专利名称：参与HEP G2细胞中胆固醇内稳态的大豆7S球蛋白α’亚基延伸区的克隆、酵母表达、纯化和 ...的制作方法
参与HEP G2细胞中胆固醇内稳态的大豆7S球蛋白a ’亚基延伸区的克隆、酵母表达、纯化和生物学活性
本发明涉及对应天然a ’亚基的N端亲水片段的大豆7S球蛋白的重组a ’片段，它的制备方法和含有它的组合物，在所述组合物中它作为控制胆固醇和甘油三酯内稳态有用的活性成分。
背景技术：
在高胆固醇血症患者的血脂水平的控制中，膳食大豆蛋白作用的是广为接受的问题[I]。在以前的研究中[2-4]，在体内和体外系统中说明了大豆7S球蛋白的一个亚基，a ’亚基，直接涉及LDL-受体的增量调节，表明通过细胞酶加工很可能产生有生物学活性的，能够调节胆固醇内稳态的(多)肽。天然的7S球蛋白由三个随机组合的、通过不同基因编码的多肽链，a’、a和3亚基组成[5]。成熟的a ’ (登录号P11827UniProtKB/Swiss-Prot数据库)和a链(登录号P13916UniProtKB/Swiss-Prot数据库)共享约145个氨基酸残基的延伸的N端区，在^亚基(登录号P25974UniProtKB/Swiss-Prot数据库)中缺少所述N端区。基于a ’延伸区的特有的氨基酸序列，通过金属亲和色谱纯化此亚基并且将其对高胆固醇血症的大鼠口服施用，因而容许显示它的血浆降脂性质和肝P-VLDL受体的增量调节[4]。在另一方面，由于a ’亚基的分子量约为71kDa[6]，它似乎不可能体内穿越肠屏障而没有修饰。因此，我们的研究指向寻找导致药理学作用的a ’亚基的氨基酸序列。由于三个亚基的核心区具有较多的相似的氨基酸序列，可以想到生物学活性应该存在于延伸区的一个或多个(多)肽中。原则上，a ’和a链的延伸区之间局部的但显著的氨基酸差异将限制导致生物学活性的肽的数目。从这些以前的陈述中，寻求的第一策略是检测HepG2细胞中的多肽和合成多肽对LDL-受体(LDL-R)调节的作用，所述H印G2细胞中的多肽获取自CroksoyK70的体外消化(胃蛋白酶/胰蛋白酶)，所述Crokso/70是在食品治疗高胆固醇血症患者中常规使用的无异黄酮大豆浓缩物[7-8]，所述合成的肽对应于7S大豆球蛋白亚基之间不同的特定氨基酸序列。在这些研究中获得的结果指出，在暴露于CrokSoyK70的酶消化产物和来自7S大豆球蛋白的小合成肽(2，271Da)的H印G2细胞中，能够诱导显著的LDL-R增量调节，所述酶消化产物具有在3，000到20，OOODa范围内的MW，并以KT4M浓度将所述小合成肽加入细胞。用小肽获得的研究现在仍处于研究中且迄今尚未明确[10]。大豆蛋白的降低胆固醇和甘油三酯的能力是已证实的问题。大豆蛋白膳食是当今治疗高胆固醇血症患者的最有力的膳食工具，因而为管理成人和非常年轻的对象提供了独特的机会。而且，明确地确立在具有高基线程度的胆固醇血症患者中血浆胆固醇降低更多[14]。蛋白质本身降低血胆固醇的假说起于实验研究，所述研究表明膳食中从动物到植物蛋白质的转换激活实验动物的肝脏[15]，以及高胆固醇血症患者的循环淋巴单核细胞中的LDL受体系统。为了鉴定导致降胆固醇作用的大豆蛋白组分，用人肝细胞瘤细胞、系实施体外研究，所述细胞系对调节LDL受体表达和胆固醇生物合成/分解的因子高度敏感。在H印G2细胞中发现从7S大豆球蛋白纯化的a ’亚基增量调节LDL受体[3]并且在胆固醇饲养的大鼠中证实此发现[4]。尽管这些数据支持蛋白质部分导致观察到的生物效应的假说，可对a ’链体内生物学命运提出争论，因为通常通过胃和/或肠蛋白分解酶的作用生产肽和氨基酸。然而，声称越来越多的动物和植物(多)肽起相关的调节功能，通常归因于抗氧化、抗增殖和抗炎效应[17]。对大豆而言，实验证据明确地表明了可吸收肽和更小的紧密蛋白质(例如Bowman-Birk抑制物)的可能性[18]，因而诱发很多效应，包括抗癌、抗炎、放射保护性效应[19]。也已经显示了遗传修饰的大豆(多)肽引发生物学应答，比如低血压效应[20]。最近，已经从大豆水解产物鉴定了衍生自7S球蛋白P链的LDL-R转录模拟肽(FVVNATSN),所述水解产物通过来自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)的蛋白酶并随后通过化学合成制备[21]。在这种情况下，在暴露于100 y M浓度妝的Hep G2细胞中检测到增加的LDL-R转录(+148%)。已经显示了源自IlS球蛋白的其他肽产生相似但是较低的活性[21]。
