结合 TNFa或TNF α受体，且VD2会结合VEGF或VEGF受体，或反之亦然。本文使用的术语“成对的Vh结构域”、“成对的\结构域”和“成对的VH/VL结构域” 表示，当与它们的配偶体可变结构域成对时，仅特异性地结合抗原的抗体可变结构域。在任一对中，总是存在一个Vh和一个\，术语“成对的Vh结构域”表示Vh配偶体，术语“成对的 Vl结构域”表示\配偶体，且术语“成对的VH/VL结构域”表示在一起的2个结构域。本文使用的术语“抗原结合蛋白，，表示能够结合TNF α和/或VEGF的抗体、抗体片段，例如结构域抗体(dAb)、ScFv, FAb, FAb2和其它蛋白构建体，诸如受体-Fc融合体。 抗原结合分子可以包含至少一个Ig可变结构域，例如抗体、结构域抗体、多个结构域抗体例如哑铃状体、dAb-dAb线内融合体、Fab、Fab'、F(ab’) 2、Fv、kFv、双特异抗体、mAbdAb、 DVD-Ig、亲和体、异源缀合物抗体或双特异性体，包括具有对TNF α或TNF α受体的第一特异性和对VEGF或VEGF受体的第二特异性的双特异性抗体。在一个实施方案中，所述抗原结合分子是抗体。在另一个实施方案中，所述抗原结合分子是dAb，即免疫球蛋白单个可变结构域，诸如VH、Vhh或\，其独立于不同的V区或结构域特异性地结合抗原或表位。抗原结合分子可以能够结合2种靶物，即它们可以是双靶向蛋白。抗原结合分子可以是抗体和抗原结合片段的组合，例如，与单克隆抗体相连的一个或多个结构域抗体和/或一个或多个ScFv。抗原结合分子也可以包含非-Ig结构域，例如作为选自下述的骨架的衍生物的结构域CTLA-4 (Evibody)；脂质运载蛋白；蛋白A衍生的分子诸如蛋白A (亲和体、SpA)的 Z-结构域、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白诸如GroEl和GroES ；转铁蛋白(反体)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连接素) ’人Y-晶体蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的全蝎毒素kimitz类型结构域；和纤连蛋白(adnectin)；它们已经就那些蛋白工程化，以便实现与TNF α和/或VEGF的结合。 本文使用的“抗原结合蛋白”能够拮抗和/或中和人TNFa和/或VEGF。另外，抗原结合蛋白可以如下阻断TNF α和/或VEGF活性通过结合TNF α和/或VEGF，并阻止天然配体结合和/或活化受体。本文使用的“VEGF拮抗剂”包括能够降低和/或消除VEGF的至少一种活性的任意化合物。作为实例，VEGF拮抗剂可以结合VEGF，且该结合可以直接地降低或消除VEGF活性，或它可以通过阻断至少一种配体与受体的结合而间接地起作用。本文使用的“TNFa拮抗剂”包括能够降低和/或消除TNF α的至少一种活性的任意化合物。作为实例，TNFa拮抗剂可以结合TNFa，且该结合可以直接地降低或消除TNF α 活性，或它可以通过阻断至少一种配体与受体的结合而间接地起作用。与抗原结合蛋白关联地使用的术语“特异性地结合”是指，该抗原结合蛋白会结合它的靶蛋白(例如TNF α、TNFR、BEGF, VEGFR)，且不结合或不显著地结合其它的(例如，无关的)蛋白。但是，该术语不排除下述事实，即针对特定物种(例如人)中的靶蛋白的抗体也可能与其它物种(例如非人灵长类动物)中的其它靶蛋白形式交叉反应。术语“KD”表示平衡解离常数。在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合位点会以最大ImM的KD结合抗原，例如对于每个抗原10nM、lnM、500pM、200pM、IOOpM的KD (通过 Biacore 测得)。在本发明的一个实施方案中，所述抗原结合位点会以对于每个抗原IOnM 或更小、InM或更小、500pM或更小、200pM或更小、IOOpM或更小的KD (通过Biacore 测得) 结合抗原。本文使用的术语“抗原结合位点”表示能够特异性地结合抗原的构建体上的位点， 这可以是单个结构域，例如表位-结合域，或它可以是在标准抗体上可以发现的成对的Vh/ 八结构域。在本发明的有些方面，单链Fv (ScFv)结构域可以提供抗原结合位点。术语“mAb/dAb”和dAb/mAb”在本文中用于表示本发明的抗原结合蛋白。这2个术语可以互换使用，且意在具有本文使用的相同含义。术语“恒定的重链1”在本文中用于表示免疫球蛋白重链的恒定结构域CH1。术语“恒定的轻链”在本文中用于表示免疫球蛋白轻链的恒定结构域Q。术语“文库”表示异质多肽或核酸的混合物。文库由成员组成，每个成员具有单个多肽或核酸序列。就这一方面而言，“文库”与“所有组分”同义。“通用框架”是这样的单个抗体框架序列其对应着在Kabat所定义的序列 ("Sequences of Proteins of Immunological Interest",美国卫生和人类服务部)中保守的抗体区域,或对应着Chothia和Lesk, J. Mol. Biol. (1987) 196: 910-917所定义的人种系免疫球蛋白所有组分或结构。
