专利名称：用于检测结核杆菌中的异烟肼敏感性的方法和试验片的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测结核杆菌中的异烟胼敏感性的方法和试验片。
背景技术：
据报道，目前日本每年有数千人、全球每年有数百万人死于结核。结核的治疗基本 上采用以化学疗法为中心的内科疗法，在通过内科疗法无法达到治疗目的的情况下考虑外 科疗法。作为内科疗法中使用的结核治疗的药物，已知有异烟胼(INH)、利福平(RFP)、链 霉素(SM)、乙胺丁醇(EB)、吡嗪酰胺(PZA)等多种药物。但是，在对患者给药时，存在着产 生耐药菌的问题，所述耐药菌因突然变异而获得了对所给药物的耐性。有报道称耐药菌由于特定基因发生突变而获得耐药性。因此，人们开发了通过 检测特定基因的突变来检测耐药菌的检测方法。例如，有人公开了结核杆菌诊断试剂盒，该 试剂盒中包含固定有寡核苷酸的基板，所述寡核苷酸是根据对结核治疗用药物敏感的野生 型结核杆菌和对任一种药物具有耐性的突变型结核杆菌中的结核杆菌基因组上的结核治 疗用耐药性关联基因的核苷酸序列合成的(专利文献1)。现在开发的DNA微列阵试剂盒 "Oligo Array"(日清纺绩株式会社)是能够检测与对INH、RFP、SM、卡那霉素(KM)和EB 这5种药物的耐性有关的基因突变的试剂盒。异烟胼(INH)是结核治疗中最具代表性的药物。INH耐性菌中的大多数在katG基 因或inhA基因中存在突变。人们就检测这些突变的方法进行了各种研究(例如专利文献 2和3)。但是，INH耐性菌中约80%具有katG基因或inhA基因的公知的突变，所以作为耐 性菌被检出，而余下的约20%的INH耐性菌则无法检测。因此，对于保有这样的无法检测的 INH耐性菌的结核患者也给予INH。然而，有报道称编码过氧化氢酶-过氧化物酶的上述katG基因构成以furA为起 始基因(先頭遺伝子)的firA-katG操纵子，而furA基因是该操纵子的负转录基因(負O 転写遺伝子)(非专利文献1)。由于furA基因调节katG的表达，所以furA基因与INH耐 性有关。在非专利文献1中，只记载了 furA基因的功能通过缺失全体furA基因而得到确 认，关于fuA基因的突变则没有任何记载。现有技术文献专利文献专利文献1 日本特开2001-103981号公报专利文献2 日本专利第3579049号说明书专利文献3 日本特表平9-501823号公报非专利文献非专利文献1 :A. S. Pym等人，Molecular Microbiology，2001 年，40卷，第 879-889 页非专利文献2 :Parish 等人，J. Bact.，2007 年，189 卷，10 号，第 3721-37 页
非专利文献3 =Cohen-Gonsaud 等人，J. Mol. Biol.，2002 年，320 卷，2 号，第 249-261 页非专利文献4 =Marrakchi 等人，Microbiology，2002 年，148 卷(Pt4)，第 951-960 页
发明内容
发明所要解决的课题本发明的目的在于提供用于更准确地检测结核杆菌的INH敏感性、即结核杆菌 是否是INH耐性菌的新方法。解决课题的方法本发明人等发现furA基因也是异烟胼敏感性基因之一，根据该基因是否存在突 变，可以鉴定INH耐性菌。本发明提供检测结核杆菌中的异烟胼敏感性的方法，该方法包括以下步骤获得检体中的结核杆菌的furA基因的步骤；以及对该获得的furA基因检测与异烟胼耐性有关的突变的步骤。在一实施方案中，上述突变是指序列表的SEQ ID NO=I记载的核苷酸序列(塩基 配列)的41位的碱基(塩基)C突变成T的突变、或其互补序列的突变。本发明还提供用于检测结核杆菌中的异烟胼敏感性的试验片，该试验片上固定有 至少一个探针，该至少1个探针由能够与具有结核杆菌的furA基因突变的核苷酸序列的区杂交 的寡核苷酸构成，或者由在具有该结核杆菌的furA基因突变的核苷酸序列的区中，虽然不 能与具有该突变的核苷酸序列的区杂交、但能够与该区所对应的野生型核苷酸序列构成的 区杂交的寡核苷酸构成。