人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒、方法和细胞固定液的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于病原体诊断技术领域，具体涉及一种人呼吸道病原体的流式细胞检测方法和试剂盒以及细胞固定液。
【背景技术】
[0002]流感病毒A (ΙΑ)，流感病毒Β (IB)，呼吸道合胞病毒(RSV)和呼吸道腺病毒(ADV)、副流感1、2、3、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体、衣原体是引起呼吸道疾病的主要病原体。其中流感病毒A，流感病毒B，呼吸道合胞病毒和呼吸道腺病毒最为常见，约占呼吸道疾病的病毒性病原体的50%。为了更加快速和灵敏检测呼吸道病毒，合理使用各种抗生素，和治疗流感的新抗病毒药物的使用，早期检测和辨别感染病毒变得非常重要。
[0003]目前标准的鉴定病毒的方法仍然是通过细胞培养和使用荧光单克隆抗体。然而，细胞培养法分离率低、耗时长，因此限制了它的使用。目前临床上使用荧光单克隆抗体检测呼吸道病毒感染的方法，具体是指玻片直接免疫荧光法，该方法通过肉眼观察，并且根据在玻片上点样的标本中有绿色荧光细胞的数量来判定结果。因此玻片直接免疫荧光法结果的判定具有主观性。而且由于该检测方法需要人肉眼观察结果，因此只能使用单一荧光素标记抗体，导致该方法一般一次只能鉴定一种病原体。
[0004]流式细胞术是利用流式细胞仪快速定量分析细胞群的物理化学特征的技术，主要应用于生命科学的基础研究:免疫学、细胞生物学和分子生物学。80年代后期开始应用于临床，用于测定外周血CD4T细胞的数量，监测HIV感染者疾病的进展；利用流式分选干细胞过继回输用于疾病的治疗。现在，流式细胞术还能辅助多种疾病的诊断，尤其是白血病的诊断和分型。由于流式细胞是以细胞表面因子为检测对象，而人呼吸道病原体一般都位于细胞内部，因此目前尚未见能很好地利用流式细胞术来检测呼吸道病原体的技术和产品。
【发明内容】
[0005]为了克服上述技术缺陷，本发明提供了一种人呼吸道病原体的流式细胞检测的细胞固定液，检测试剂盒和检测方法。通过本发明所提供的检测方法和试剂盒，实现了人呼吸道病原体感染检测的自动化、且结果客观准确；可实现单样本多重检测，可反映病原体感染情况等技术效果。
[0006]本发明的目的之一在于提供一种细胞固定液。
[0007]实现上述目的的技术方案如下。
[0008]—种细胞固定液，含有体积分数为0.1 % — 1 %甲醛和体积分数为60% — 80 %甲醇的PBS溶液，pH为7.2-7.4。
[0009]在其中一个实施例中，所述甲醛的体积分数为0.3% -0.8%，所述甲醇的体积分数为 60% — 65%。
[0010]本发明的另一目的在于提供一种人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒。
[0011 ] 实现上述目的的技术方案如下。
[0012]—种人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒，包括有:上述细胞固定液、细胞通透剂和至少一种待检测人呼吸道病原体的单克隆抗体，每种人呼吸道待检测病原体的抗体标记有荧光素，且针对不同待检测人呼吸道病原体的荧光素各不相同。
[0013]在其中一个实施例中，还包括有细胞洗涤液。
[0014]在其中一个实施例中，所述人呼吸道病原体为呼吸道合胞病毒(RSV)、甲型流感病毒(IA)、乙型流感病毒(IB)、腺病毒(Adv)、副流感病毒1型、副流感病毒2型和副流感病毒3型、偏肺病毒、博卡病毒、冠状病毒、鼻病毒、肠道病毒、支原体或衣原体中的至少一种。
[0015]在其中一个实施例中，所述细胞通透剂为Triton-XlOO溶液。
[0016]本发明的另一目的是提供一种人呼吸道病原体的流式细胞检测方法。
[0017]实现上述目的的技术方案如下。