将需要使得可获得的较短的多肽维持或甚至提高全长蛋白质的生物学性质。发明描述现在已经发现所谓的对应其N端侧的大豆7S球蛋白的a ’延伸区具有有利的生物学活性并且已被证明在LDL吸收和降解上比全尺寸a ’链甚至更有效。因此本发明提供了所述a ’延伸区(在下文中称为e a ’)，以及通过克隆、酵母表达和纯化重组多肽制备它的方法，所述重组多肽含有大豆a ’亚基的N端延伸区。为此目的，采用a ’链的N端片段的异源表达。在巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)的分泌-感受态的酵母细胞中达成目标。纯化重组多肽并在H印G2细胞中评价它的生物学活性。通过使用此生物技术方法，能够获得足够量的重组多肽以在体外试验而且也在体内实验中测试。附图
描述图IpPICZ a B-e a ’构建体的概观。e a ’的表达由AOX(醇氧化酶)甲醇可诱导的启动子(5’ AOXI)驱动；a交配因子(a -MF)促进重组蛋白分泌到培养基中；A0X1TT A0X转录终止区。Sh ble基因赋予对zeocin的抗性；pUC Ori :大肠杆菌中高数量质粒拷贝的复制起点。其他缩写指限制酶的切割位置；bp :碱基对。图2重组多肽(e a ’)和野生型大豆a ’亚基的序列比对。星表明两个序列中相同的氨基酸残基。图2A重组多肽(e a ) ’的序列(SEQ IDl)图2B野生型大豆a ’亚基的序列(SEQ ID2)图3A重组巴斯德毕赤酵母培养物的还原条件下的SDS-PAGE 第M道分子重量标志物第I道在用甲醇诱导以前TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。第2道在用甲醇诱导I小时以后TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。第3道在用甲醇诱导8小时以后TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。第4道在用甲醇诱导19小时以后TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。第5道在用甲醇诱导25小时以后TCA沉淀的培养物上清液(无细胞)。
图3B e a ’纯化步骤的还原条件下的SDS-PAGE第M道分子重量标志物第I道发酵肉汤的冻干粉第2道DEAE_纤维素150mM NaCl洗脱的级分
第3道DEAE-纤维素250mM NaCl洗脱的级分发明详述现在在以下实验部分中将详细描述本发明
材料和方法
酵母、细菌株和化学品。巴斯德毕赤酵母X33 (WT)菌株(Invitrogen, San Diego,CA)用于酵母表达。遗传操作使用的细菌株为大肠杆菌XLl-Blue (Invitrogen, San Diego,CA)。限制酶 Pst I 和Xba I 购自 Roche (Indianapolis, IN), Sac I 来自 Fermentas (Ontario,Canada) Taq DNA 聚合酶购自 Invitrogen (San Diego, CA)。Zeocin 购自 Invivogen (SanDiego, CA)。PCR的寡核苷酸获取自Primm(Milano,意大利)。蛋白胨、胰蛋白胨、酵母提取物和琼脂购自Becton Dickinson and Company (Sparks, MD)。