在一实施方案中，上述furA基因的突变是指序列表的SEQ ID NO :1记载的核苷酸 序列的41位的碱基C突变成T的突变、或其互补序列的突变。在另一实施方案中，能够与上述野生型核苷酸序列的区杂交的寡核苷酸由序列表 的SEQ ID NO :3记载的核苷酸序列或其互补序列构成。在一实施方案中，上述试验片上进一步固定有探针，该探针由能够与具有结核杆 菌的fabGl基因突变的核苷酸序列的区杂交的寡核苷酸构成，或者由在具有该结核杆菌的 fabGl基因突变的核苷酸序列的区中，虽然不能与具有该突变的核苷酸序列的区杂交、但能 够与该fabGl基因的区所对应的野生型核苷酸序列构成的区杂交的寡核苷酸构成。在一实施方案中，上述fabGl基因的突变是指序列表的SEQ IDNO :8记载的核苷酸 序列的609位的碱基G突变成A或T的突变、或其互补序列的突变。在又一实施方案中，能够与上述fabGl基因的野生型核苷酸序列的区杂交的寡核 苷酸由序列表的SEQ ID NO :10记载的核苷酸序列或其互补序列构成。本发明还提供结核杆菌中的异烟胼敏感性的检测用试剂盒，该试剂盒包含上述任 一项的试验片。本发明还提供检测结核杆菌中的异烟胼敏感性的方法，该方法包括以下步骤获得检体中的结核杆菌的furA基因的步骤；
使该获得的furA基因与上述任一项的试验片接触，以使该furA基因与固定在该 试验片上的探针结合的步骤；以及使与该探针结合的furA基因显色的步骤。在一实施方案中，上述方法进一步包括以下步骤获得上述检体中的结核杆菌的fabGl基因的步骤；使该获得的fabGl基因与上述任一项的试验片接触，以使该fabGl基因与固定在 该试验片上的探针结合的步骤；以及使与该探针结合的fabGl基因显色的步骤。发明效果根据本发明，对于迄今为止尚未鉴定为INH耐性菌的一部分INH耐性菌，也可以正 确地鉴定为INH耐性菌。因此，通过与现有的检测katG基因或inhA基因中的突变的方法 组合，对于INH耐性菌中的约90%可以鉴定为INH耐性菌。这样，可以更准确地检测INH敏 感性。其结果，可以对保有异烟胼耐性结核杆菌的结核患者提供适当的治疗。
具体实施例方式(furA基因和fabGl基因的突变)本发明中，结核杆菌(Mycobacterium tuberculosis)的异烟胼(INH)敏感性基因 是指与结核治疗用药物异烟胼(INH)的作用相关的基因。在INH耐性菌中，该野生型INH 敏感性基因中发生突变，获得对INH的作用的耐药性。具体而言，在由具有突变的INH敏感 性基因表达的酶中，由于构成的氨基酸序列中发生取代、插入和/或缺失，所以酶活性降低 或药物结合位点的结构发生变化，因此INH的效果被抑制。如上所述，结核杆菌的INH耐性通过katG基因、inhA基因等的与INH的作用相关 的各种基因的突变而得以发生。这样的突变例如公开在专利文献1 3中。这些突变中， 只要存在任一种突变，就能够成为INH耐性结核杆菌。在本发明中新发现了 除上述基因外，通过furA基因的突变，结核杆菌也能够成 为INH耐性菌。如上所述，furA基因是furA-katG操纵子的起始基因、是操纵子的负转录 基因(非专利文献1)。具体而言，furA基因突变的例子有序列表的SEQ ID NO 1记载的核苷酸序列的 41位的碱基C突变成T的突变、以及其互补序列中的碱基G突变成A的突变。在本发明 中，汇总该突变，描述为“由核苷酸序列的41位的碱基C突变成T的突变、或其互补序列的 突变”。由于该突变，由furA基因编码的FurA(序列表的SEQ ID NO 2)的14位的丙氨酸 (Ala)突变成缬氨酸(Val)。在本发明中，还新发现了 fabGl基因具有突变，由于该突变，结核杆菌能够成为 INH耐性菌。