[0018]—种人呼吸道病原体的流式细胞检测方法，包括如下步骤:
[0019](1)标本采集和细胞固定:收集呼吸道的标本中的上皮细胞到上述细胞固定液内；
[0020](2)单细胞悬液的制备:洗去所述细胞固定液；
[0021](3)加入细胞通透剂和荧光素标记的待检测的人呼吸道病原体的单克隆抗体进行染色，不同呼吸道病原体的单克隆抗体所标记的荧光素不同；
[0022](4)洗去多余的抗体；
[0023](5)上流式细胞仪进行分析。
[0024]所述标本为咽拭子或肺泡支气管灌洗液。
[0025]本发明所述细胞固定液，能够很好地使组织和细胞内的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态。对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。
[0026]本发明通过将细胞固定液固定，以Triton-XlOO溶液作为细胞通透剂，荧光染色等步骤实现流式细胞仪方法检测呼吸道上皮细胞病原体，计算病原体感染阳性的上皮细胞占总上皮细胞的百分比，以此作为诊断呼吸道病原体感染的依据。与玻片免疫荧光法相比具有如下优势:a、检测过程自动化，节省人力成本山、仪器自动计算阳性百分比，结果更加客观准确；c、通过针对不同病原体单抗标记不同荧光染料，可实现单样本多重检测，节省资源和时间；d、更为重要的，要反映病原体感染情况，相比于玻片直接免疫荧光法以镜下观察到绝对量的荧光染色的细胞来反映，本发明所述检测方法以相对的阳性百分比来反映更为准确。
【附图说明】
[0027]图1是本发明方法进行Adv检测的结果图，标本为分别采自8位临床疑似呼吸道病原体感染患者的支气管肺泡灌洗液标本；其中A:根据前向散射光信号(FSC-Η)和侧向散射光信号(SSC-H)，划出细胞门(P2) ;B:根据所述细胞门(P2)，作出细胞荧光信号(FITC-H)的柱形图，在所述柱形图上设定阳性门(M3)，其百分比(M3% )为阳性百分比；
[0028]图2是利用玻片直接免疫荧光法进行四项呼吸道病原体(RSV、IA、IB和Adv)感染检测的阳性结果图，标本为分别标本为分别采自3位临床疑似呼吸道病原体感染患者的口咽拭子标本。图2-1、图2-2、图2-3分别为所述3份标本的阳性结果图，图中白色发亮的细胞为阳性细胞。
[0029]图3是利用本发明方法检测四项呼吸道病原体(RSV、IA、IB和Adv)感染情况的结果图，标本为分别标本为分别采自3位临床疑似呼吸道病原体感染患者的口咽拭子标本。3份标本的检测结果分别如图3-1、图3-2、图3-3所示，根据前向散射光信号(FSC-Η)和侧向散射光信号(SSC-H)，划出细胞门(P2)。根据所述细胞门，作出细胞荧光信号(RSV-H、IA-H、Adv-H、IB-Η)的柱形图。在所述柱形图上设定阳性门(M3、M4、M5、M6)，其百分比(M3%,M4%,M5%,M6%)为阳性百分比。所述阳性百分比作为诊断依据，本例各临界值均设为
0.20%，大于0.20%的标本判为相应病毒感染阳性，小于或等于0.20%的标本判为相应病毒感染阴性。
【具体实施方式】
[0030]为使本发明更加容易理解，下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围，下列实施例中未提及的具体实验方法，通常按照常规实验方法进行。
[0031]实施例1细胞固定液
[0032]本实施例所述的细胞固定液，含有体积分数为0.5%甲醛和体积分数为60%甲醇的PBS溶液。其配制方法为，在PBS溶液中加入甲醛和甲醇，使甲醛的体积分数为0.5%，甲醇的体积分数为60%，调节pH值至7.3，即得。
[0033]实施例2:人呼吸道病原体的流式细胞检测试剂盒
[0034]本实施例提供一种人呼吸道病原体感染的流式细胞检测试剂盒。该试剂盒包含实施例1所述的细胞固定液、细胞通透剂和荧光素(FITC-异硫氰酸荧光素)标记的针对Adv抗原的单克隆抗体(购自广州