专利名称：醋酸卡培立肽的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种多肽的制备方法，尤其涉及一种醋酸卡培立肽的制备方法。
背景技术：
本品所含卡培立肽，别名基因重组心房肽、卡哌利丁、Hamp、人脑利钠肽。它的适应症是急性心功能衰竭(包括慢性心功能衰竭加重)。；卡培立肽药理学作用是通过刺激心肌伸展，由心室内颗粒合成的，然后通过冠状动脉分布全身，作用于血管平滑肌和肾脏等组织，调节血压和体内电解质平衡。本品为观个氨基酸组成的一种循环调节激素，起血管扩张和利尿作用。本品引起的血管舒张是由于与血管平滑肌的ANP(心房利钠多肽)受体结合，通过提高鸟苷酸环化酶的活性而实现的，提示可减轻心脏前、后负荷。目前国内有一篇卡培立肽专利(专利号ZL200510012425.5)，采用的是基因重组技术生产，未见固相合成工艺方法的报道；CA1245635A1专利报道的为采用Boc路线合成卡培立肽，CA1245637A1专利报道的为采用基因重组技术生产卡培立肽，其它的专利如EP0440311A1、JP3004169A、US4673732A等都是或者采用基因重组技术生产卡培立肽或者采用Boc路线合成卡培立肽，未见采用Fmoc路线合成卡培立肽的相关文献及专利。
发明内容
本发明提出了一种采用固相Fmoc合成线性卡培立肽的制备方法，整个工艺操作方便、收率高。本发明提供的一种制备醋酸卡培立肽的方法，包括以下步骤
1)由Fmoc-Tyr (tBu)-OH 禾口替代度为 0. 5mmol/g -1. Ommo 1/g 的 Wang Resin 反应,得至IjFmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin ；
2)将Fmoc-Tyr(tBu) -Wang Resin树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性卡培立肽_Wang Resin ；
3)采用固相氧化法氧化卡培立肽-WangResin ；
4)采用TFA裂解，得到粗肽；
5)经过反相高效色谱纯化、冻干得到醋酸卡培立肽。本发明相对于Boc法，Fmoc法操作简单，对环境污染小。采用Wang Resin (Wang-树脂)不仅成本低，更加具有社会价值，而且Wang Resin能够使整个固相合成反应稳定。申请人意外地发现，本合成中Wang resin的替代度对反应的收率有着重要影响，当wang resin的替代度大于1. Ommol/g时，合成产物卡培立肽的收率明显降低；当Wang resin的替代度低于1. Ommol/g时，收率比较稳定，但是当替代度低于0. 5mmol/g时，Wang resin用量会大幅度增加，对合成产品卡培立肽的成本影响很大。为了寻求收率与成本的最佳结合点，本发明采取用替代度为0. 5mmol/g -1. Ommol/g的WangResin0
本发明采用逐一偶联的方式合成得到线性卡培立肽-Wang Resin，偶联过程采用的偶联剂包括DIC/HOBt、PyBOP/HOBt或TBTU/HOBt。同时采用有机碱包括TEA、NMM或DIPEA0优选体系为TBTU/HOBt体系，优选有机碱为NMM。实验发现，采用本发明的多种偶联体系能显著提高反应效率。申请人意外地发现，有机碱为TEA、NMM或DIPEA，可以有效的防止合成产物消旋。采用固相碘氧化法在应用于氧化卡培立肽-Wang Resin，碘的用量是一个非常重要的因素，当碘的物质量大于卡培立肽-Wang Resin物质量的80倍时，由于用量过高，致使氧化产物复杂，难以纯化；当碘的物质量小于卡培立肽-Wang Resin物质量的10倍时，氧化的收率很低，致使反应效率低下。申请人意外的发现，当碘的物质量是卡培立肽-WangResin物质量的10-80倍时，是平衡了反应效率和纯化难度的一个理想范围。其中氧化时间确定为4-16小时。所述步骤5)卡培立肽反相高效色谱纯化包括以下步骤
第一步纯化将合成所得粗肽溶解后用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A相，缓冲溶液pH范围为2. 5-3.5 ；色谱纯乙腈为B相，B相的梯度为17% 32%，进行梯度洗脱纯化45-120min。磷酸盐缓冲溶液可以为体积浓度是0. 1-0.洲的磷酸缓冲溶液；
第二步转盐采用RP-HPLC法将其转成醋酸盐。作为A相的醋酸盐缓冲溶液浓度应为0. 5-0. 1% ；缓冲溶液pH应为3. 5 4. 4 ；第二步转盐的色谱纯乙腈B相的梯度为6% 36%，梯度洗脱时间为30-90 min0其中min是单位分钟的英文缩写。
采用本纯化方法，可以使整个生产过程可控性高、重现性好，同时可以得到很高的产率。 本发明合成方法示意流程如下其中
Fmoc-Tyr (tBu) -OH代表N_芴甲氧羰基-侧链叔丁基保护酪氨酸
Fmoc-Arg (R) -OH代表N_芴甲氧羰基-侧链R基保护精氨酸
Fmoc-Phe-OH代表N_芴甲氧羰基苯丙氨酸
Fmoc-Ser (R) -OH代表N_芴甲氧羰基-侧链R基保护丝氨酸
Fmoc-Asn (R) -OH代表N_芴甲氧羰基-侧链R基保护天冬酰胺