葡萄糖和山梨糖醇购自Sigma (St. Louis MO)。透析膜购自 Spectrum Laboratories (Rancho Dominguez, CA)。DEAE树脂购自 Whatman (Maidstone, England)。NiNTA 树脂购自 Qiagen (Hilden,德国)。对称C4HPLC 柱购自 Waters (Milford, MA)。其他化学品为来自Sigma (St. Luis, MO)或来自Merck (Darmstadt,德国)的试剂纯。培养基和生长环境。在YPD (酵母蛋白胨葡萄糖)完全培养基(2%蛋白胨、I %酵母提取物、2%葡萄糖)中培养巴斯德毕赤酵母X33菌株。在含有YPD、I. 5%琼脂、IOOmg/mLzeocin的平板中选择Mut+转化体。将全部酵母培养物维持在30°C。对于异源蛋白质检测，在YPS(酵母蛋白胨山梨糖醇)培养基(2%蛋白胨、1%酵母提取物、2%山梨糖醇)中培养Zeolr-Mut+转化体至600nm光密度为5。然后加入甲醇至最终浓度I %。在含有zeocin的低盐LB (Luria-Bertani)培养基(I %胰蛋白胨、0. 5 %酵母提取物、0. 5 %氯化钠、I. 5 %琼脂、25mg/mL zeocin)的平板中选择全部细菌转化体。将全部细菌培养物维持在37°C。构建ea’基因表达载体。通过PCR在表达巴斯德毕赤酵母质粒DNA模板(PPICZaB)上扩增ea ’基因，所述模板含有包含目标序列(e a ’)的插入片段。设计寡核苷酸5’ -GAAAAGATAGATTAAAGCTGCAGTGGAGGAAG-3，以在 e a ’ 基因的 5’ 端生成 PstI 限制位点。此突变导致丙氨酸残基插入于e a ’的N端位置中。设计又一个寡核苷酸5’ -CCCTTCTTATTCTTTCTAGATCATGGTTCTCTTTGAGACTC-3’ 以在 ea’基因的 3’端生成XbaI限制位点。将两个寡核苷酸都溶解于mQ无菌水中。PCR反应混合物由0. 5mM引物、0. 8mM dNTP (Eppendorf, Hamburg,德国)、30ng 模板(pPICZ a B /t a ’)、2.5U Taq DNA 聚合酶、PCR 缓冲液(最终组成50mM KCl、1.5mM MgCl2,20mM Tris-Cl.pH 8. 4 和 mQ 无菌水至最终体积25mL)组成。使用如下条件在Perkin Elmer Geneamp PCR System 2400热循环仪(Perkin Elmer Corp. , Wellesley, MA)上实施 PCR 扩增起始于 94°C达 10 分钟；30个循环的于94°C达40秒，60°C达40秒，72°C达20秒；最终延伸72°C达10分钟并且维持在40C。酶消化465bp的PCR产物至423bp的全尺寸构建体，并且将它克隆入pPICZ a B载体获取pPICZ a B-e a ’构建体并且转化入XLl-Blue大肠杆菌细胞中。在含有四环素和zeocin的半固态LB培养基上选择阳性克隆。将这些克隆中的一个通过Primm(Milano,意大利)测序以保证在pPICZ a B-e a ’构建体序列中没有突变发生。通过用限制酶SacI消化将20 y gpPICZaB-e a ’构建体和30 y g表达载体pPICZ a B (阴性对照)线性化并然后纯化。在巴斯德毕赤酵母基因组中转化pPICZaB-e a ’。用20 ii g线性化的pPICZ a B~e a ’ 构建体和 30 U g 线性化的 pPICZ a B 在设为 I. 5kV 的 Eppendo rf (Hamburg,德国)电穿孔仪2510设备上通过电穿孔转化野生型(wt)酵母细胞。首先通过铺平板在含有lOOmg/mL zeocin的YPD平板上选择转化体。为了证实我们的构建体整合入转化的巴斯德毕赤酵母基因组，使用Dneasy Plant Mini Kit (QIAGEN，Hilden，德国)以提取基因组 DNA。