fabGl基因是fabGl-inhA操纵子的起始基因、是编码分枝菌酸合成酶的基因 (非专利文献2 4)。具体而言，fabGl基因的突变是指序列表的SEQ ID NO :8记载的核苷酸序列的609 位的碱基G突变成A或T的突变、以及其互补序列中的碱基C突变成T或A的突变。在本 发明中，汇总该突变，描述为“由核苷酸序列的609位的碱基G突变成A或T的突变、或其互 补序列的突变”。该突变是由fabGl基因编码的FabGl (序列表的SEQID NO 9)的203位的亮氨酸(Leu)的沉默突变。作为检测furA基因和fabGl基因上的上述突变的方法，可以采用=Nollau等人， Clin. Chem.，43，1114-1120(1997)、“突然変異検出乃亡的O研究室口卜^ ^ (用于检测 突然变异的研究室操作规程)” (Landegren, U.等人，Oxford University Press (1996))； 以及"PCR” 第 2 版(Newton 等人，BIOS Scientific Publishers Limited (1997))等 中记载的通常使用的方法。具体而言，例如可以从PCR片段测序法、单链构象多态性法 (SSCP 法0rita，Μ.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，86 (8)，2766-2770 (1989))、异源 双链变性浓度梯度凝胶电泳法(DGGE法Sheffield，V. C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，86(1) ,232-236(1989))、侵入法(Invader method) (Griffin, Τ. J.等人，Trend Biotech, 18,77(2000)) > SniPerTM ^ (Amersham pharmacia biotech) > TaqMan PCR ^ (Livak, K. J.，Genel. Anal.，14，143 (1999) ；Morris, Τ.等人，J. Clin. Microbiol.，34， 四33 (1996))、MALDI_T0F/MS 法(Griffin, Τ. J.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，96 (11)， 6301-6(1999))、限制酶长多态性分析法(RFLP =Murray, J. C.等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA.，80 (19) ,5951-5955(1983))、DNA 芯片杂交法(Kokoris, K.等人，J. Med. Genet.，36， 730(1999))、MasscodeTM法^liagen Genomics)等中例示的公知的方法中选择，但并不限于 这些方法。只要是检测基因突变的方法，可以采用任何方法。例如，还可以采用PCR-序列特 异性寡核苷酸探针(SS0P :sequence-specific oligonucleotide probes)法。PCR-SSOP法 是指，制作包含突变位点的约10 约30碱基、且与一方的对立基因序列完全互补的探针， 通过PCR法扩增包含突变位点的DNA，之后进行杂交，根据是否形成杂化物来判别基因多态 性的方法。(探针)作为本发明的用于检测结核杆菌中的异烟胼敏感性的探针，可以列举能够与具 有结核杆菌的furA基因突变的区结合(杂交)的寡核苷酸探针(以下，有时称作“furA突 变探针”)；以及在具有该furA基因突变的区中，虽然不能与具有突变的核苷酸序列的区杂 交、但能够与由该区所对应的野生型核苷酸序列构成的区杂交的寡核苷酸探针(以下，有 时称作“furA野生型探针”)。