专利名称：静注人免疫球蛋白的制备方法
静注人免疫球蛋白的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物制药领域，尤其涉及一种静注人免疫球蛋白的制备方法。背景技术：
目前，已知的血浆蛋白成分超过200种，已经能够分离纯化出来的有100余种，其中研究较多的有70多种。血浆蛋白成分除白蛋白和免疫球蛋白外，其余含量较少，而且各成分间含量差异极大。按照生理功能，血浆蛋白可分为转输蛋白类、免疫球蛋白类、凝血系统蛋白类和蛋白酶抑制物；按照临床应用，血浆蛋白又可分为白蛋白类、免疫球蛋白类、凝血因子类和微量蛋白类。血浆蛋白制品原为战争需求的产物。在第二次世界大战期间，由于战事的扩大，伤员急需大量的血液进行治疗，而新鲜血液的缺陷和供应不足，贻误了伤员救治的时间。美国哈佛大学接受军方委托E. J. Cohn教授领导一个研究组着手建立血浆蛋白的的分离工艺， 并于1941年制备出白蛋白供临床观察。1942年Cohn法大规模生产白蛋白供美军使用， 之后至1943年间，免疫球蛋白、纤维蛋白原制剂、凝血酶原、抗血友病球蛋白以及凝血酶原复合物也相继生产。Cohn等人建立了经典的低温乙醇工艺。1962年，瑞士红十字会的 Nitschmann和Kistler对低温乙醇法进行改良，建立了 Nitschmann-Kistler低温乙醇蛋白分离法。低温乙醇法制备血浆蛋白主要是往蛋白水溶液中加入水溶性有机溶剂，如乙醇、 丙酮等。加入水溶性有机溶剂后将会产生几种效应，主要效应是降低水分子的活度、降低溶液的介电常数，从蛋白质分子周围排代水分子，使蛋白质分子与蛋白分子通过极性基团的相互作用，在范德华引力下发生凝聚.。绝大多数血液制品生产厂家仍在采用传统的Cohn 和Nitschmarm-Kistler低温乙醇工艺制备静注人免疫球蛋白。采用上述低温乙醇工艺制备静注人免疫球蛋白，IgG(免疫球蛋白G)制剂中含有少量IgG聚合体、PKA (激肽释放酶原激活剂)以及IgA (免疫球蛋白A)。IgG聚合体能启动补体结合反应，一些被激活的补体有过敏毒素作用和细胞毒作用，使血管通透性增加，平滑肌收缩，释放组织胺，破坏细胞膜等，从而引起病理生理反应。PKA能激活激肽释放酶，作用于激肽原，产生缓激肽BK，缓激肽BK有平滑肌收缩，毛细血管透性增高，白细胞游走和聚集作用，可使人体血压下降，甚至休克。IgG制剂中的少量IgA，一般无大妨碍，但是给IgA缺乏的患者注射可使之致敏产生抗体，再次注射可发生急性过敏反应。
发明内容有鉴于此，本发明提供一种提高IgG制剂的纯度的静注人免疫球蛋白的制备方法。一种静注人免疫球蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤从血浆中沉淀组分I+II+III 将低温冰冻血浆融化为液体状态，加入95%的-15°C药用乙醇至最终乙醇浓度至20 %，同时调节pH至6. 9 7. 0，血浆蛋白含量5. 0 %， 调控温度至_5°C，搅拌1小时以上，静置4小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集组分沉淀 I+II+III ；从组分I+II+III中沉淀组分I+III 在组分I+II+III沉淀加入10倍注射用水重溶解，加入95%的-15°c药用乙醇至最终乙醇浓度至17%，同时调节PH至5. 0 5. 4，悬液蛋白含量0.8 1.2%，调控温度至_5°C，搅拌1小时以上，静置4小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集上清液；从上清液中沉淀组分II 将上清液调节PH至7. 0 7. 2，蛋白质含量0. 5%，加入 95%的_15°C药用乙醇至最终乙醇浓度至25%，调控温度至_7°C，搅拌1小时以上，静置8 小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集组分II沉淀；将组分II进行阴离子交换层析；将层析流出液进行超滤；以及将超滤后的制品溶液进行除菌过滤。优选地，所述将组分II进行阴离子交换层析的步骤进一步包括以下步骤按组分 II沉淀重量5 8倍加入0 2°C注射用水搅拌至完全溶解，静置30分钟将溶解液深层过滤；以及过滤液采用0.9%氯化钠溶液调电导率至1.9士0. 1ms，用0. 5mol/L盐酸调pH值 6. 