氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌检测用标准样品及制法
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物检验检疫领域，特别是金黄色葡萄球菌检测用标准样品。
【背景技术】
[0002] 食品安全是重大公共卫生问题，是制约我国经济发展的重要因素。而微生物污染 造成的食源性疾病，是我国食品安全中最突出的问题。近年来，随着食品产业结构的调整、 经济全球化与国际贸易的迅速发展，我国食源性疾病的防控面临一系列新问题和挑战。 [0003] 抗菌药物敏感性试验(antimicrobial susceptibility test，AST)是细菌耐药性 监测和流行病学调查及耐药机制研究的重要手段，包括纸片扩散法、肉汤/琼脂稀释法、自 动化仪器检测法、E-test法等。纸片扩散法师临床实验室应用较为广泛的一种方法，WHO推 荐的纸片扩散法是K-B法(改良Kirby-Bauer法），美国临床实验室标准化委员会(CLSI)每年 都根据新的研究结果对其标准进行补充修正，目前NCCLS/CLSI标准在世界上影响最广。
[0004] 目前，国内主要采用纸片扩散法对金黄色葡萄球菌及大肠杆菌耐药性进行检测， 但对于产ESBLs的大肠杆菌检测比较特殊，用于检测ESBLs的方法主要有:双纸片协同扩散 法（double-disk synergy test, DDS)、酶抑制剂增强的纸片扩散法（inhibitor-potentiated disc diffusion test)，酶抑制剂增强的肉汤稀释法（inhibitor potentiated broth diluted test , IPBDT)、三维测试法（three-dimensional tests, TD)、头抱硝唾吩竞争分析试验(nitrocefin competition assay NCA)，Etest法和Vitek测 试法等。这些主要原理是ESBLs水解第三代头抱菌素的活性可被酶抑制剂所抑制的检测方 法，适用于肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌中ESBLs的检测，是目前检测ESBLs的 标准方法。目前所采用的SN/T1944-2007《动物及其制品中细菌耐药性的测定纸片扩散法》 检测标准，主要是基于CLSI所推荐的方法及耐药折点对细菌进行判读是否耐药。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是克服目前食品中致病菌耐药性标准样品紧缺的状况，根据实际工 作的需要和国内现状开展了食品中致病菌耐药性标准样品的研制，均匀性和稳定性良好， 符合检验检疫要求，提高检验检疫水平和效率。
[0006] 本发明为实现上述目的所采用的技术方案是:氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌 检测用标准样品，样品含有冻干的细菌混合物与冻干保护剂，采用西林瓶真空包装，其中细 菌混合物包括氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌。
[0007] 所述标准样品每瓶装样量为1克，平均每份样品中含有2.0-4.0 X 106cfu目标菌。
[0008] 本发明氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌检测用标准样品的制法：具体过程如 下： 第一步菌株活化、增菌培养及纯化： 所用标准菌株来源于美国标准菌种收藏所(American Type Culture Collection)，标 准菌株号ATCC 51329,氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌标准菌株进行菌株活化、增菌培 养，进行生化鉴定和药敏试验； 第二步样品制备： 采用真空冷冻干燥方式制备，将灭菌蒸馏水中加入保护剂，再次煮沸灭菌;冷却后加入 活化的红霉素耐药性金黄色葡萄球菌，混匀;分装至无菌干燥西林瓶中，真空冷冻干燥； 第三步细菌鉴定及耐药性测定： 取制备的标准样品进行鉴定，经采用生化鉴定和药敏试验分析，确认所制备的标准样 品为氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌标准样品； 第四步均匀性试验： 采用在基体中添加氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌形成大样，然后充分混匀并分装 的方法制备100份标准样品;根据以往的研究结果，在充分混匀的大样中目标菌服从泊松分 布，大样中目标菌添加量为2.0-4.0 X 108cfu，平均每份样品中含有2.0-4.0 X 106cfu目标 菌;按照泊松分布计算，每个样品中含有2.0-4.0 X 106 cfu目标菌的概率为99.81 %;每瓶 样品中的目标菌量被控制在2.0-4.0 X 106 cfu之间，样品的均匀性得以保证； 第五步稳定性试验： 该标准样品的稳定性经过两年的测定，氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌标准样品在 干燥条件下，避光、密封，冷冻贮存，两年内稳定。