具体实施例方式本发明提供了适用于眼的组合物，其包含TNF α拮抗剂和/或VEGF拮抗剂。本发明也提供了用于预防或治疗眼病的TNF α拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合。本发明也提供了一 种预防或治疗眼病的方法，其中施用与VEGF拮抗剂相组合的TNF α拮抗剂。可以单独地、 顺序地或同时地施用TNF α拮抗剂和VEGF拮抗剂。本发明涵盖了施用单独的TNF α拮抗剂和单独的VEGF拮抗剂的组合(即分开的TNFa和VEGF拮抗剂分子)。另外，本发明涵盖了施用能够结合2种或更多种抗原的单个分子或构建体，例如本发明涵盖了具有双靶向功能性的分子，其起TNF α拮抗剂和VEGF拮抗剂的作用(即能够结合和抑制、优选地阻断TNF α或TNFa受体的功能，并结合和抑制、 优选地阻断VEGF或VEGF受体的功能)。例如，本发明提供了一种双靶向分子，其能够结合 TNFa和VEGFR2等。在一个实施方案中，所述双靶向分子能够结合TNF受体和VEGF受体。本发明的TNF α拮抗剂可以使通过TNF受体的信号传递抑制了 30%、40%、50%、60%、 70%、80%、85%、90%、95%、98%或100%。本发明的VEGF拮抗剂可以使通过VEGF受体的信号传递抑制了 30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98% 或 100%。在一个实施方案中，所述TNFa拮抗剂是人抗原结合蛋白，具体地人抗-TNF α抗体或其片段或人抗-TNFR抗体或其片段。在一个实施方案中，所述VEGF拮抗剂是人抗原结合蛋白，具体地人抗-VEGF抗体或其片段或人抗-VEGFR抗体或其片段。在一个实施方案中， 所述抗原结合蛋白是TNFa/VEGF双靶向单个构建体，其中所述TNF α拮抗剂部分是人。在一个具体实施方案中，所述TNF拮抗剂是或源自阿达木单抗或戈利木单抗。所述拮抗剂可以基于本文所述的抗体骨架或其它这样的合适的骨架。这样的拮抗剂可以是抗体或表位结合域，例如dAb。受体-Fc融合体被视作本发明的一部分。本发明的拮抗剂可以作为单独分子的混合物共同施用，它们可以同时施用(同时地)，或者相互在指定的时间段内施用(顺序地)，例如相互在1个月、1周内或M小时内， 例如相互在20小时内、或在15小时内、或在12小时内、或在10小时内、或在8小时内、或在6小时内、或在4小时内、或在2小时内、或在1小时内、或在30分钟内。本发明的拮抗剂可以作为分开的制剂或作为单个制剂(例如含有2种拮抗剂的脂质体)共同施用。在本发明范围内的TNF α拮抗剂(其可以与本发明的VEGF拮抗剂组合施用，或其可以用于制备本发明的双靶向分子)包括下面在表1中列出的那些。表1 TNFa拮抗剂
权利要求
1.一种用于预防或治疗眼病的组合物，其包含TNF α拮抗剂和VEGF拮抗剂。
2.如权利要求1所述的组合物，其中所述TNFα拮抗剂和所述VEGF拮抗剂是抗原结合蛋白。
3.如权利要求1或权利要求2所述的组合物，其中所述TNFα拮抗剂和所述VEGF拮抗齐U以双靶向蛋白形式存在。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述双靶向蛋白包含至少一对结合TNFα或 TNF α受体的VH/VL结构域和至少一对结合VEGF或VEGF受体的VH/VL结构域。
5.如权利要求4所述的组合物，其中所述双靶向分子是DVD-Ig。
6.如权利要求3或4所述的组合物，其中所述双靶向蛋白是双特异性抗体。
7.如权利要求3所述的组合物，其中所述双靶向蛋白是dAb-dAb线内融合体。
8.如权利要求3所述的组合物，其中所述双靶向蛋白是与一个或多个表位结合域相连的受体-Fc融合体。
9.如权利要求2所述的组合物，其中所述TNFα拮抗剂是抗-TNF α抗体。
10.如权利要求2所述的组合物，其中所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。
