一种炎性肠病状态下药物敏感性的新检测指标及其在药物治疗方案设计中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及药物代谢动力学、药理学、细胞生物学、分子生物学等多个领域，创新性地揭示了炎性肠病的天然耐药现象，发现了一种基于外周血单核细胞P-gp表达量的新检测指标用于炎性肠病状态下药物敏感性的检测，并阐明了相关机制，同时提出联用P-gp抑制剂的药物治疗方案可能用于逆转炎性肠病天然耐药。
【背景技术】
[0002]炎性肠病(IBD)是一种慢性肠道炎症性疾病，主要包括克罗恩病(⑶)和溃疡性结肠炎(UC)两种。其不仅在美国及欧洲国家盛行，在我国的发病率也逐年升高。IBD的病因和发病机制尚未明确，可能与饮食习惯、环境因素、遗传因素、微生物感染等多种因素相关。此外，由于IBD病人常伴有免疫紊乱的现象，其也被视为一种自身免疫性疾病。临床治疗时常使用免疫抑制剂或抗炎药以减轻肠道炎症反应，然而反复发病及药物耐受现象的产生常常限制其最终临床疗效。
[0003]自身免疫性疾病治疗过程中产生的药物耐受可以分为天然耐药和获得性耐药两种，均与外周血单核细胞P-糖蛋白(P-gp)表达升高相关。天然耐药是指病人在初次给药时就出现药物耐受现象。自身免疫性疾病发病过程中，过量的炎症因子通过P-gp转运至胞外产生异常炎症反应，并反馈刺激P-gp表达进一步升高。由于多数免疫抑制剂是P-gp的底物，因此升高的P-gp能够将免疫抑制剂外排出免疫细胞，导致自身免疫性疾病治疗可能存在天然耐药的现象。获得性耐药是指病人在多次给药后逐渐出现对药物敏感性下降的现象。大量研宄表明自身免疫性疾病病人长期使用免疫抑制剂后常出现严重的药物耐受反应，即免疫抑制剂通过诱导外周血单核细胞P-gp表达，降低胞内药物浓度，从而产生获得性耐药。为控制病程发展、减轻病理症状，IBD病人需服用包括糖皮质激素在内的多种免疫抑制剂，但临床研宄证实长期用药可导致外周血单核细胞P-gp上调最终造成药物疗效下降。尽管关于IBD治疗过程中产生的获得性耐药已被证实，但IBD病人是否存在天然耐药却鲜有研宄。对天然耐药的忽视可能导致临床治疗延误及错误增加用药剂量，加速获得性耐药的产生。因此，对IBD病人初次用药前或多次用药后的药物敏感性进行科学评估非常必要和重要，评估结果有助于优化IBD的药物治疗方案，提高短期及长期免疫抑制剂用药的最终疗效。
【发明内容】
[0004]本发明旨在证实IBD天然耐药现象的产生，并阐明这一现象发生的相关机制，即炎性肠病小鼠体内过度分泌的细胞因子TNF- a、IL17及LPS通过STAT3/Nf- κ b途径，促进STAT3磷酸化，进而诱导P65磷酸化及核转位促进外周血单核细胞P-gp表达，降低胞内免疫抑制剂的药物浓度，抑制其治疗效果，从而造成天然耐药的产生。而给予P-gp特异性抑制剂可以逆转这一耐药现象。定量PCR及LC-MS/MS检测结果表明炎性肠病小鼠体内外周血单核细胞mdrl表达升高、胞内药物水平较正常小鼠偏低；ELISA检测结果证实炎性肠病小鼠血浆中TNF-a、IL-|3、IL-6、IL-17、LPS分泌水平升高，且体外细胞实验表明上述炎症因子及LPS均可诱导mdrl表达升高；Western Blot实验表明TNF- a，LPS及IL17是通过诱导Ρ65磷酸化及核转位促进外周血单核细胞P-gp表达。通过炎症刺激或转染实验模拟IBD病人体内外周血淋巴细胞的生理状态，给予特异性P-gp抑制剂后可逆转胞内药物浓度下降的现象。
【附图说明】
[0005]图1、TNBS造模小鼠出现天然耐药现象，外周血单核细胞P-gp表达量升高，外排作用增强，胞内环孢素CYSA累积水平降低。
[0006]图2:TNBS造模小鼠血浆中炎症因子(TNF-α，IL-β，IL-6，IL-17)及LPS水平显著升高
[0007]图3:炎症因子(TNF-a，IL-β，IL_6，IL-17)及LPS可诱导人源性巨噬细胞THP_1及人源性淋巴细胞CCRF-CEM外排转运体P-gp表达升高
[0008]图4:IL-17可激活STAT3/Nf_ κ b途径，LPS、TNF- a可激活P65磷酸化及核转位
[0009]图5:P-gp抑制剂可逆转IBD天然耐药现象。
【具体实施方式】
[0010]药品与试剂
