一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生物医药检测技术领域，具体而言，涉及一种人免疫球蛋白制品中Tau 蛋白抗体含量的检测方法。
【背景技术】
[0002] Tau蛋白是与阿尔兹海默症相关的一种重要蛋白。人静脉注射免疫球蛋白 (intravenousimmunoglobulin，IVIG)是临床用于一种治疗免疫缺陷的药物，含多种抗体。 同时，有研究者发现静脉注射人免疫球蛋白制品能够治疗阿尔兹海默症，其作用机理可能 与免疫球蛋白中含有的Tau蛋白抗体有关。
[0003] IVIG若用于阿尔兹海默症的治疗，其中的Tau蛋白抗体含量的多少将是与其治疗 阿尔兹海默症效果相关的重要指标，因此，有必要对IVIG中Tau蛋白抗体含量进行检测。
[0004] 由于IVIG是以数千人份混合血浆为原料制备的血浆蛋白制品，因此其具有非常 丰富的抗体多样性，包含成千上万种蛋白、多肽、核酸甚至小分子物质的IgG抗体，能够与 多种成分发生抗原抗体反应，而单一一种抗体的含量也较少。常规的酶联免疫吸附实验中 用到的封闭液、稀释液中，常含有各种复杂成分，会与待测样品发生交叉反应而影响检测方 法的准确性；同时，因免疫球蛋白中的Tau蛋白抗体含量较低而不易检测，也会对检测方法 的准确性产生影响。
【发明内容】
[0005] 为了解决上述问题，本发明的目的在于提供一种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗 体含量的检测方法，以提高检测方法的准确性。
[0006] 本发明所采用的技术方案为：
[0007] -种人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量的检测方法，包括以下步骤：
[0008] A.抗原包被：在酶标板的每孔中加入Tau蛋白溶液，经孵育操作后用洗涤液洗 涤；
[0009] B.封闭：在所述酶标板的每孔中加入无蛋白封闭液，经孵育操作后用洗涤液洗 涤；
[0010] C. -抗孵育：在所述酶标板的每孔中加入待测样品，经孵育操作后用洗涤液洗 涤；所述待测样品为用稀释液稀释的人免疫球蛋白制品，所述稀释液为采用去免疫球蛋白 G的牛血清白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液配制的混合液，所述稀释液中的去免疫球蛋白G的 牛血清白蛋白的质量含量为0.5% -1.5% ;
[0011] D.二抗孵育：在所述酶标板的每孔中加入生物素偶联的抗一抗的抗体，经孵育操 作后用洗涤液洗涤；
[0012] E.酶标三抗孵育：在所述酶标板的每孔中加入标记酶偶联的链抗生物素蛋白，经 孵育操作后用含有NaCl和Tween-20的Tris-HCl缓冲液洗涤；
[0013] F.吸光度检测及含量计算：在所述酶标板的每孔中加入显色底物进行显色反应， 经孵育操作后再加入终止液终止反应，然后将所述酶标板放入检测装置中进行吸光度检 测，得待测样品的吸光度值〇D#aWnan，并采用标准曲线法计算出待测样品中的Tau蛋白抗体 的含量。
[0014] 上述检测方法中，通过采用无蛋白封闭液而避免了因封闭液中的蛋白质与待测样 品中的多元抗体发生非特异性结合而影响检测结果；同时，采用去免疫球蛋白G的牛血清 白蛋白和磷酸钠-吐温缓冲液配制的混合液作为稀释液，避免了因稀释液中的牛血清白蛋 白中残留的IgG分子与检测体系发生交叉反应而影响检测结果，因此，提高了检测方法的 准确度。
[0015] 同时，为了避免因待测样品中Tau蛋白抗体的含量较少而不易测量的问题，上述 检测方法中，通过步骤C、步骤D和步骤E，使得吸附于酶标板上的Tau蛋白首先与步骤C中 作为一抗的待测样品中的Tau蛋白抗体发生特异性结合形成一抗复合物，即抗原抗体复合 物。然后该一抗复合物又与步骤D中作为二抗的生物素偶联的抗体特异性结合形成二抗复 合物；最后该二抗复合与步骤E中作为三抗的标记酶偶联的链抗生物素蛋白特异性结合形 成标记酶偶联的三抗复合物，通过步骤D和步骤E的生物素放大系统对待测样品中的Tau 蛋白抗体的检测信号进行了放大而使其与显示底物反应后易于被检测，提高了该检测方法 的准确性。