作为探针，还可以列举能够与具有结核杆菌的fabGl基因突变的区结合(杂交) 的寡核苷酸探针(以下，有时称作“fabGl突变探针”)；以及在具有该fabGl基因突变的区 中，虽然不能与具有突变的核苷酸序列的区杂交、但能够与由该区所对应的野生型核苷酸 序列构成的区杂交的寡核苷酸探针(以下，有时称作“fabGl野生型探针”)。各探针的长度还取决于结合(杂交)时的温度，但通常为10 30核苷酸长，优选 为12 沈核苷酸长。本发明中，突变探针能够与具有furA基因或fabGl基因的上述各突变的区结合 (杂交)。具有这样的突变的区，突变以外的碱基序列为野生型。当该区为野生型时，突变 探针无法与该区结合。为了准确地检测突变，优选设计成在构成突变探针的寡核苷酸的中 间部位存在突变的位置。在本发明中，野生型探针在野生型的furA基因或fabGl基因中能够与具有上述突 变的区所对应的任意区结合(杂交)。上述各探针可以通过使用标准程序和引物分析软件、例如I^rimerExpress (PerkinElmer社)而得到，可以采用自动化寡核苷酸合成仪等标准方法进行合成。并且，为了将各探针固定在试验片上，例如可以对各探针的5’末端或3’末端的任 一方进行修饰。各探针只要可以检测即可，可以以任何形式提供，可以是溶液形式、或者可以被固 定在载体上。为了易于检测，优选固定在试验片上。(试验片)在本发明的用于检测结核杆菌中的异烟胼敏感性的试验片上固定有至少一个探 针。所固定的至少一个探针为上述furA突变探针或furA野生型探针。furA突变探针和 furA野生型探针优选被固定在试验片的各不相同的位置上。当furA基因具有突变时，furA 基因与furA突变探针结合，而不与furA野生型探针结合。而当furA基因不具有突变时， furA基因与furA野生型探针结合。因此，当结核杆菌为INH敏感性时，只与furA野生型探 针结合；当结核杆菌为INH耐性时，不与furA野生型探针结合，而与furA突变型探针结合。本发明的试验片上可以进一步固定用于确认显色的对照或标志物。在本发明的用于检测结核杆菌中的异烟胼敏感性的试验片上可以进一步固定上 述fabGl突变探针或fabGl野生型探针。fabGl突变探针和fabGl野生型探针更优选被固 定在试验片的各不相同的位置上。当fabGl基因具有突变时，fabGl基因与fabGl突变探 针结合，而不与furA野生型探针结合。而当fabGl基因不具有突变时，fabGl基因与fabGl 野生型探针结合。因此，当结核杆菌为INH敏感性时，只与fabGl野生型探针结合；当结核 杆菌为INH耐性时，不与fabGl野生型探针结合，而与fabGl突变探针结合。在本发明的试验片上，可以进一步固定能够检测除furA基因和fabGl基因以外 的、INH敏感性或INH耐性的公知的探针。本发明的试验片，可以通过将上述探针按照物理或化学方法固定在载体表面上来 制作。作为载体，可以列举乙烯基系聚合物、尼龙、聚酯、聚乙烯、聚丙烯、聚苯乙烯、聚对苯 二甲酸乙二酯、硝基纤维素等有机材料；玻璃、二氧化硅等无机材料；金、银等金属材料等， 没有特别限定。从成形加工性容易的角度考虑，优选有机材料，更优选聚对苯二甲酸乙二酯 等聚酯类。为了在显色法的检验中容易直观确认载体的显色，这些载体优选为白色。上述探针优选每一种以一定间隔配置在上述载体上。作为在这些载体表面按物 理方法固定探针的方法，可以采用公知的各种方法。例如有用聚赖氨酸等聚阳离子性高分 子包被载体表面的方法。根据该方法，利用载体表面与作为聚阴离子的探针的静电相互作 用，可以提高固定化的效率。还有以下方法在探针末端添加无关的核苷酸序列(poly T链 (polythymine chain)等)，增加所固定的探针自身的分子量，从而提高固定化效率的方法。 例如，将包含添加有poly T的寡核苷酸探针的溶液由分液器吐出到硝基纤维素膜上，然后 照射紫外线，从而可以比较容易地将各种探针固定。