通过使用 5’ AOXl (5 ' -GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3 ')和 3’ AOXl 引物(5' -GCAAATGGCATTCTGACATCC-3')的PCR，使用基因组DNA作为模板以验证构建体在醇氧化酶启动子(A0X1)位点的插入。PCR反应混合物由0. 5mM引物、0. 25mM dNTP、IOOng基因组模板、2. 5U Taq DNA聚合酶、PCR缓冲液(最终组成如上)组成。使用如下条件实施PCR反应起始于94°C达10分钟；30个循环的于94°C达40秒，60°C达40秒，72°C达20秒；最终延伸72°C达10分钟并且维持在4°C。转化体克隆选择。在震荡(180rpm)培养器中的30°C 50mL YPS培养基中生长18个Zeo+转化体和I个含有pPICZ a B表达载体(阴性对照)的转化体至0D_ = 5。诱导期通过加入甲醇至最终浓度1%引发并且延长至24小时。通过SDS-PAGE检测上清液等份试样的ea ’表达。选择具有最高ea ’表达的克隆转化体用于重组蛋白质发酵罐规模的生产。ea’表达发酵罐规模。为了大量生产，根据Invitrogen的“毕赤酵母发酵过程指南”(版本B,053002)在14L发酵罐(Chemapj^i)中生长选择的克隆。在不带挡板的摇瓶中的 YNB 培养基(KH2PO4 2. Og ； (NH4)2SO4 10.0g;MgS04 IW2Q 1.0g;NaCl 0. 2g ；CaCl2 0.28;100%甘油10.(^;1(011至？11 5. 2 ;蒸馏水至I. 0L)上制备接种物培养物。在30°C，250rpm孵育约24小时后，使用I. OL种子培养物接种发酵罐，用8. 5L基础盐培养基(Basal Salt Medium) (H3PO4 85% 227mL ；CaSO4 2H20 7. 9g ；K2S04 155g ；MgS04 7H20 127g ；KOH 35g;100%甘油340g;蒸馏水至8. 5L;在灭菌后用NH4OH将pH调节至5. 0)制备所述发酵罐。用生物素和肌醇(各lmg/L)补充引用的两个培养基。也用修改的PTM1痕量盐溶液(Trace Salt Solution) (H2SO4 96% 2. 5mL ；CoC2O4. 2H20 243mg ；CuSO4. 5H20 3. Og ；KI44. 5mg ；MnSO4= H2O I. 5g ；Na2MoO4= 2H20 IOOmg ；H3BO3 IOmg ;FeS04。7H20 32. 5g ；ZnCl2 IOg ；蒸馏水至500mL)补充基础盐培养基。通过三步过程获得微生物的生长和异源蛋白质的表达。约24小时的第一批生长阶段(甘油作为碳源)，接着是约4小时的补料分批阶段(甘油作为限制性碳源)。在首先的这两个阶段期间，通过加入20% NH4OH将pH维持在5. O。一旦全部甘油被消耗，起始甲醇补料以引发e a ’蛋白表达并且通过加入20^NH4OH将pH改变至6. O。甲醇补料分批阶段持续约24小时。在这两个补料分批阶段，通过搅拌器速度(rpm)的精密电子控制，而手动渐进地提高通气速率(vvm)将溶解氧(Dissolved Oxygen) (D0% )稳定维持在30%。每几个小时，通过跟随D0%水平检查碳源限制性环境在突然停止甲醇补料后它的数据应该显示急剧增加，并且反之亦然，在恢复甲醇之后迅速降低。每几个小时，从发酵罐中在无菌环境下取得样品，用于下述分析光密度(X 600nm)、细胞生物质％ (湿重)、无菌、显微镜观察、SDS-PAGE。e a，纯化发酵肉汤的下游加工。将约9. 2L培养物从发酵罐中流出并且在冰上冷却。在+4°C实施全部随后的操作。通过在3，OOOXg达30分钟离心(Centrikon T-124，Kontron Instruments)分离全部培养物；丢弃生物质(片状沉淀物)；通过在Zetaplus30SP (Cuno)上深度过滤澄清约7. 