[0016] 再者，上述步骤A、B、C、D和E均具有洗涤操作，这样可以及时洗去各步骤中酶标 板上的游离成分和其他杂质蛋白，以免其影响检测结果的准确性。
[0017] 因此，该检测方法能够更准确地测定人免疫球蛋白制品中Tau蛋白抗体含量。
[0018] 其中，优选地，所述稀释液中的去免疫球蛋白G的牛血清白蛋白的质量含量为1%
[0019] 进一步，所述生物素偶联的抗一抗的抗体为生物素偶联的免疫球蛋白G的Fc片段 的抗体，所述生物素偶联的免疫球蛋白G的Fc片段的抗体为来源于其他物种的针对于人免 疫球蛋白G的Fc片段的抗体与生物素偶联后形成的抗体。
[0020] 上述生物素偶联的人免疫球蛋白G的Fc片段的抗体专门针对于人免疫球蛋白G 中的Fc片段而发生特异性反应，使其更加专一地与结合了Tau蛋白抗体的人免疫球蛋白G 结合，从而可以有效地避免其与测定体系中其它杂蛋白发生反应而影响检测的准确性，更 好地提高了该检测方法的准确性。
[0021] 进一步，所述生物素偶联的免疫球蛋白G的Fc片段的抗体为生物素偶联的羊抗人 免疫球蛋白G的Fc片段的抗体、生物素偶联的兔抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗体或者生 物素偶联的鼠抗人免疫球蛋白G的Fc片段抗体。
[0022] 进一步，所述Tau蛋白溶液的浓度为5-20μg/ml;所述洗涤液为磷酸盐缓冲液； 所述Tris-HCl缓冲液的浓度为0· 01-0. 02mol/L，其含有的NaCl的浓度为0· 1-0. 2mol/L， Tween-20的质量百分含量为0· 05% -0· 2%。
[0023] 优选地，所述Tau蛋白溶液的浓度为15μg/ml;所述所述Tris-HCl缓冲液的浓度 为0· 015mol/L，其含有的NaCl的浓度为0· 15mol/L，Tween-20的质量百分含量为0· 1%。
[0024] 进一步，所述标记酶为碱性磷酸酶，所述显色底物为对硝基苯磷酸二钠，所述终止 液为强碱溶液，所述吸光度检测是检测酶标板在波长405nm的吸光度值；或者所述标记酶 为辣根过氧化物酶，所述显色底物为双氧水与四甲基联苯胺或者双氧水与邻笨二胺，所述 终止液为强酸溶液，所述吸光度检测是检测酶标板在波长450nm或492nm的吸光度值。
[0025] 显色底物为双氧水与四甲基联苯胺时，吸光度检测的波长为450nm;显色底物为 双氧水与邻笨二胺时，吸光度检测的波长为492nm。
[0026] 进一步，所述洗涤液和所述Tris-HCl缓冲液的洗涤次数均分别为3-5次。
[0027] 上述洗涤次数分别为3-5次，以充分洗去各步骤中的游离成分以及其他残留的杂 质蛋白。
[0028]进一步，所述孵育操作的孵育温度为4-37°C，孵育时间为5min-16h。
[0029] 上述检测方法中，各步骤的孵育操作的温度可以为4-37Γ，根据孵育温度，其孵育 时间可以在5min-16h内进行适当调整。温度高时，孵育时间短些；而温度低时，孵育时间长 止匕 -、〇
[0030]进一步，所述孵育操作的孵育温度为25°C，孵育时间为8min-4h。
[0031] 温度较高时，应缩短孵育时间，以免因孵育时间填充而发生非特异性结合或酶促 反应过度而影响检测结果。
[0032] 进一步，步骤F中的所述标准曲线法包括以下步骤：
[0033] 溶液配制：将标准品用稀释液进行梯度稀释，得到不同浓度的标准品溶液；
[0034] 标准曲线绘制：根据所述检测方法分别测定所述不同浓度的标准品溶液经检测反 应后的吸光度值，再以的值对标准品中Tau蛋白浓度值绘制标准曲线并获得 曲线方程；
[0035] 结果计算：将测得的所述待测样品的吸光度值0D#aWnan代入曲线方程计算待测样 品中Tau蛋白抗体含量。
[0036] 其中优选地，标准品溶液的浓度为1. 95ng/ml-500ng/ml之间。
[0037] 进一步，所述标准品为鼠抗人Tau蛋白单克隆抗体，且所述标准曲线绘制中，所用 的生物素偶联的抗一抗的抗体为生物素偶联的羊抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体或者 生物素偶联的兔抗鼠免疫球蛋白G的Fc片段的抗体。
[0038] 容易理解的，根据所选用的作为标准品的Tau蛋白单克隆抗体