11.如权利要求3所述的组合物，其中所述双靶向蛋白的TNFα拮抗剂部分是抗-TNF 抗体，且其中所述双靶向蛋白的VEGF拮抗剂部分是抗-VEGF表位结合域。
12.如权利要求3所述的组合物，其中所述双靶向蛋白的VEGF拮抗剂部分是抗-VEGF 抗体，且其中所述双靶向蛋白的TNFa拮抗剂部分是抗-TNF表位结合域。
13.如权利要求8、11或12所述的组合物，其中所述表位结合域是dAb。
14.如权利要求13所述的组合物，其中所述dAb是人dAb。
15.如权利要求8、11或12所述的组合物，其中所述表位结合域源自非-Ig骨架。
16.如权利要求15所述的组合物，其中所述表位结合域选自CTLA-4(Evibody)； 脂质运载蛋白；蛋白A衍生出的分子诸如蛋白A(亲和体、SpA)的Z-结构域、A-结构域(Avimer/Maxibody)；热休克蛋白诸如GroEl和GroES ；转铁蛋白(反体)；锚蛋白重复蛋白(DARPin)；肽适体；C-型凝集素结构域(四连接素)；人Y-晶体蛋白和人泛素(affilins) ；PDZ结构域；人蛋白酶抑制剂的全蝎毒素kimitz型结构域；和纤连蛋白 (adnectin)0
17.根据权利要求8或权利要求11-16中任一项所述的组合物，其中使用由1-30个氨基酸组成的连接物，将所述表位结合域直接连接至所述抗原结合蛋白上。
18.根据权利要求17所述的组合物，其中所述连接物选自在SEQID NO: 3_8和25中所述的那些或它们的任意组合或多个。
19.根据权利要求11-18中任一项所述的组合物，其中所述表位结合域连接至抗原结合蛋白重链的N-端。
20.根据权利要求11-18中任一项所述的组合物，其中所述表位结合域连接至抗原结合蛋白轻链的N-端。
21.根据权利要求11-18中任一项所述的组合物，其中所述表位结合域连接至抗原结合蛋白重链的C-端。
22.根据权利要求11-18中任一项所述的组合物，其中所述表位结合域连接至抗原结合蛋白轻链的C-端。
23.根据权利要求2-7或8-22中任一项所述的组合物，其中所述抗原结合蛋白包含 在SEQ ID NO: 10所述的重链中含有的CDRHU CDRH2和CDRH3，和在SEQ ID NO: 12所述的轻链中含有的CDRLl、CDRL2和CDRL3。
24.根据权利要求23所述的组合物，其包含SEQID NO: 14、15、47、69、70、71或72的重链序列和SEQ ID NO: 12的轻链序列。
25.在权利要求3-8或Il-M中任一项中要求保护的组合物，其中所述组合物每4-6周玻璃体内地施用。
26.在权利要求1-25中任一项中要求保护的组合物，其中所述组合物包含其它活性齐U，任选抗炎剂。
27.在权利要求116中任一项中定义的组合物用于制备药物的应用，所述药物用于预防或治疗眼病。
28.一种用于预防或治疗眼病的TNF α拮抗剂，其选自阿达木单抗、英夫利昔单抗、依那西普、ESBA105、PEPl-5-19、PEPl-5-490、PEPl-5-493、SEQ ID NO: 2 的 adnectin、戈利木单抗、塞妥珠单抗、ALK-6931以及包含SEQ ID N0:30的重链和SEQ ID N0:31的轻链的抗体，其中所述TNF α拮抗剂将与选自下述的VEGF拮抗剂组合施用贝伐单抗、ranibizumab、 r84、afliberc印t、CT01、D0M15-10-11、D0M15-26-593、PRS-050、PRS-051、MP0012、CT-322、 ESBA903、EPI-0030、EPI-0010 和 DMS1571。
29.一种用于预防或治疗眼病的VEGF拮抗剂，其选自贝伐单抗、ranibizumab、r84、 aflibercept、CTOU D0M15-10-11、D0M15-26-593、PRS-050, PRS-051, ΜΡ0012, CT-322, ESBA903、EPI-0030、EPI-0010和DMS1571，其中所述VEGF拮抗剂将与选自下述的TNF α拮抗剂组合施用阿达木单抗、英夫利昔单抗、依那西普、ESBA105、ΡΕΡ1-5-19、ΡΕΡ1-5-490、 PEP1-5-493, SEQ ID Ν0:2的adnectin、戈利木单抗、塞妥珠单抗、ALK-6931以及包含SEQ ID N0:30的重链和SEQ ID N0:31的轻链的抗体。
30.在权利要求28中要求保护的TNFα拮抗剂或在权利要求四中要求保护的VEGF拮抗剂，其中所述TNF α拮抗剂是阿达木单抗，且所述VEGF拮抗剂是ranibizumab。