30士0. 10上平衡后的层析柱，处理至流出液电导率1. 9士0. 1ms、pH为6. 30士0. 10后上待处理制品。优选地，在所述将组分II进行阴离子交换层析的步骤中，所用凝胶的平衡程序如下2 3倍凝胶体积注射用水洗涤；3倍凝胶体积0. 5mol/L氢氧化钠溶液处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；6倍凝胶体积醋酸盐缓冲液处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；以及 6 9倍凝胶体积磷酸盐缓冲液。优选地，在上述凝胶平衡程序中，所述醋酸盐缓冲液配方为6g氢氧化钠加上40ml 醋酸加注射用至lL，pH为4.0。优选地，在所述将组分II进行阴离子交换层析的步骤中所用的凝胶为 DEAE-Sepharose。优选地，所述DEAE-kpharose凝胶可按如下程序再生1 2倍凝胶体积磷酸盐缓冲液处理；6倍凝胶体积醋酸盐缓冲液处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；3倍凝胶体积 2mol/L氯化钠溶液洗脱杂质蛋白；3倍凝胶体积注射用水洗涤；3倍凝胶体积0. 5mol/L氢氧化钠溶液处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；以及0. lmol/L氢氧化钠溶液保存或平衡后使用。优选地，在上述凝胶再生程序中，所述醋酸盐缓冲液的配方为17. 5g氯化钠加上 6g氢氧化钠加上40ml醋酸加注射用水至1L，pH为4. 0。优选地，所述磷酸盐缓冲液的配方为1. 2g氢氧化钠加上1. 6ml浓磷酸加注射用水至 1L，pH 为 6. 3。优选地，在所述阴离子交换层析上待处理制品之前，目标免疫球蛋白的pH范围为 6. 3 7. 3o优选地，所述将层析流出液进行超滤的步骤进一步包括以下步骤将组分II沉淀用3 5倍注射用水溶解，进行深层过滤，用50K分子量孔径膜包进行透析，去除无机盐离子和乙醇分子，最后浓缩至所需要的蛋白质浓度。。本发明的静注人免疫球蛋白的制备方法在超滤之前采用阴离子交换层析技术，降低或去除IgG制剂中的IgG聚合体、PKA和IgA，同时防止IgG分子再聚合，大大提高IgG制剂的纯度。
图1为本发明的优选实施例静注人免疫球蛋白的制备方法的示意图。具体实施方式
为了更好地理解本发明，以下将结合附图对发明的实施例进行详细的说明。针对上述技术方案的缺点本发明提供一种静注人免疫球蛋白的制备方法，主要是解决IgG制剂的纯度问题，降低或去除IgG制剂中的IgG聚合体、PKA和IgA，同时防止IgG 分子再聚合。请参阅图1，本发明静注人免疫球蛋白的制备方法的优选实施例包括以下步骤如步骤Sl中所示，从血浆中沉淀组分I+II+III。将低温冰冻血浆融化为液体状态，加入95%的-15°C药用乙醇至最终乙醇浓度至20%，同时调节pH至6. 9 7. 0，血浆蛋白含量5. 0%，调控温度至-5°C，搅拌1小时以上，静置4小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集组分沉淀I+II+III。如步骤S2中所示，从组分I+II+III中沉淀组分1+111。在组分I+II+III沉淀加入10倍注射用水重溶解，加入95%的-15°c药用乙醇至最终乙醇浓度至17%，同时调节PH 至5. 0 5. 4，悬液蛋白含量0. 8 1. 2%，调控温度至_5°C，搅拌1小时以上，静置4小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集上清液。如步骤S3中所示，从上清液中沉淀组分II。将上清液调节pH至7. 0 7. 2，蛋白质含量0. 5%，加入95%的-15°C药用乙醇至最终乙醇浓度至25%，调控温度至_7°C，搅拌 1小时以上，静置8小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集组分II沉淀。在上清液中加入0. 5g/L硅藻土压滤分离组分II沉淀，将组分II沉淀-30°C以下冻存，上清液废弃。如步骤S4所示，将组分II进行阴离子交换层析。按组分II沉淀重量5 8倍加入 0 2°C注射用水搅拌至完全溶解，静置30分钟将溶解液深层过滤。过滤液采用0. 