Fmoc-Cys (R) -OH代表N_芴甲氧羰基-侧链R基保护半胱氨酸
Fmoc-Gly-OH代表N_芴甲氧羰基甘氨酸
Fmoc-Leu-OH代表N_芴甲氧羰基亮氨酸
Fmoc-Gln (R) -OH代表N_芴甲氧羰基-侧链R基保护谷氨酰胺
Fmoc-Ala-OH代表N_芴甲氧羰基丙氨酸
Fmoc-Ile-OH代表N_芴甲氧羰基异亮氨酸
Fmoc-Asp (R) -OH代表N_芴甲氧羰基-侧链R基保护天冬氨酸
Fmoc-Met-OH代表N_芴甲氧羰基-蛋氨酸
当氨基酸为精氨酸时，侧链R=Pbf (2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃_5_磺酰基)；当氨基酸为丝氨酸、天冬氨酸时，侧链R=tBu (叔丁基)；当氨基酸为半胱氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺时，侧链R=Trt (三苯甲基)。DIC代表二异丙基碳二亚胺DMAP代表4，4- 二甲氨基吡啶HOBt代表1-羟基苯并三氮唑
TBTU代表0-苯并三氮唑-N，N，N’，N’ -四甲基脲四氟硼酸酯TFA代表三氟乙酸TEA代表三乙胺
本发明工艺具有反应操作简单、后处理容易、原料投入少、成本低、收率高等特点，全部反应的总收率可达30%。具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
具体实施例方式下面结合附图
和实施例对本发明做进一步详细说明。Wang Resin购自天津南开和成有限公司，各种保护氨基酸购自吉尔生化有限公司。说明书和权利要求书中所使用英文缩写的含义列于下表中
Fmoc9-芴甲氧羰基DIC二异丙基碳二亚胺HOBt1 -羟基苯并三唑DIPEAN, N-二异丙基乙胺N丽N-甲基吗啉Pbf2，2，4，6，7-五甲基苯并呋喃-5-磺酰基Trt三苯甲基tBu叔丁基DMFN, N-二甲基甲酰胺DCM二氯甲烷DMF二甲基甲甲酰胺TFA三氟乙酸DMAP4，4-二甲氨基吡啶TBTU0-苯并三氮唑-N, N, N’，N’ -四甲基脲四氟硼酸酯
实施例 1> Fmoc-Tyr (tBu)-Wang Resin 的合成
在50ml的反应柱中加入4. 8克Wang ResinCsub=O. 5mmol/g)，加入DMF溶胀30分钟，并用适量 DMF 洗涤树脂三次。称取 Fmoc-Tyr (tBu)-OH (2. 89g, 6. 3mmol)，HOBT (1. 02g，7. 56mmol)，全部混合后，加入DMF (IOml) ,DCM(IOml)搅拌溶解完全。然后加入DIC (0. 98ml，
6.3mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，并加入DMAP( 29. 3mg,0. 24mmol),鼓氮气反应池。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂4次，然后加入乙酸酐(16. 2mlUSOmmol),批啶((13.81111、180讓01)，反应211。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。真空干燥，取样测其取代度为0. 3mmol/g。 实施例 2、Fmoc-Tyr (tBu) -ffang Resin 的合成
在50ml的反应柱中加入3. O克Wang ResinCsub=O. 8mmol/g)，加入DMF溶胀30分钟，并用适量 DMF 洗涤树脂三次。称取 Fmoc-Tyr (tBu)-OH (2. 89g, 6. 3mmol)，HOBT (1. 02g，
7.56mmol)，全部混合后，加入DMF (IOml) ,DCM(IOml)搅拌溶解完全。然后加入DIC (0. 98ml，6. 3mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，并加入DMAP( 29. 3mg,0. 24mmol),鼓氮气反应池。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂4次，然后加入乙酸酐(16. 2mlUSOmmol),
5批啶((13.81111、180讓01)，反应211。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。真空干燥，取样测其取代度为0. 4mmol/g。实施例 3、Fmoc-Tyr (tBu) -ffang Resin 的合成
在50ml的反应柱中加入2. 4克Wang ResinCsub=L Ommol/g)，加入DMF溶胀30分钟，并用适量 DMF 洗涤树脂三次。称取 Fmoc-Tyr (tBu)-OH (2. 89g, 6. 3mmol)，HOBT (1. 02g，7. 56mmol)，全部混合后，加入DMF (IOml) ,DCM(IOml)搅拌溶解完全。然后加入DIC (0. 98ml，6. 3mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，并加入DMAP( 29. 3mg,0. 24mmol),鼓氮气反应池。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂4次，然后加入乙酸酐(16. 2mlUSOmmol),批啶((13.81111、180讓01)，反应211。抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。真空干燥，取样测其取代度为0. 6mmol/g。实施例4、线性卡培立肽-Wang Resin的合成