具体而言，将各探针分别放入具备M-G 针04-gauge needle)的分液器中，边以0. 5 1. 0 μ L/分钟的量吐出，边以2. 5 8. 5mm/ 秒的涂布速度、分别以一定间隔涂布在硝基纤维素膜上，则各探针以按照一定间隔排列的 约1 2mm宽的条纹形式被涂布。通过对涂布有该探针的条纹的载体照射紫外线，探针被 固定在载体上。并且，根据需要，按照横断这些条纹的方式进行细切，则可一次得到各探针 按顺序配置的多个试验片。当载体表面为金等金属材料时，还已知通过用2-氨基乙硫醇等具有氨基的硫醇或二硫醚化合物等处理载体表面，经由载体表面与作为聚阴离子的探针的静电相互作用， 固定化的效率提高。作为向探针中导入官能团以进行化学固定的方法，可以采用公知的各种方法。例 如，当载体的材料为玻璃、二氧化硅等无机材料时，有使用三甲氧基甲硅烷基、三乙氧基甲 硅烷基等可进行硅烷耦联反应的官能团修饰探针末端的方法，将载体在含有如此修饰的探 针的溶液中浸渍对 48小时，取出后进行清洗，从而得到试验片。或者，还有以下方法通 过用氨基乙氧基硅烷等具有氨基的硅烷耦联剂处理玻璃、二氧化硅等无机材料载体，将载 体表面氨基化，然后使之与末端导入有羧酸的探针进行氨基耦联反应，从而将探针固定化。 并且，当载体的材料为金、银等金属材料时，用巯基、二硫基等可与金属结合的官能团修饰 探针末端，将载体在含有该修饰探针的溶液中浸渍M 48小时，取出后进行清洗，从而可 以将探针固定化。还已知并非固定所合成的探针而是利用平版印刷技术在载体表面上直接合成具 有所期望的序列的探针的方法。(使用试验片的INH敏感性检测方法)1.检体在本发明中，“检体”只要是通常检查结核杆菌所必需的检体即可。例如有痰、咽拭 子(咽頭& C 0液)、胃液、支气管肺泡清洗液、气管内吸引物、喉拭子和/或组织活检物等 体液、以及由培养这些检体得到的培养物。2.检体的前处理(DNA的提取)从上述检体中提取DNA可以按照公知的方法进行。例如有酚提取法、硫氰酸胍提 取法、氧钒核糖核苷复合提取法等。3.核酸的扩增由得到的DNA获得目标基因。通过PCR法扩增目标基因时，例如按照以下步骤进 行(1)变性步骤，在约92 95°C、约30秒 1分钟的反应条件下对双链基因组DNA进行 热处理使之转变成单链DNA ； (2)退火步骤，通过在约50 65°C、约20秒 1分钟的反应 条件下使至少两种扩增引物与各该单链DNA分别结合，制作成为PCR的反应起点的双链部 分；(3)链延伸步骤，在约70 75°C、约20秒 5分钟的反应条件下使用DNA聚合酶进行 反应；以及利用常规方法重复进行步骤(1) (；3)20 40次的步骤。作为用于通过PCR扩增furA基因的引物对，可以列举包含含有突变位点的序 列位点上游的序列和该位点下游的序列使能够扩增包含该突变位点的furA基因、具有 相同或互补的核苷酸序列的寡核苷酸。优选的引物对的例子有序列表的SEQ ID NO 6 (gccatcccacgatccagcgg)和 SEQ ID NO 7 (gtcgggcagc gcaaaacgca c)的寡核昔酸或具 有其互补序列的寡核苷酸。另一方面，作为用于通过PCR扩增fabGl基因的引物对，可以 列举包含含有突变位点的序列位点上游的序列和该位点下游的序列使能够扩增包含该 突变位点的fabGl基因、具有相同或互补的核苷酸序列的寡核苷酸。优选的引物对的例子 有序列表的 SEQ ID NO :13(ggctacatcg acaccgatat gacc)禾口 SEQ ID NO 14 (gcgtccttgt gttgtgtcag tgg)的寡核苷酸或具有其互补序列的寡核苷酸。为了提高测定的灵敏度，例如由检体直接扩增DNA时，可以在上述PCR反应之前进 一步通过Nested PCR法(日本特公平6-81600号公报)等扩增核酸。Nested PCR法中的引物可以选择上述PCR反应中使用的引物外侧的序列。