[0009]所述标准样品在稳定性试验后进行第六步不确定度评估： 按照GUM[4]，确定氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌含量W的测量不确定度模型;W的合 成标准不确定度远远大于瓶内不均匀性和瓶间不均匀性所带来的标准不确定度，因此，可 以忽略瓶内不均匀性和瓶间不均匀性对标准样品定值不确定度的影响;其中所添加的氨基 糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌为100%纯物质，其不确定度也可以忽略； 取包含因子k=2,标准样品中氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌含量扩展不确定度为 0.11%〇
[0010]所述第二步样品制备的具体工艺如下： a. 在恒温恒湿、无菌操作间中，制备含有2.0-4.0 X 108cfu的大样，按特定的方式混匀 上述样品；所述特定的方式样品的混合是，样品置于干净无菌袋中，混合仪拍打混合，再将 混匀好的上述溶液加入到总体的豆粉水溶液中，重复混合步骤； b. 将混合样品放置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥制备成混合冻干粉； c. 将混合冻干粉样品分装于经160°C干热处理2 h的洁净的7mL棕色玻璃瓶中封盖密 封，每瓶内装混合冻干粉样品lg。最后所有分装好的样品经60C0 4 kGy福照1 h; d. 获100瓶含有氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌的标准样品。瓶装后的样品加贴唯 一性标识，冷冻贮存。
[0011] 所述b.中冷冻干燥： 将a步骤中制备好的菌液分装0.5mL/瓶，放置橡胶盖，但不要塞紧，置于中试冻干机中 低温真空冷冻干燥，制备成混合冻干粉； 冷冻工艺如下： 1) 预冷阶段:隔板温度5 °C; 2) 冷冻阶段:设置隔板温度为10°C，每个阶段降低10°C，至_50°C，每个温度阶段运行时 间分别为lh; 3) 主干燥阶段:ll隔板温度-50°C，运行时间0.5h，真空度0.2mbar;i)隔板温度-40°C， 运行时间7h，真空度0.4mbar;(|_板温度-35Γ，运行时间7h，真空度0.6mbar;,隔板温度-25°C，运行时间5h，真空度0.8mbar;⑤隔板温度-15°C，运行时间4h，真空度1. Ombar;@隔板 温度-5 °C，运行时间2h，真空度1.2mbar; 4) 二次干燥阶段:_隔板温度0Γ，运行时间3h，真空度O.OOlOmbar; _隔板温度15 。(：，运行时间3h，真空度0.001 Ombar;③隔板温度25 °C，运行时间3h，真空度0.001 Ombar。
[0012] 本发明标准样品的制备完成，对全面深入的研究解决食品中致病菌耐药性标准样 品的制备技术和稳定性保证技术，积极开展我国食品中致病菌耐药性检测标准样品的研 制，添补该测量领域的空白，具有很重要的现实意义。加之人们对食品安全方面的关注和重 视，以及开展食品中致病菌耐药性检测工作的日益扩展和重要性，标准样品又是实验室质 量控制工作的重要环节，食品致病菌耐药性标准样品具有广阔的市场，有较大的经济效益 和社会效益。
【附图说明】
[0013] 图1是本发明氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌标准样品制备工艺流程图。
【具体实施方式】
[0014] 下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施 例。
[0015] 实施例1制备红霉素氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌标准样品 如附图1所示，具体工艺过程如下： 第一步菌株活化、增菌培养及纯化： 所用标准菌株来源于美国标准菌种收藏所(American Type Culture Collection)，标 准菌株号ATCC 51329，氨基糖苷类耐药性金黄色葡萄球菌标准菌株按照GB/T4789.40-2008
[1]进行菌株活化、增菌培养，进行生化鉴定和药敏试验； 第二步样品制备： 采用真空冷冻干燥方式制备，将灭菌蒸馏水中加入保护剂，再次煮沸灭菌;冷却后加入 活化的红霉素耐药性金黄色葡萄球菌，混匀;分装至无菌干燥西林瓶中，真空冷冻干燥； 仪器与试剂 冷冻干燥机、灭菌奶粉、海藻糖、棕色玻璃瓶、生化药敏鉴定仪 操作步骤 a. 在恒温恒湿、无菌操作间中，制备含有2.0X 108cfu的大样，按特定的方式混勾上述 样品； b. 将混合样品放置于中试冻干机中低温真空冷冻干燥(按照特定的冻干程序进行)制 备成混合冻干粉； c. 将混合冻干粉样品分装于经160°C干热处理2