将 5mmol Fmoc-Tyr (tBu) -ffang Resin (取代度=0. 4mmol/g)用 DMF 溶胀 30 分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg (pbf) -OH(9. 732g, 15mmol)、HOBT (2. 027g, 15mmol)，全部混合后加入 DMF (30ml)、DCM(30ml)搅拌溶解完全。然后加入DIC(2. 355ml, 15mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应池。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽-Wang Resin 47. 233g，树脂合成收率106. 3%。实施例5、线性卡培立肽-Wang Resin的合成
将 5mmol Fmoc-Tyr (tBu) -ffang Resin (取代度=0. 4mmol/g)用 DMF 溶胀 30 分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg (pbf) -OH (9. 732g, 15mmol)、PyBOP (7. 806g, 15mmol)、HOBT (2. 027g, 15mmol)，全部混合后加入DMF (30ml) ,DCM (30ml)搅拌溶解完全。然后加入NMM (3. 33ml，30mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应池。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽-Wang Resin 47. 695g,树脂合成收率108. 1%。实施例6、线性卡培立肽-Wang Resin的合成
将 5mmol Fmoc-Tyr (tBu) -ffang Resin (取代度=0. 4mmol/g)用 DMF 溶胀 30 分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg (pbf) -OH (9. 732g, 15mmol)、PyBOP (7. 806g, 15mmol)、HOBT (2. 027g, 15mmol)，全部混合后加入DMF (30ml)、DCM (30ml)搅拌溶解完全。然后加入DIPEA (4. 965ml，30mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应池。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽-Wang Resin 47. 102g,树脂合成收率105. 8%。实施例7、线性卡培立肽-Wang Resin的合成
将 5mmol Fmoc-Tyr (tBu) -ffang Resin (取代度=0. 4mmol/g)用 DMF 溶胀 30 分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg (pbf) -OH(9. 732g, 15mmol)、TBTU (4. 817g, 15mmol)、HOBT (2. 027g, 15mmol)，全部混合后加入DMF (30ml) ,DCM (30ml)搅拌溶解完全。然后加入NMM (3. 33ml，30mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应池。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽-Wang Resin 46. 936g，树脂合成收率105. 1%。实施例8、线性卡培立肽-Wang Resin的合成将 5mmol Fmoc-Tyr (tBu) -Wang Resin (取代度=0. 4mmol/g)用 DMF 溶胀 30 分钟，抽干溶剂，加入20%六氢吡啶/DMF反应30min，抽干反应液，并用DMF洗涤树脂6次。称取Fmoc-Arg(pbf)-OH(9. 732g, 15mmol)、TBTU (4. 817g, 15mmol)、HOBT (2. 027g, 15mmol)，全部混合后加入DMF (30ml)、DCM (30ml)搅拌溶解完全。然后加入DIPEA(4. 965ml，30mmol)，室温下搅拌20min。将反应液转移至反应柱中，鼓氮气反应池。抽干反应液，重复去保护、偶联操作，依次逐步偶联合成线性卡培立肽-Wang Resin 46. 835g，树脂合成收率104. 8%。实施例9、卡培立肽-Wang Resin的固相氧化
