试剂盒及联合检测pct、crp及il-6的方法
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及生物检测领域，具体地，本发明涉及能够同时检测多种生物物质的试 剂盒及其应用，更具体的，本发明涉及一种试剂盒以及一种联合检测降钙素原、C反应蛋白 及白细胞介素6的方法。
【背景技术】
[0002] 急性时相蛋白（acute phase protein，APP)是与感染性炎症紧密相关的一类特 异性蛋白。近年来，大量研究表明，多种正负性急性期蛋白与感染性炎症均具有显著的相关 性，且比检测白细胞、血沉、酶活性与含量变化等方法更加准确和可靠，可作为感染性炎症 的炎症标志物。
[0003] C反应蛋白（C reactive protein，CRP)由肝脏合成，是一种典型的急性时相蛋白， 正常血清中其含量极微，在炎症急性期、恶性肿瘤、局部缺血、组织损伤等患者的血浆中， CRP含量可以千倍增加。在炎症初期4h~6h内升高，36h~50h达到高峰。感染一旦得到 控制，其含量即会迅速恢复至正常水平。研究发现，细菌性感染才会致使CRP水平升高，当 超过140mg/L时可基本确定细菌性感染的存在。且其水平与感染程度呈正相关；而当病毒 感染时，CRP水平一般不升高。对于急性感染性疾病的诊断，检测血清CRP较白细胞总数更 敏感、更准确，更可靠。
[0004] 降f丐素原（procalcitonin，PCT)是降f丐素的前体，属糖蛋白，半衰期25h~30h， 在体内外稳定性好。生理情况下由甲状腺的C细胞产生，但其含量极低（小于O.lyg/L)。 当其含量大于〇. 5 μ g/L时视为异常。研究发现PCT是细菌或真菌感染早期的一个诊断指 标，感染时才升高，在非感染时其水平一般并不升高，且升高值的大小与感染的严重程度密 切相关。通过对细菌性感染和病毒性感染的比较分析发现，细菌感染时，血清PCT水平明显 升高，而在病毒感染时，血清PCT水平却无明显升高。对CRP和PCT的比较分析发现，PCT的 升高早于CRP的上升。在局部感染时，PCT -般并不升高，CRP却升高。这些研究表明在非 全身感染时，CRP是一个重要的观察指标；在全身感染时，PCT是一个较好的指标。
[0005] 白细胞介素6(interleukin-6, IL-6)是由212个氨基酸组成的糖蛋白，机体受炎 症刺激后由T细胞、B细胞、单核巨噬细胞及内皮细胞等分泌。IL-6是一种多效性细胞因子， 它有多种生物学活性，包括介导前感染反应和细胞保护功能。IL-6参与许多疾病的发生和 发展，其血浆水平与炎症、病毒感染、自身免疫疾病密切相关，它的变化比CRP更早。目前认 为是炎症、脓毒症的早期敏感性"警示"标志物。
[0006] 由上可知，联合检测PCT、IL-6及CRP等炎症标志物，对于感染/脓毒症等的早期 快速精确诊断、病程监测、疗效跟踪等均具有重要支撑作用。然而，目前尚缺少可以同时快 速、定量准确检测上述三种指标的联检试剂。
【发明内容】
[0007] 本发明旨在至少在一定程度上解决上述技术问题之一或至少提供一种商业选择。
[0008] 依据本发明的一方面，本发明提供一种试剂盒，该试剂盒包括：第一包被膜和第二 包被膜，所述第一包被膜的一端与所述第二包被膜的一端相连，所述第一包被膜中的至少 一块区域包被有标记抗体混合物，所述标记抗体混合物包含第一标记抗体、第二标记抗体 和第三标记抗体，所述第二包被膜包含分离的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域， 所述第一区域比所述第二区域靠近所述第一包被膜，所述第二区域比所述第三区域靠近所 述第一包被膜，所述第三区域比所述第四区域靠近所述第一包被膜，所述第一区域包被有 第一包被抗体，所述第一包被抗体和所述第一标记抗体能够特异性结合第一抗原，所述第 二区域包被有第二包被抗体，所述第二包被抗体和所述第二标记抗体能够特异性结合第二 抗原，所述第二区域包被有第三包被抗体，所述第三包被抗体和所述第三标记抗体能够特 异性结合第三抗原，所述第四区域包被有抗抗体，所述抗抗体能够特异性结合所述第一标 记抗体、所述第二标记抗体和所述第三标记抗体。所称的"包被"为免疫学术语，包含固定 和/或吸附之意。
