专利名称：去甲异波尔定在制备治疗自身免疫性疾病药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体涉及去甲异波尔定的医药用途。
背景技术：
自身免疫性疾病是一类临床常见的由免疫应答异常所致的疾病，包括类风湿性关节炎、 系统红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎等多种疾病。其中，类风 湿关节炎是以周围对称性的多关节非化脓性炎症为主的疾病，常常伴有关节腔滑膜炎症，滑 膜组织增生，肉芽肿形成，软骨及骨组织破坏，最后关节形变，功能缺失。而多发性硬化是 一种以中枢神经系统炎性脱髓鞘病变为特征的自身免疫疾病。治疗类风湿关节炎的药物主要 有非甾体抗炎药(双氯灭痛，阿司匹林等)，皮质激素和免疫抑制剂(6-巯基嘌呤等)，治疗 多发性硬化的药物主要有皮质激素和免疫抑制剂。但这些药物均存在明显的不良反应。非甾 体抗炎药易造成胃肠道粘膜损伤而导致消化性溃疡；皮质激素类药物虽可有效地改善症状， 但长期应用易引起许多副作用如液体及电解质不平衡、肠胃、内分泌、骨质及代谢的损害， 且停药后易出现"反跳"现象；免疫抑制剂选择性差，易于诱发感染。因此，有必要研制新 型的高效、安全的治疗类风湿关节炎和多发性硬化的药物。
中药乌药为樟科山胡椒属植物乌药UwAra aggregato (Sims) Kosterm.(丄.W/jc/iw/o/ia Vill) 千燥块根。去甲异波尔定(norisoboldine)是乌药所含的一种异喹啉类生物碱，分子式为 CuH1904N，该化合物在原药材中含量较高。迄今为止，除体外抗氧化作用(药学学报2006 41(10):956-962〕夕卜，未见有关去甲异波尔定生物活性或临床应用方面的报道。
发明内容
本发明公开了去甲异波尔定的医药新用途，即其可用于制备治疗自身免疫性疾病药物的 应用。所述自身免疫性疾病如类风湿关节炎、多发性硬化症、系统红斑狼疮、多发性硬化 症、I型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎、Sjogren综合征、硬皮病、多肌炎、慢性活动性肝 炎、混合性结缔组织病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性溶血性贫血、桥本甲状腺炎、 Addisons病、白斑、Graves病、重症肌无力、强直性脊柱炎、变应性骨关节炎、变应性血管 炎、自身免疫性噬中性白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、狼疮性肾炎、慢性萎缩性 胃炎、自身免疫性不育、子宫内膜异位症、pasture病、天疱疮、盘状狼疮或致密沉积物等疾 病。
优选治疗类风湿关节炎，还优选治疗多发性硬化症。
去甲异波尔定可按照文献制得，可以从乌药中提取得到，也可以化学合成得到，还可在 市场购得，或用下列方法制备干燥的乌药块根粉末，用95%乙醇回流提取，减压浓縮得浸 膏，加入2%盐酸溶解，过滤。滤液经强酸性阳离子交换树脂柱层析，水洗柱，氨水调pH至
8.5后，将交换树脂转入索氏提取器中，乙醚回流提取。挥去乙醚，得黒棕色提取物。提取物
经反复硅胶柱色谱分离得到去甲异波尔定粗品，经过多次重结晶，得到去甲异波尔定纯品。
图l是对胶原关节炎小鼠体重增长的影响(与模型组比较，*/7<0.05,**;7<0.01) 图2是对小鼠胶原关节炎临床积分的影响(与模型组比较，*户<0.05,**; <0.01) 图3是对小鼠血清中抗-II型胶原抗体的影响(与模型组比较，*》<0.01) 图4是对II型胶原诱导的小鼠耳廓迟发型超敏反应的影响(与模型组比较，*p<0.05,**/K0.01) 图5是对II型胶原诱导的小鼠淋巴细胞增殖的影响(与模型组比较，*户<0.05，**/7<0.01)
图6是对II型胶原关节炎小鼠关节组织学变化的影响(A:正常组；B:模型组；C:去甲异
波尔定40mg/kg组；D:地塞米松lmg/kg组)
图7是对II型胶原关节炎小鼠关节组织学病变积分的影响(与模型组比较，*P<0.05，**p<0.01)
具体实施例方式
实施例1