称取碘(12. 69g，50mmol),加入DMF(IOOml)，搅拌溶解完全。将溶解好的碘/DMF溶液加入实施例4-8任意一个实施例制备的线性卡培立肽-Wang Resin，鼓氮气搅拌反应6h。抽干反应液，DMF洗涤树脂6次，甲醇洗涤树脂3次，真空干燥，得卡培立肽-Wang Resin。实施例10、卡培立肽-Wang Resin的固相氧化
称取碘(101. 52g,400mmol),加入DMF (800ml)，搅拌溶解完全。将溶解好的碘/DMF溶液加入实施例4-8任意一个实施例制备的线性卡培立肽-Wang Resin，鼓氮气搅拌反应1.证。抽干反应液，DMF洗涤树脂6次，甲醇洗涤树脂3次，真空干燥，得卡培立肽-WangResin。
实施例11、卡培立肽-Wang Resin的TFA裂解
称取实施例10所得卡培立肽-Wang Resin至IL圆底烧瓶中，加入500ml裂解液(TFA 苯甲醚水=90:5:5)，室温反应证。减压过滤，滤液加入5L的冰冻乙醚沉淀离心。所得粗肽真空干燥后称重17. 203g，粗肽收率111. 7%。实施例12 卡培立肽反相高效色谱纯化
1.样品处理按照每克粗肽100毫升纯水比例溶解，溶解后的溶液用无机滤膜过滤，收集滤液备用。2.纯化
条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm X 300mm。流动相A相0.觊磷酸溶液用三乙胺调pH至2. 5 3. 5 ;B相乙腈。流速70-80 ml/min。检测波长230 nm。梯度B% 17% 32% (45 min)。进样量为 1. 3-1. 5 g ο操作将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为1. 3-1. 5g。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于观°C减压旋蒸浓缩至约10 12mg/ml后备用。3、转盐
条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为50mm X 300mm。流动相A相质量浓度0. 1%的醋酸水溶液；B相色谱纯乙腈。流速70-80 ml/min。检测波长230 nm。梯度B% :6% 36% (30 min)。进样量为 1. 6-2. Og。操作将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为160_200ml样品溶液。线性梯度洗脱30min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约50-80mg/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥，得纯度大于98. 5%的符合内控标准的卡培立肽，总收率32. 1%。
实施例13 卡培立肽反相高效色谱纯化
1.样品处理按照每克粗肽100毫升纯水比例溶解，溶解后的溶液用无机滤膜过滤，收集滤液备用。2.纯化
条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为150mm X 300 mm。流动相A相0. 2%醋酸溶液用氨水调pH至2. 5 3. 5 ;B相乙腈。流
速450-550 ml/min。检测波长230 nm。梯度B% 17% 32%(60 min)。进样量为 13-15
g °操作将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为13_15g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液于观°C减压旋蒸浓缩至约10-12 mg/ml后备用。3、转盐
条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为150mm X 300 mm。流动相A相质量溶度0. 1%的醋酸水溶液；B相色谱纯乙腈。流速450-550 ml/min。检测波长280 nm。梯度B% :6% 36% (60 min)。进样量为 15_20g。操作将色谱柱用50%以上的甲醇冲洗干净后上样，上样量为1500_2000ml样品溶液。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约50-80mg/ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥，得纯度大于98. 5%的符合内控标准的卡培立肽，总收率30. 1%。实施例14 卡培立肽反相高效色谱纯化
1.样品处理按照每克粗肽100毫升纯水比例溶解，溶解后的溶液用无机滤膜过滤，收集滤液备用。2.纯化