9%氯化钠溶液调电导率至1.9士0. 1ms，用0. 5mol/L盐酸调pH值6. 30士0. 10上平衡后的层析柱。 凝胶平衡程序如下2 3倍凝胶体积注射用水洗涤；3倍凝胶体积0. 5mol/L氢氧化钠溶液处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；6倍凝胶体积醋酸盐缓冲液(6g氢氧化钠+40ml醋酸加注射用至lL，pH4. 0)处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；6 9倍凝胶体积磷酸盐缓冲液 (1. 2g氢氧化钠+1. 6ml浓磷酸加注射用水至lL，pH6. 3)。处理至流出液电导率1. 9 士0. Ims, pH6. 30 士0. 10后上待处理制品。上述层析纯化用凝胶为DEAE-kpharose，用于人免疫球蛋白IgG的纯化。目标蛋白IgG流穿凝胶，杂质蛋白与凝胶结合，凝胶经再生后复原。在层析上待处理制品之前，目标蛋白IgG的酸碱度范围为pH6. 3 7. 3。DEAE-Sepharose凝胶可再生，凝胶再生程序如下1 2倍凝胶体积磷酸盐缓冲液 (1. 2g氢氧化钠+1. 6ml浓磷酸加注射用水至1L，pH6. 3)处理；6倍凝胶体积醋酸盐缓冲液(17. 5g氯化钠+6g氢氧化钠+40ml醋酸加注射用水至1L，pH4. 0)处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；3倍凝胶体积2mol/L氯化钠溶液洗脱杂质蛋白；3倍凝胶体积注射用水洗涤；3 倍凝胶体积0. 5mol/L氢氧化钠溶液处理；3倍凝胶体积注射用水洗涤；0. lmol/L氢氧化钠溶液保存或平衡后使用。如步骤S5所示，将层析流出液进行超滤。将层析流出液进用3 5倍注射用水溶解，进行深层过滤，用50K分子量孔径膜包进行透析，去除无机盐离子和乙醇分子，最后浓缩至所需要的蛋白质浓度，即可得到静注人免疫球蛋白原液。透析完成后，在静注人免疫球蛋白原液中加入0. 5mol/L盐酸溶液，调pH至4. 0士0. 1，调蛋白质含量至50 100g/L，并按照90 110g/L加入麦芽糖。如步骤S6所示，除菌、分装。将超滤后的制品溶液进行除菌过滤，灌装至最终容
ο如步骤S7所示，成品检定。对分装后成品进行抽样，进行理化和生物学检定，合格后即可包装至成品，上市销售。本发明的静注人免疫球蛋白的制备方法在提取组分II沉淀至超滤之前增加阴离子交换层析技术。层析纯化用凝胶为DEAE-kpharose凝胶自身带正电荷，将目标蛋白IgG 调至pH6. 3，小于其等电点的pH7. 3而带正电荷，其它等电点在pH6. 3以下的杂质蛋白带负电荷，根据同种电荷相排斥，异种电荷向吸引的原理，目标蛋白IgG流穿凝胶，杂质蛋白与凝胶结合，凝胶经再生后复原。上述制备方法在超滤之前采用阴离子交换层析技术，解决IgG制剂的纯度问题， 降低或去除IgG制剂中的IgG聚合体、PKA和IgA，同时防止IgG分子再聚合。以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
权利要求
1.一种静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述制备方法包括以下步骤 从血浆中沉淀组分I+II+III 将低温冰冻血浆融化为液体状态，加入95%的-15°c药用乙醇至最终乙醇浓度至20%，同时调节pH至6. 9 7.0，血浆蛋白含量5.0%，调控温度至_5°C，搅拌1小时以上，静置4小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集组分沉淀 I+II+III ；从组分I+II+III中沉淀组分I+III 在组分I+II+III沉淀加入10倍注射用水重溶解， 加入95%的-15°c药用乙醇至最终乙醇浓度至17%，同时调节PH至5. 0 5. 4，悬液蛋白含量0. 8 1. 2%，调控温度至_5°C，搅拌1小时以上，静置4小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集上清液；从上清液中沉淀组分II 将上清液调节PH至7. 0 7. 2，蛋白质含量0. 5%，加入95% 的-15°C药用乙醇至最终乙醇浓度至25%，调控温度至-71，搅拌1小时以上，静置8小时以上后采用离心分离或加压过滤，收集组分II沉淀； 将组分II进行阴离子交换层析； 将层析流出液进行超滤；以及将超滤后的制品溶液进行除菌过滤。