去甲异波尔定的制备干燥的乌药块根粉末3 kg，用95%乙醇回流提取3次，每次2h， 减压浓縮得浸膏，加入2%盐酸溶解，过滤。滤液经强酸性阳离子交换树脂柱层析，水洗柱， 氨水调pH至8.5后，将交换树脂转入索氏提取器中，乙醚回流提取。挥去乙醚，得黒棕色提 取物4.8g。提取物经反复硅胶柱色谱分离，氯仿-甲醇(7: 3)反复洗脱得到化合物I粗品， 经过多次重结晶，得到棕色粉末化合物I 0.76 g。与对照品共硅胶薄层层析，Rf值一致，混和 熔点不下降，故鉴定化合物I为去甲异波尔定。经HPLC检测，化合物1的纯度为98%。
实施例2
去甲异波尔定对II型胶原致小鼠关节炎的影响 1去甲异波尔定对胶原关节炎小鼠体重的影响
将鸡II型胶原加入0.1 M的醋酸中，4 °C搅拌至充分溶解，使其浓度为2 mg/ml， 4 °C 过夜，在冰浴中与等体积完全弗氏佐剂(含2 mg/ml的热灭活结核分支杆菌)混合，充分乳 化，得II型胶原乳剂。雄性ICR小鼠尾根部皮内注射II型胶原乳剂100 pl致敏，注射当天记 为d 0。第21天再次在相同部位注射II型胶原乳剂100 pl攻击，将小鼠随机分为6组(n-7 —8) : 1)正常组；2)模型组；3)去甲异波尔定(10mg/kg); 4)去甲异波尔定(20mg/kg); 5)去甲异波尔定(40mg/kg): 6)地塞米松(DEX, 1 mg/kg)。每日灌胃给药，正常组和模型 组小鼠给予等量溶剂，连续20天。在此过程中，记录小鼠体重变化。
结果见图l,图l显示II型胶原攻击后模型组和地塞米松组小鼠的体重明显减轻，去甲 异波尔定(10, 20， 40 mg/kg)能够有效缓解胶原关节炎小鼠的体重减轻。 2胶原关节炎临床积分评价
第21天起，每隔4天观察一次小鼠关节及足红肿状况， 一直观察至第40天。小鼠足的 关节炎轻重程度采用双盲法并依据以下标准进行评价0分=无变化；1分=脚趾上出现肿胀
和红斑；2分=足部出现轻微的肿胀和红斑；3分=脚趾上出现明显的肿胀和红斑；4分=足部 出现严重的肿胀或强直变形。四足的临床积分之和作为每个小鼠关节炎评分，每只小鼠最高
积分为16分。
由图2可见，去甲异波尔定(20, 40 mg/kg)和地塞米松(1 mg/kg)明显减轻胶原关节炎小 鼠关节的肿胀和红斑，降低关节炎临床积分。
3血清中抗-II型胶原抗体的检测
致敏后第36天，小鼠眼眶采血，制备血清，采用酶联免疫吸附测定法检测小鼠血清中抗 -II型胶原抗体的滴度。
图3显示，胶原关节炎小鼠血清中IgG滴度明显高于正常小鼠。去甲异波尔定(20， 40mg/kg) 显著降低小鼠血清中抗II型胶原IgG抗体水平。
4去甲异波尔定对II型胶原诱导的迟发型超敏反应的影响
致敏后第40天，小鼠右耳皮内注射0.2%11型胶原溶液(溶于0.1 M冰乙酸)20 pl，左耳注 射等量溶媒。24小时后，用螺旋测微仪检测两耳廓厚度，用两耳廓厚度差作为表示迟发型超
敏反应强度。
由图4可见，去甲异波尔定(20,40mg/kg)明显抑制II型胶原诱发的小鼠耳迟发型超敏反应。
5去甲异波尔定对n型胶原诱导淋巴细胞增殖的影响
致敏后第41天，将模型组小鼠断头放血处死，在无菌条件下取出腹股沟处淋巴结，经碾 磨和过滤，分散成单个淋巴细胞悬液。将细胞悬浮于含10。/。NCSRPMI-1640培养基中，调整 细胞浓度为5x106个/ml。将细胞悬液加入96孔板中，100pl/ L，分别加入II型胶原(终浓 度50吗/ml)50pl，以及不同浓度的药物50pl，在37 。C， 5% (302条件下培养68小时。每孔 加入MTT (5 mg/ml) 20 pl，继续培养4小时。培养结束后，离心(2000 rpm, 20分钟)，吸弃 上清液，每孔加入DMSO200nl，振荡IO分钟。在波长540nm处测量吸光度。按下式计算 淋巴细胞增殖指数增殖指数=加II型胶原组OD值/空白组OD值。
由图5可见，去甲异波尔定(20, 40 mg/kg)和地塞米松(1 mg/kg)显著抑制II型胶原诱导的 淋巴细胞增殖。
6关节组织学检査
小鼠处死后，取后足固定于4.5%甲醛溶液。在4。C条件下，10%EDTA中钙化14天， 石蜡包埋、切片(5 pm)，苏木精和伊红(H&E)染色。跗关节组织病理学变化根据下列评分系统
进行评价0分=正常；1分二炎性细胞浸润；2分=滑膜增生；3分=血管翳形成；4分=
骨质侵蚀；5分=骨质破坏。每只小鼠关节病变的最高积分为15分。