5L上清液，并且随后在0. 22 y m过滤器(Millipak 100，Millipore)上微过滤上清液。通过在MWCO IOkDa的聚醚砜膜(Omega filter, PalD上超滤浓缩澄清的滤液。浓缩物，约300mL，对3. OL Tris-HCl IOmM pH 7. 2渗滤并最终被低压冻干。用这个流程获得34. 5g冻干粉，在SDS-PAGE上显示了相当低程度的污染物蛋白质并且具有约25% p/p的总蛋白质含量(Bradford Protein Assay,牛血清白蛋白作为校准标准)。e a，纯化色谱纯化。为了更高性能的凝胶电泳，根据提供者的流程使用]VllPAGE Pre-Cast GelSystem(Invitrogen)。将两克冻干粉溶解于150mL 50mMTris-HCl, pH 7. 50中并且将其装 载到用相同的缓冲液平衡的DEAE-纤维素柱上(6X 10cm, Whatman, Maidstone, UK)。用分别含有150和250mMNaCl的相同缓冲液实施保留的蛋白质的洗脱。用0. 25M NaCl (300mL)洗脱的级分展示了 ea’的最大含量。通过冷冻-干燥将溶液浓缩至IOOmL,并且随后用6000-8000Da膜在4°C用milliQ超滤水透析溶液24小时并随后冷冻干燥。获得约370mg蛋白质。为了验证蛋白的均质性,将约Img蛋白质装载到对称C4(4. 6X250mm)反相柱上。使用缓冲液A (超滤水和0. 1%三氟乙酸)和缓冲液B (100%乙腈+0. 1%三氟乙酸)。电泳技术。在12%聚丙烯酰胺凝胶上，根据参考文献11，使用mini-Protean
IIcell (Bio-Rad)实施在还原条件下(2% P -巯基乙醇)的SDS-PAGE。用考马斯蓝(Coomassie Blue)给凝胶染色。细胞培养物。建立的人肝细胞瘤细胞系(HepG2)获取自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection) (Rockville, MD)。Eagle 极限必需培养基(MEM)、胎牛血清、胰蛋白酶-EDTA(Ix)、青霉素(105U/L)、链霉素(100g/L)、tricine缓冲液(ImmoI/L, pH 7.4)和非必需氨基酸溶液(IOOx)来自GIBCO(Madison, WI)。培养皿来自 COSTAR (Cambridge, MA)。过滤器来自 Millipore (Bedford, MA)。ProteinCoomassie Plus Protein Assay 试剂盒购自 Pierce (Rockford, IL,美国)。I OOmmo I/L NaOH 中无载体的碘 125 来自 Perkin Elmer Life Sciences (Boston, MA)。SephadexG25 柱(PD 10)来自 Pharmacia Biotech (Uppsala,瑞典)。LDH 和 MTT 试剂盒来自 SigmaDiagnostics (Milano-意大利)。其他分析级的化学品来自 Merck (Darmstadt, Germany)。在90mm直径的培养皿中单层种植细胞，并且维持在37°C、95%空气，5% CO2的湿化的大气和用10%胎牛血清(FCS)、非必需氨基酸溶液(1%, v/v)、青霉素(105U/L)、链霉素(0. Ig/L) > tricine 缓冲液(20mmol/L, pH 7. 4)、NaHC03 (24mmol/L)和丙酮酸钠(0. llg/L)补充的MEM中。对于设计用来评价LDL受体调节的实验，将细胞种在35mm塑料盘中(3_5xl05个细胞)并且在将要达到汇合之前使用。在全部细胞培养物实验中，每2-3天更换培养基。为了评价细胞活力，基本如参考文献9中所描述的，通过甲基四唑盐(MTT)测定检测来自暴露于不同浓度e a ’的细胞的培养基。