人类细胞因子ccdc134在自身免疫性疾病中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及分子生物学及免疫学技术领域，细胞因子的新用途，具体涉及人类细 胞因子CCDC134在制备CD4+T细胞功能异常介导的相关疾病中作为标志物和/或治疗药物 方面的应用。
【背景技术】
[0002] 人类细胞因子CCDC134 (Coiled-CoilDomainContaining134)是本专利的发明 人2008年在国际上首先报道的具有功能活性的新分子。在前期工作中，已证实(XDC134是 一个经典分泌蛋白，在MAPK(Mitogen-ActivatedProteinKinase)信号通路的转录调节 中发挥重要负向调控作用（HuangJ，etal.CellMolLifeSci. 2008. 65 (2): 338-349); CCDC134又可作为一个核蛋白，与其相互作用蛋白hADA2a(humanTranscriptional Adaptor2a)共同组成核蛋白复合物，发挥对p53基因转录活性的调节作用（HuangJ，et al.ChineseSciΒμLI.February, 201LVol. 56.No. 4-5: 397 - 405)。该基因在哺乳 动物中进化保守，与已知的人类基因或蛋白没有同源性，编码229个氨基酸，蛋白分子量为 26kDa，具有糖基化修饰位点，人与小鼠氨基酸序列同源性为89%，而去掉信号肽的分泌形 式，二者的氨基酸序列同源性更高达95%。
[0003] 人类细胞因子(XDC134的基因在多种正常组织、胎儿组织、肿瘤组织都有 表达，说明其为人体自身重要的一个分泌蛋白（HuangJ,etal.CellMolLife Sci. 2008. 65(2) : 338-349)。前期研究表明人类细胞因子CCDC134的或小干扰RNA可用于 制备预防和/或治疗肿瘤、感染、造血功能障碍、自身免疫病等的药物，尤其是MAPK信号途 径相关的肿瘤、炎症及神经系统疾病等。然而相关实验结果仅表明该细胞因子对淋巴细胞 增殖有一定影响作用，并可能在T淋巴细胞发育和B淋巴细胞成熟过程中发挥一定的作用， 促进T淋巴细胞活化，同时可能影响巨噬细胞抗细菌免疫的功能。
[0004] 对于人类细胞因子(XDC134的研究虽然取得了一定进展，但其功能仍然未全面开 发，例如在免疫学方面，目前的研究仅表明其对CD8+T细胞具有一定的促进活化、增殖和特 异性杀伤作用，发挥抗肿瘤效应。
【发明内容】
[0005] 为了进一步研究人类细胞因子(XDC134的生物学活性及作用机理，开发其临床应 用价值，本发明通过更加深入的研究发现，其可以在某些CD4+T细胞亚群功能异常介导的 自身免疫性疾病方面发挥特殊的作用。
[0006] 以往的研究表明人类细胞因子(XDC134的重组蛋白作用于人外周血淋巴细胞或 小鼠脾脏单细胞悬液，可以明显促进⑶8+T细胞的活化和增殖；之后将小鼠⑶4+T和⑶8+ T细胞分离纯化后直接用(XDC134重组蛋白作用，发现(XDC134蛋白可以直接作用于⑶8+T 细胞的活化，促进其增殖和增强抗原特异性杀伤活性；但对混合CD4+T细胞的活化和增殖 没有明显效应。由于研究结果显示重组(XDC134蛋白直接作用于⑶8+T细胞，发挥较强的 免疫调节作用，以致认为其对于机体的免疫系统影响仅作用于CD8+T细胞。
[0007] 而本研究发现，人类细胞因子(XDC134能够抑制naive⑶4+Τ细胞的增殖，也能 促进naive⑶4+T细胞向Thl和/或Treg细胞分化，因此其可以应用于⑶4+T细胞相关 的自身免疫性疾病。
[0008] 基于此研究成果，本发明提供以下技术方案： 本发明提供了人类细胞因子CCDC134在自身免疫性疾病中的应用，是以该细胞因子的 基因或蛋白质作为检测标志物，制备CD4+T细胞亚群功能异常介导的自身免疫性疾病的检 测试剂。
[0009] 人类细胞因子(XDC134的基因和蛋白质序列均为已知，其在NCBI中对应的mRNA 和蛋白质的记录号分别为NM_〇24821和NP_079097,其基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所 示，蛋白质的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。
[0010] 作为优选方案，以上所述的应用中，所述⑶4+T细胞亚群为Thl和/或Treg。