2.根据权利要求1所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述将组分II 进行阴离子交换层析的步骤进一步包括以下步骤按组分II沉淀重量5 8倍加入0 2°C注射用水搅拌至完全溶解，静置30分钟将溶解液深层过滤；过滤液采用0.9%氯化钠溶液调电导率至1.9士0. 1ms，用0. 5mol/L盐酸调pH值 6. 30士0. 10上平衡后的层析柱，处理至流出液电导率1. 9士0. 1ms、pH为6. 30士0. 10后上待处理制品。
3.根据权利要求2所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于在所述将组分 II进行阴离子交换层析的步骤中，所用凝胶的平衡程序如下2 3倍凝胶体积注射用水洗涤； 3倍凝胶体积0. 5mol/L氢氧化钠溶液处理； 3倍凝胶体积注射用水洗涤； 6倍凝胶体积醋酸盐缓冲液处理； 3倍凝胶体积注射用水洗涤；以及 6 9倍凝胶体积磷酸盐缓冲液。
4.根据权利要求3所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于在上述凝胶平衡程序中，所述醋酸盐缓冲液配方为6g氢氧化钠加上40ml醋酸加注射用至lL，pH为4. 0。
5.根据权利要求2所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于在所述将组分 II进行阴离子交换层析的步骤中所用的凝胶为DEAE-kpharose。
6.根据权利要求5所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述 DEAE-Sepharose凝胶可按如下程序再生1 2倍凝胶体积磷酸盐缓冲液处理； 6倍凝胶体积醋酸盐缓冲液处理； 3倍凝胶体积注射用水洗涤；3倍凝胶体积2mol/L氯化钠溶液洗脱杂质蛋白； 3倍凝胶体积注射用水洗涤； 3倍凝胶体积0. 5mol/L氢氧化钠溶液处理； 3倍凝胶体积注射用水洗涤；以及 0. lmol/L氢氧化钠溶液保存或平衡后使用。
7.根据权利要求6所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于在上述凝胶再生程序中，所述醋酸盐缓冲液的配方为17. 5g氯化钠加上6g氢氧化钠加上40ml醋酸加注射用水至lL，pH为4.0。
8.根据权利要求3或6中任一项所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于 所述磷酸盐缓冲液的配方为1. 2g氢氧化钠加上1. 6ml浓磷酸加注射用水至lL，pH为6. 3。
9.根据权利要求2所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于在所述阴离子交换层析上待处理制品之前，目标免疫球蛋白的PH范围为6. 3 7. 3。
10.根据权利要求1所述的静注人免疫球蛋白的制备方法，其特征在于所述将层析流出液进行超滤的步骤进一步包括以下步骤将组分II沉淀用3 5倍注射用水溶解，进行深层过滤，用50K分子量孔径膜包进行透析，去除无机盐离子和乙醇分子，最后浓缩至所需要的蛋白质浓度。
全文摘要
本发明提供一种静注人免疫球蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤从血浆中沉淀组分I+II+III；从组分I+II+III中沉淀组分I+III；从上清液中沉淀组分II；将组分II进行阴离子交换层析；将层析流出液进行超滤；以及将超滤后的制品溶液进行除菌过滤。本发明的静注人免疫球蛋白的制备方法在超滤之前采用阴离子交换层析技术，降低或去除IgG制剂中的IgG聚合体、PKA和IgA，同时防止IgG分子再聚合，大大提高IgG制剂的纯度。
文档编号C07K1/34GK102443059SQ201110348210
公开日2012年5月9日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者徐建生, 王保林, 田健生 申请人:武汉中原瑞德生物制品有限责任公司