31.一种药物组合物，其包含在权利要求114中任一项中要求保护的组合物和药学上可接受的载体。
32.在权利要求31中要求保护的药物组合物，其中所述组合物包含其它活性剂，任选抗炎剂。
33.一种多核苷酸序列，其编码在权利要求2-M中任一项中要求保护的抗原结合蛋白。
34.一种多核苷酸序列，其编码根据权利要求5、6或9-M中任一项所述的组合物的重链或轻链。
35.在权利要求34中要求保护的多核苷酸序列，其中所述序列如在SEQID NO: 11,13 或46中所述。
36.一种转化的或转染的重组宿主细胞，其包含在权利要求33-35中任一项中要求保护的一个或多个多核苷酸序列。
37.一种用于生产根据权利要求2-M中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括下述步骤培养如权利要求36所述的宿主细胞，和分离所述抗原结合蛋白。
38.在权利要求I-M中任一项中要求保护的组合物，其用于经由玻璃体内途径进行递送。
39.在权利要求I-M中任一项中要求保护的组合物，其用于经由眼周途径进行递送。
40.根据权利要求39所述的组合物，其用于经由跨巩膜的、结膜下的、sub-tenon、眼球周的、局部的、眼球后的途径进行递送，或者其用于递送至下直肌、上直肌或外直肌。
41.根据权利要求I-M中任一项所述的组合物，其中所述眼病是糖尿病黄斑水肿、囊样黄斑水肿、葡萄膜炎、AMD (年龄相关性黄斑变性)、脉络膜新生血管AMD、糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞以及其它黄斑病变和眼血管病变。
42.一种预防或治疗遭受眼病的患者的方法，所述方法包括全身地或局部地向患者的眼施用预防或治疗有效量的根据权利要求I-M中任一项所述的组合物或双靶向蛋白。
43.如权利要求42所述的方法，其中所述患者遭受至少一种下述的疾病或障碍糖尿病黄斑水肿、囊样黄斑水肿、葡萄膜炎、AMD (年龄相关性黄斑变性)、脉络膜新生血管AMD、 糖尿病视网膜病变、视网膜静脉阻塞以及其它黄斑病变和眼血管病变。
44.一种双靶向抗原结合分子，其包含TNF α拮抗剂部分、VEGF拮抗剂部分以及使所述 TNFa拮抗剂部分与所述VEGF拮抗剂部分相连的连接物，其中所述TNFa拮抗剂部分包含在表1中列出的任一种TNFa拮抗剂的氨基酸序列；所述VEGF拮抗剂部分包含在表2中列出的任一种VEGF拮抗剂的氨基酸序列；所述连接物是长度为1 - 150个氨基酸的氨基酸序列；且所述双靶向分子不是DMS4000或DMS4031。
45.一种双靶向抗原结合分子，其包含TNF α拮抗剂部分、VEGF拮抗剂部分以及使所述 TNFa拮抗剂部分与所述VEGF拮抗剂部分相连的连接物，其中所述TNFa拮抗剂部分包含在表1中列出的任一种TNFa拮抗剂的氨基酸序列；所述VEGF拮抗剂部分包含在表2中列出的任一种VEGF拮抗剂的氨基酸序列；所述连接物是长度为1 - 150个氨基酸的氨基酸序列；且其中所述双靶向抗原结合分子是用于预防或治疗眼病，且每4-6周玻璃体内地给药。
46.在权利要求44或45中要求保护的双靶向分子，其中所述连接物选自在SEQID NO: 3-8、25、66-68和145-162中所述的那些或它们的任意组合或多个。
47.在权利要求44-46中任一项中要求保护的双靶向抗原结合分子，其由SEQID NO:62或SEQ ID NO 64的氨基酸序列组成。
48.一种抗原结合蛋白，其包含SEQ ID N0:69、70、71或72的重链序列和SEQ ID NO: 12 的轻链序列。
49.一种药物组合物，其包含在权利要求48中要求保护的抗原结合蛋白和其它活性齐U，任选抗炎剂。
50.一种多核苷酸序列，其编码如权利要求48所述的抗原结合蛋白。
51.在权利要求50中要求保护的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸包含SEQID NO:141、142、143 或 144 和 SEQ ID N0:11。
全文摘要
本发明涉及用于治疗眼病的TNFα拮抗剂和VEGF拮抗剂的组合，并提供了结合TNFα或TNFα受体和/或VEGF或VEGF受体的抗原结合蛋白。
文档编号C07K16/24GK102458471SQ201080032439
公开日2012年5月16日 申请日期2010年5月26日 优先权日2009年5月28日
发明者W. 高夫 G., 斯图尔德 M., F. 埃尔特尔 P., 亚当森 P., 格尔马谢夫斯基 V. 申请人:葛兰素集团有限公司