通过使用动态(LDH/LD)诊断试剂盒(Sigma Diagnostics)测量乳酸脱氢酶(LDH)活性确定细胞酶渗漏。通过顺序制备超离心[12]从临床健康的正常血脂的志愿者的血浆中分离LDL (I. 019 ^ I. 063g/L)。根据如由Bilheimer等人修改的McFarlane方法[13]，和先前描述的[3]方法标记脂蛋白。125I-LDl通过过滤(Millipore过滤器，0.45 孔径)灭菌并且在4°C贮藏直到使用。如先前描述地制备人脂蛋白缺陷型血清(LPDS) [9]。125I-LDL的摄取和降解。在含有/缺乏列于表中的不同浓度的e a ’或3. 5 ii mol/La ’纯化的亚基或I. 0 ii mol/L辛伐他汀(simvastatin)的情况下,在37°C用5g/100g LPDS补充的MEM中预先孵育单层细胞24小时以增量调节LDL-受体[2]。随后向培养基中加入固定浓度(7. 5mg/L)的125I-LDL并且在37°C继续孵育另外5小时。如先前报道地评价125I-LDL的特定的摄取(结合+内化)和降解[2]。统计分析。通过ANAOVA以及随后的Dunnett检测确定在用不同浓度的e a ’孵育细胞之后LDL细胞摄取和降解的差异。以平均值土SD表示数值；认为p值< 0. 05为统计 显著的。结果巴斯德毕赤酵母中ea ’的表达。在图I中显示了用于转化巴斯德毕赤酵母细胞的质粒的结构。在图2中显示了插入片段的序列和它与a’亚基的比对。如在材料和方法中所提到的，重组和野生型多肽之间仅存的差异在于N-端第一个氨基酸残基，由于技术原因，所述氨基酸残基在重组链中为丙氨酸。如通过培养基的SDS-PAGE分析所判断的(未显示)，选择显示了最大量重组多肽生产的克隆用于大量生产。图3-A显示了在用甲醇接种之前(第I道)和1-8-19和25小时之后(第2、3、4、5道)酵母培养物上清液的电泳分析。如它所显示的，由于诱导，在约20kDa的表观分子量处出现明显的带。e a ’的纯化。通过色谱方法达到e a ’的纯化。收集并通过SDS-PAGE分析来自每一步的样品。在图3-B中显示了纯化步骤对鉴定的多肽的同质性的作用。在培养基中已经达到了非常低程度的由酵母蛋白质的污染，而其它的色谱步骤移除主要的污染物蛋白质并且以几乎同质的形式容许重组多肽回收。这条带的N-端序列分析证实了此20kDa多肽对应于ea ’链。判断这一样品的纯度适合于细胞测定。e a ’的生物学活性。如下表所报道的，与未处理的细胞相比，向IfepG2细胞加入作为阳性对照的纯化的a ’亚基和它的截短的a ’形式在LDL受体介导的摄取和降解中产生显著的上升。表.a ’和它的截短的形式(e a ’)对IfepG2细胞U2的LDL摄取和降解上的作用
权利要求
1.具有SEQIDl的大豆7S球蛋白a ’亚基的N-端亲水片段。
2.制备权利要求I的大豆7S球蛋白的N-端亲水片段的方法，其包括重组多肽的克隆、在巴斯德毕赤酵母中表达和纯化。
3.包含与合适的载体混合的作为活性成分的权利要求I的大豆7S球蛋白的N-端亲水片段的组合物。
全文摘要
将大豆7S球蛋白截短形式的α’链(eα’)克隆并在巴斯德毕赤酵母中表达，所述截短形式的α’链在体内和体外模型中在调控胆固醇和甘油三酯内稳态中有活性。重组多肽跨越从N-端侧的142个氨基酸残基并且包括大豆α’亚基的N-端延伸区。通过常规的生物化学技术纯化eα’多肽并且在人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)中通过监测被标记的LDL的摄取和降解评价所述eα’多肽调节LDL受体活性的潜力。
文档编号C07K14/415GK102753571SQ201080032535
公开日2012年10月24日 申请日期2010年6月16日 优先权日2009年6月17日
发明者A·康索尼, A·里瓦, C·蓬佐内, D·贝兰达, M·杜兰蒂, P·莫拉佐尼 申请人:因德纳有限公司