[0011]细胞培养:人源性巨噬细胞THP-1及人源性淋巴细胞CCRF-CEM购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collect1n，ATCC，Rockville, MD)，于 37°C，5% CO2条件下常规培养，培养基为RPMI 1640培养基，含10%小牛血清，以及青霉素62.5mg/L，链霉素100 mg/L，于组织培养曲颈瓶中培养，每隔2?3天离心换液。RPMI1640培养基购于GIBCO (Gland Island, New York)，小牛血清购于 Hyclone (Logan，Utah，USA)，细胞培养耗材购于 Costar (Cambridge, MA, USA)。
[0012]动物饲养:清洁级BALB/c小鼠，体重18_22g，周龄8_10周，由南京军区南京总医院实验动物中心提供。适龄BALB/c小鼠在标准饲养条件下饲养，温度:22-24°C，相对湿度:60%，光照、黑暗:12h/12h，自由饮食、饮水，适应一周后进行实验。
[0013]PCR:小鼠mdrla及内参actin、人MDRl及内参ACTIN引物均购自Invitrogen (Gibco-1nvitrogen, USA) ；Trizol 总 RNA 提取试剂、RT-PCR 试剂盒、Real-timePCRMaster Mix (SYBR green)购于 Takara(大连宝生物，Japan)。
[0014]LC-MS/MS:甲醇(色谱纯)、乙腈(色谱纯)购自 Sigma-Aldrich (St.Louis，MO)。甲酸及其它分析纯化学试剂均购于南京化学试剂厂(江苏，中国)。超纯水由Mill1-Qsystem(Millipore, Milford, MA, USA)制备。
[0015]Western:RIPA 裂解液、5X 上样缓冲液、1.5 M Tris-HCl pH 8.8,1 M Tris-HClpH 6.8,10% SDS、一抗二抗去除液、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自碧云天生物技术研宄所(江苏，中国)。苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)购自南京生兴生物技术有限公司(江苏，中国)。Glycine (电泳级)、SDS(电泳级)、Tris base (电泳级)、过硫酸胺(ammonium persulfate，APS)均购自 Amerso (USA)。30% Acrylamide/BisSolut1n (29:1)、N，N，N'，Nr -四甲基乙二胺(N，N，Nr，Nr -tetramethyl ethylenediamine，TEMED)均购自 B1-Rad。增强型化学发光试剂盒(Enhanced Chemiluminescence,ECL)购自 Thermo Fisher Scientific (USA)。Stat3、P65、P-P65、Lamin B 单克隆抗体，辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗购自Cell Signaling Technology (Boston，USA)，GAPDH单克隆抗体购自 B1world Technology (MN, USA).。
[0016]具体实例一 TNBS造模小鼠出现天然耐药现象，外周血单核细胞P-gp表达量升高，外排作用增强，胞内环孢素CYSA累积水平降低。
[0017]TNBS小鼠造模:造模前BALB/c小鼠在动物房饲养一周。禁食24小后，苯巴比妥麻醉小鼠，3.5F导管从肛门插入肠道深约5.5cm。造模组以100mg/kg的剂量给予溶于30%乙醇中的TNBS，对照组以同等给药体积给予30%乙醇。之后将小鼠倒置3分钟，于给药后第3天或第7天眼眶取血于含肝素的无菌试管中并处死老鼠。
[0018]外周血淋巴细胞提取:外周血淋巴细胞基于梯度离心的原理通过LympholyteMammal 试剂盒(Cedarlane Laboratories Ltd,Hunby,Ontar1,Canada))提取。向抽取所得的静脉血中加入等体积RPM1-1640培养基进行1:1稀释、混匀后，沿管壁轻轻加至等体积分离液之上(密度:1.086