[0011] 作为优选方案，以上所述的应用中，所述自身免疫性疾病为CD4+T细胞亚群Thl和 Treg功能异常介导的多发性硬化症。
[0012] 本发明还提供一种体外检测人类细胞因子(XDC134蛋白的试剂盒，包括以下试 剂： 包被缓冲液：〇. 05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9. 6 ; 样品分析缓冲液：含有〇. 05%(v/v)吐温20的PBS; 标准品：纯化的重组(XDC134蛋白； R1包被抗体：兔抗(XDC134多克隆抗体； Ml检测抗体：鼠抗(XDC134单克隆抗体； HRP标记羊抗鼠二抗； 封闭液：含 2%BSA(w/v)和 0. 05%(v/v)吐温 20 的PBS; 浓缩洗涤液：含1%(ν/ν)吐温-20的20XPBS; TMB底物（TMB即3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺）； 终止液：2N硫酸。
[0013]其中，TMB为3, 3'，5, 5' -四甲基联苯胺；BSA为牛血清白蛋白；PBS为磷酸盐缓冲 液。w/v表示质量体积比，v/v表示体积比。
[0014]0. 05M碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液配方：碳酸钠（Na2C03)，1. 59g;碳酸氢钠 (NaHC03)，2. 93g;调pH9. 6，定容 1L。
[0015]PBS配方：氯化钠（NaCl)，8g;氯化钾（KC1)，0· 2g;磷酸氢二钠（Na2HP04)，1. 44g; 磷酸二氢钾（ΚΗ2Ρ04)，0. 24g;调pH7. 2，定容1L。本发明还提供了人类细胞因子(XDC134 的另外一种应用，是以该细胞因子的基因或蛋白质作为药物有效成分，制备CD4+T细胞亚群 功能异常介导的自身免疫性疾病的治疗药物；所述基因的核苷酸序列如SEQIDNO: 1所示， 所述蛋白质的氨基酸序列如SEQIDN0:2所示。
[0016] 作为优选方案，以上所述的应用中，所述药物用于促进naiveCD4+T细胞向Thl和 /或Treg细胞分化。
[0017] 作为优选方案，以上所述的应用中，所述药物用于抑制CD4+T细胞增殖。
[0018] 作为优选方案，以上所述的作为药物有效成分应用时，所述自身免疫性疾病为多 发性硬化症。
[0019] 另外，本发明还提供了一种人类细胞因子(XDC134蛋白的真核表达载体，是将SEQ IDNO: 1所示的核苷酸序列5'端连接Igk信号肽的编码基因后插入表达载体pMH的多克隆 位点形成的重组质粒；所述Igk信号肽的编码基因核苷酸序列如SEQIDN0:3所示。
[0020] 所述的表达载体pMH为市售商品，可以直接向商家例如Biovector公司购买。
[0021] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： 我们通过实验研究发现：在体外实验条件下，重组CCDC134蛋白在单独CD4+T细胞培 养体系中，当抗⑶3&CD28抗体联合刺激时，(XDC134显示出抑制⑶4+ T细胞增殖的作用；并 能调节naive⑶4+T细胞的分化，促进Thl和Treg细胞的生成；动物体内实验提示：实验 性自身免疫性脑脊髓炎（experimentalautoimmuneencephalomyelitis,EAE)小鼠模型 中，(XDC134血清含量增高，同时重组(XDC134蛋白处理或(XDC134转基因小鼠均能显著减 轻小鼠EAE的发病，相比较同窝阴性对照小鼠，转基因小鼠中中枢神经系统CD4+T细胞和单 核巨噬细胞的浸润明显减少。上述结果均表明(XDC134可以作为治疗⑶4+T细胞亚群功能 异常介导的自身免疫性疾病特别是临床多发性硬化症的药物，用于制备相关诊断试剂盒治 疗药物，为该种疾病的诊断和治疗提供了新的途径。
【附图说明】
[0022] 图1 :pMH-(XDC134-hiS6表达质粒核苷酸测序结果。序列为起始密码子-IgK(人 免疫球蛋白Kappa轻链信号肽）-去除自身信号肽的(XDC134编码基因-6个histag-终 止密码子，左侧灰色区域为起始密码子后的信号肽，右侧灰色区域为组氨酸标签，下划线为 CCDC134去除自身信号肽的编码序列。
[0023] 图2:重组人(XDC134-his6真核蛋白质量控制指标检测结果。
[0024] 图3:利用CFSE检测重组(XDC134蛋白对⑶4+T细胞增殖的抑制效应。实验中抗 CD