[0009] 利用该试剂盒，基于针对多种抗原，对标记、抗各种抗原的标记抗体和包被抗体的 分子特性的研究，通过优化双抗体夹心免疫反应的条件，能够同时检测多种抗原物质。根据 本发明的实施例，所称第一抗原、第二抗原和第三抗原分别为PCT、CRP和IL-6,利用本发明 的这一试剂盒，能够同时快速且准确地定量检测这三种物质。
[0010] 根据本发明的实施例，本发明的这一方面的试剂盒还能够具有以下附加技术特征 至少之一：
[0011] 本发明的试剂盒对第一包被膜中的包被有标记抗体混合物的区域的大小不作限 制，可以是整个第一包被膜，也可以是第一包被膜的一部分。根据本发明的一个实施例，由 于利用该试剂盒检测时，待测样本的加入位置为第一包被膜中的包被有标记抗体混合物的 区域，所以也将第一包被膜称为样品垫。
[0012] 同样的，对第二包被膜中的分离的第一区域、第二区域、第三区域和第四区域各自 的大小也不作特别限制。根据本发明的一个实施例，如图1所示，试剂盒的第一包被膜和 第二包被膜都是长方形的，第一包被膜的一条宽边和第二包被膜的一条宽边相粘，第一包 被膜中的包被有标记抗体混合物的区域为长约2cm、宽约3mm的长方形，第二包被膜中的第 一区域、第二区域、第三区域和第四区域都为线状，第一区域被称为检测线1(T1线），第二 区域被称为检测线2 (Τ2线），第三区域被称为检测线3 (Τ3线），第四区域被称为质控线（C 线），两个区域所在的线状平面都平行于两包被膜的粘结边，所说的线状第一、第二、第三或 者第四区域的宽度大约为〇. 5-lmm、长度为膜的宽。
[0013] 该试剂盒利用第一膜和第二膜分别包被有能特异性结合同一种抗原的标记抗体 和包被抗体，加入待测样品后利用膜层析，在第二膜上形成双抗体夹心复合物，基于检测复 合物中的标记抗体上带的标记，例如荧光标记的荧光强度来对样品中的所说的抗原进行定 量。这一试剂盒能够明显的提高检测的特异性，缩短检测所需时间。通过标记抗体，能够明 显的提高检测灵敏度。根据本发明的实施例，当所称第一抗原、第二抗原和第三抗原分别为 PCT、CRP和IL-6,该试剂盒为能够联合检测PCT、CRP和IL-6的试剂盒，利用该试剂盒能够 实现对PCT、CRP和IL-6的快速和高灵敏测定，具有如下优点：灵敏度高、特异性强、快速、简 便，可实现客观化测定。根据本发明的实施例，利用该试剂盒的联合检测PCT、CRP和IL-6， 检测PCT的灵敏度达0. 05ng/mL，检测CRP的灵敏度达0. 01ug/mL，检测IL-6的灵敏度达 lOpg/mLo
[0014] 根据本发明的一个实施例，试剂盒中的第二包被膜的另一端连接有吸水垫。吸水 垫可为强吸水物质，这样在检测液态样品时能够给予定向动力使液态样品从第一包被膜定 向层析至第二包被膜。
[0015] 根据本发明的一个实施例，所述第一包被膜、所述第二包被膜和所述吸水垫均固 定在同一固相基质上。固相基质主要为提供承载，方便操作，固相基质的类型不作特别限 定，可以为不会与待测样品发生反应或者不影响抗原抗体结合的惰性材料，比如纸板、塑料 板等。
[0016] 根据本发明的一个实施例，所述第一包被膜为玻璃纤维素膜，所述第二包被膜为 硝酸纤维素膜（NC膜）。玻璃纤维膜呈化学惰性，不含粘合剂，采用100 %硼硅酸玻璃纤维制 造而成，其上包被有荧光标记的第一抗体，利于第一抗体与待测样品中的目标抗原发生特 异性结合。而NC膜本身是已经添加了表面活性剂来改善亲水能力，而且已经存在有一定的 缓冲系统，具有毛细纤维结构，能吸附比同等纤维素滤纸更多的水分，流速快，耐高温，利于 其上包被的第二抗体与前述的荧光标记第一抗体-抗原发生特异性结合反应，激发荧光。
[0017] 根据本发明的实施例，所述标记抗体混合物中的第一、第二和第三标记抗体中带 有的标记均为荧光标记，例如为荧光微球标记。第一标记抗