例如，当为furA基因时，引物的例子 有序列表的 SEQ ID NO :4(ggctcatcgg aacatacgaa ggctg)禾口 SEQ ID NO 5 (gtcgtacacg gcttgccgg)的寡核苷酸或具有其互补序列的寡核苷酸；当为fabGl基因时，引物的例子 有序列表的 SEQ ID NO 11 (gtcgaaggcaaacgtgaccg eg)禾口 SEQ ID NO 12 (gtccagcagt cctgtcatgt g)的寡核苷酸或具有其互补序列的寡核苷酸。上述探针和引物的序列可以通过使用标准程序和引物分析软件、例如I^rimer Express (Perkin Elmer社制)而得到，可以采用自动化寡核苷酸合成仪等标准方法进行合 成。4.结核杆菌的INH敏感性检测方法本发明中，结核杆菌的INH敏感性可以按照PCR-SSOP法进行检测。还可以更简便 地通过比较所固定的探针的位置和在PCR-SSOP法中检测到的点(spot)的位置来进行检 测。例如，当使用固定有上述探针的试验片时，从不易发生非特异性结合反应的角度考虑， PCR-SSOP法中的杂交优选在约60 65°C的温度下进行。当检测到的点的位置为furA野生 型探针的位置时，可以判断结核杆菌没有发生突变、即为INH敏感性；而当检测到的点的位 置为furA突变探针的位置时，可以判断结核杆菌为INH耐性。当检测到的点的位置为fabGl 野生型探针的位置时，可以判断结核杆菌为INH敏感性；而当检测到的点的位置为fabGl突 变探针的位置时，可以判断结核杆菌为INH耐性。为了易于检测在PCR-SSOP法中检测到的点，优选使用修饰放射性同位素、荧光物 质、化学发光物质等标记物质而得到的引物对来扩增基因。在使用上述标记物质的检测方 法中，从比较廉价且容易实施的角度考虑，优选氮蓝四唑(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸 酶对甲苯胺盐(BCIP)显色法。具体可以如下进行。首先，使用对上述引物的3’末端或5’ 末端进行了生物素修饰的引物对扩增末端具有生物素的基因。然后，通过已扩增的基因与 固定在试验片上的探针的杂交使该基因与探针结合，再使该基因与碱性磷酸酶标记链霉亲 和素接触，使其与存在于与探针结合的基因的末端的生物素结合。再加入NBT/BCIP，使之与 碱性磷酸酶反应，从而在与探针结合的碱性磷酸酶所存在的位置显色。该显色可以直观确 认。(含有试验片的检测用试剂盒)本发明的检测用试剂盒包含上述试验片。优选可以包含适于检测结核杆菌的异烟 胼敏感性的任意的试剂类。可以列举例如用于提取上述DNA的试剂、基因扩增用试剂、用 于检测基因与探针结合的试剂等。作为具体的试剂盒，例示用于实施上述PCR-SSOP法的试剂盒。本发明的试剂盒中所能包含的、用于DNA提取以及获得目标基因的试剂为上述任 意方法中使用的试剂。本发明的试剂盒中还可以包含用于通过PCR扩增furA基因的引物对。引物对为包 含含有突变位点的序列位点上游的序列和该位点下游的序列使能够扩增包含任意突变位 点的furA基因、具有相同或互补的核苷酸序列的寡核苷酸。为了检测INH敏感性，furA基 因扩增用的优选的引物对的例子有上述序列表的SEQ ID NO 6和SEQ ID NO 7的寡核苷 酸或具有其互补序列的寡核苷酸。而对于fabGl基因，可以列举上述序列表的SEQ ID NO 13和SEQ ID NO :14的寡核苷酸或具有其互补序列的寡核苷酸。作为用于提高测定灵敏度的Nested PCR法中的引物对，例如，对于furA基因，可以列举上述序列表的SEQID NO 4 和SEQ ID NO 5的寡核苷酸或具有其互补序列的寡核苷酸；而对于fabGl基因，可以列举 上述序列表的SEQ ID NO 11和SEQID NO 12的寡核苷酸或具有其互补序列的寡核苷酸。并且，为了在PCR-SSOP法中容易进行检测，优选使用放射性同位素、荧光物质、化 学发光物质等修饰上述引物对。