图6中B显示，胶原关节炎模型组小鼠出现关节滑膜增生、血管翳形成、关节腔炎细胞 浸润、骨和软骨侵蚀等病变。去甲异波尔定(40 mg/kg)组小鼠没有发现骨质的侵蚀和降解， 炎细胞浸润和滑膜增生较模型组小鼠轻(图6 C)。地塞米松(lmg/kg)亦阻止关节的破坏(图 6 D)。各组小鼠关节病理学改变的积分见图7。
实施例3
去甲异波尔定对大鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的影响
无菌条件下取豚鼠脊髓，制成50%匀浆，与等量的完全福氏佐剂充分混合，制成免疫原。 大鼠两后足垫内各注射免疫原乳剂O.l mL，同时尾根皮下注射百日咳疫苗(5.5 xl(^mi;1 )0.2 mL 。对照组免疫原中的豚鼠脊髓匀浆以等量生理盐水替代，给药组自免疫当日开始给药， 连续18天。免疫接种后每日称大鼠体重，观察病情并进行神经功能障碍评分。神经功能障碍评分标 准采用5分评分法0分，无明显异常；1分，大鼠尾部无力麻痹；2分，尾部无力+后肢 无力；3分，后肢轻度麻痹；4分，后肢严重麻痹伴前肢无力，被动翻身不能复原；5分， 全身瘫痪或濒死。
EAE模型组大鼠在致敏后7 10天，陆续出现活动减少，体重减轻，尾部麻痹，双后肢 瘫痪，严重者四肢瘫痪，伴大小便失禁，甚至出现濒死状态。整个病程持续8 10天，发病率 100%。去甲异波尔定(10， 20 mg/kg)灌胃给药组的发病率分别为50 %和30 %，临床症状明 显减轻(表l )。
表l去甲异波尔定对EAE大鼠临床神经功能障碍的影响组别剂量初期缓解期高峰期(mg/kg)(第8天)(第12天)(第18天)模型组0.9土0.33.4±0.8
去甲异波尔定100.6±0.22.2±0.7"200.5±0.2*1.5土0.7"0.4±0.2* 与模型组比较，*/7<0.05,**p<0.01。 各组大鼠于免疫接种后第12天(相当于EAE发病高峰期)，取血制备血清，ELISA法检测 IL-2和IFN-y水平。与对照组比较，eae模型组大鼠血清IL-2和IFN-丫水平明显升高。去甲异 表2去甲异波尔定对EAE大鼠血清IL-2和IFN-Y水平的影响 组别 剂量 (mg/kg) IL-2 (pg/ml) IFN-y (pg/ml) 对照组 模型组 去甲异波尔定 10 20 67.5±12.2 188.6±25.3 58.4士12.1** 37.8±10.9** 11.1±2.9 73.5±14.6 44.5±16.4** 20.5±9.6** 与模型组比较，**p<0.01,
权利要求
1、去甲异波尔定在制备治疗自身免疫性疾病的药物中的应用。
2、 权利要求l的应用，其中自身免疫性疾病是类风湿关节炎。
3、 权利要求l的应用，其中自身免疫性疾病是多发性硬化症。
4、 权利要求l的应用，其中自身免疫性疾病是系统红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、 银屑病、溃疡性结肠炎、Sjogren综合征、硬皮病、多肌炎、慢性活动性肝炎、混合性结缔组 织病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性溶血性贫血、桥本甲状腺炎、Addisons病、白斑、 Graves病、重症肌无力、强直性脊柱炎、变应性骨关节炎、变应性血管炎、自身免疫性噬中 性白细胞减少症、特发性血小板减少性紫癜、狼疮性肾炎、慢性萎縮性胃炎、自身免疫性不 育、子宫内膜异位症、pasture病、天疱疮、盘状狼疮或致密沉积物疾病。
全文摘要
本发明涉及医药领域，具体涉及去甲异波尔定的医药用途。其特征是去甲异波尔定可用于制备治疗自身免疫性疾病药物的应用。所述自身免疫性疾病如类风湿关节炎、多发性硬化症、系统红斑狼疮、多发性硬化症、I型糖尿病、银屑病、溃疡性结肠炎、Sjogren综合征、硬皮病、多肌炎、慢性活动性肝炎、混合性结缔组织病、原发性胆汁性肝硬变、自身免疫性溶血性贫血等疾病。
文档编号A61K31/473GK101375850SQ20081015621
公开日2009年3月4日 申请日期2008年10月7日 优先权日2008年10月7日
发明者侴桂新, 美 刘, 夏玉凤, 岳 戴, 王峥涛 申请人:中国药科大学