条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为300mm X 300mm 。流动相A相0. 2%醋酸溶液用氨水调pH至2. 5 3. 5 ;B相乙腈。流速1900-2200 ml/min。检测波长230 nm。梯度B% 17% 32% (120 min)。进样量为55-75 g ο操作将色谱柱用50%以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为55_75g。线性梯度洗脱120min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液观°C减压旋蒸浓缩至约10-12 mg/ml后备用。3、转盐
条件色谱柱以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为300mm X 300mm 。流动相A相0. 1%醋酸水溶液；B相色谱纯乙腈。流速1900-2200ml/min。检测波长230 nm。梯度B% :6% 36% (90 min)。进样量为 55_75g。操作将色谱柱用50%以上的甲醇冲洗干净后上样，上样量为5500_7500ml样品溶液。线性梯度洗脱90min，收集目的峰，将收集的目的肽溶液合并旋蒸浓缩至约50-80mg /ml后转至合适大小西林瓶。冷冻干燥，得纯度大于98. 5%的符合内控标准的卡培立肽，总收率30. 3%ο综上所述，本发明采用未经报道的Fmoc固相合成策略合成卡培立肽、反相高效色谱纯化，具有反应操作简单、后处理容易、原料投入少、成本低、收率高等特点，全部反应的总收率可达30%。本发明具有可观的经济实用价值，同时在多肽药物设计合成领域具有广泛的应用前景。
权利要求
1.一种醋酸卡培立肽的制备方法，包括以下步骤由 Fmoc-Tyr (tBu)-OH 禾口替代度为 0. 5mmol/g -1. Ommol/g 的 Wang Resin 反应，得至IjFmoc-Tyr(tBu)-Wang Resin ；将Fmoc-Tyr (tBu)-Wang Resin树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性卡培立肽-Wang Resin ；3)采用固相氧化法氧化卡培立肽-WangResin ；4)采用TFA裂解，得到粗肽；5)高效液相纯化卡培立肽，包括以下步骤第一步纯化将合成所得粗肽溶解后用十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以磷酸盐缓冲溶液为A相、色谱纯乙腈为B相，进行梯度洗脱纯化；第二步转盐采用RP-HPLC法将其转成醋酸盐。
2.根据权利要求1所述的醋酸卡培立肽的制备方法，其特征在于所述步骤2)逐一偶联采用偶联剂，偶联剂包括TEA、NMM或DIPEA。
3.根据权利要求1所述的醋酸卡培立肽的制备方法，其特征在于所述采用碘固相氧化合成卡培立肽-Wang Resin时，碘的用量以物质量计，是卡培立肽-Wang Resin物质量的10-80倍，氧化时间是4-16小时。
4.根据权利要求2所述的醋酸卡培立肽的制备方法，其特征在于所述采用碘固相氧化合成卡培立肽-Wang Resin时，碘的用量以物质量计，是卡培立肽-Wang Resin物质量的10-80倍，氧化时间是4-16小时。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的醋酸卡培立肽的制备方法，其特征在于步骤5)第一步纯化以磷酸盐缓冲溶液为A相，缓冲溶液pH范围为2. 5-3. 5 ；以色谱纯乙腈为B相，B相的梯度为17% 32%，进行梯度洗脱纯化45-120min。
6.根据权利要求1-4任意一项所述的醋酸卡培立肽的制备方法，其特征在于步骤5)第二步RP-HPLC法为以浓度为0. 05-0. 1%醋酸盐缓冲溶液作为A相；缓冲溶液pH为·3.5 4. 4 ；以色谱纯乙腈作为B相，梯度为6% 36%，梯度洗脱时间为30-90 min，转成醋酸盐。
7.根据权利要求5任意一项所述的醋酸卡培立肽的制备方法，其特征在于步骤5)第二步RP-HPLC法为以浓度为0.05-0. 1%醋酸盐缓冲溶液作为A相；缓冲溶液pH为3.5 ·4.4;以色谱纯乙腈作为B相，梯度为6% 36%，梯度洗脱时间为30-90 min，转成醋酸盐。
全文摘要
本发明公开了一种醋酸卡培立肽的制备方法，包括以下步骤1)由Fmoc-Tyr(tBu)-OH和替代度为0.5mmol/g-1.0mmol/g的WangResin反应，得到Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin；2)将Fmoc-Tyr(tBu)-WangResin树脂采用逐一偶联的方式合成得到线性卡培立肽-WangResin；3)采用固相氧化法氧化卡培立肽-WangResin；4)采用TFA裂解，得到粗肽；5)对卡培立肽粗肽进行反相高效液相色谱法纯化，得到高纯度精肽。该工艺具有反应操作简单、后处理容易、收率高、成本低等有益的技术效果。
文档编号C07K14/58GK102382188SQ20111034796
公开日2012年3月21日 申请日期2011年11月7日 优先权日2011年11月7日
发明者付信, 刘建, 张文治, 袁建成, 马亚平 申请人:深圳翰宇药业股份有限公司