基因的扩增除了采用PCR法以外，还可采用LAMP法、ICAN法等公知的技术。在本 发明中，可以采用上述任一种方法，本发明还包含在这些方法中使用的含有任意试剂的试剂盒。并且，本发明的试剂盒可以含有用于检测的试剂类。例如，当采用NBT/BCIP显色 法时，所用试剂例如有链霉亲和素修饰碱性磷酸酶、NBT和BCIP。实施例(实施例1:INH耐性结核杆菌的结核杆菌基因分析)在本实施例中获取92个检体，这92个检体通过确认它们在含有INH的溶液(MGIT 960 日本Becton Dickinson株式会社制)或含有INH的琼脂培养基(小川培养基、7H10) 中生长而判定为INH耐性结核杆菌，利用酚提取法从这92个检体中提取基因组DNA并进行纯化。LfurA基因的分析使用以下所示的引物对扩增furA基因。PCR反应条件为变性过程94°C 30秒、退 火过程55°C 20秒、链延伸过程72°C 20秒，循环进行该步骤30次，扩增furA基因。furA 弓丨物 lgccatcccac gatccagcgg(SEQ ID NO 6)furA 弓丨物 2gtcgggcagc gcaaaacgca c (SEQ ID NO :7)利用测序仪研究所扩增的92例检体的fur基因的核苷酸序列。其结果，在92例 中的14例中发现了新的突变Alal4Val[gCc — gTc]。2. fabGl基因的分析使用以下所示的引物对扩增fabGl基因。PCR反应条件如下变性过程94°C 30秒、 退火过程55°C 20秒、链延伸过程72°C 20秒，循环进行该步骤30次，扩增fabGl基因。fabGl 弓丨物 lggctacatcg acaccgatat gacc(SEQ ID NO 13)fabGl 弓丨物 2gcgtccttgt gttgtgtcag tgg(SEQ ID NO :14)利用测序仪研究所扩增的92例检体的fabGl基因的核苷酸序列。其结果，在92 例中的15例中发现了新的突变LeU203LeU[ctG — ctA/T]。该突变是沉默突变，尽管其中 的碱基被取代，但所编码的氨基酸未变。3.已知突变的检测对于上述92个检体，分别扩增具有已知突变的katG基因和inhA基因，检测是否 存在已知的突变。关于katG，使用以furA起始密码子为基点、与其上游1 碱基结合的引物 (gctcatcgga acatacgaag =SEQ ID NO 15)和以katG终止密码子为基点、与其下游50碱基 结合的引物(gtgctgcggc gggttgtggttgatcggcgg =SEQ ID NO :16)，对 furA-katG操纵子进 行PCR，利用DNA测序法确定总核苷酸序列。以现有论文中未报道的突变作为新的突变。关于inhA，使用以fabGl起始密码子为基点、与其上游200碱基结合的引物(ttcgtagggc gtcaatacac =SEQ ID NO 17)和以inhA终止密码子为基点、与其下游40碱基 结合的引物(ccgaacgaca gcagcaggac =SEQID NO :18)，对fabGl-inhA操纵子进行PCR，利用 DNA测序法确定总核苷酸序列。以现有论文中未报道的突变作为新的突变。上述1 3的分析结果汇总在下面的表1中。[表1]
突变的种类株数比例具有 furA c41t1415. 2%只有 furA c41t44. 3%具有 fabGlg609a/t1516. 3%只有 fabGlg609a/t1213. 0%具有 furA c41t 或 fabGlg609a/t2830. 4%具有已知的突变6772. 8%具有ftirA c41t或已知的突变7076. 1%具有fabGlg609a/t或已知的突变7884. 8%具有furA c41t、fabGlg609a/t或已知的突变8390. 2%由表1可知92个检体中有67个检体是具有已知突变的INH耐性菌，但若还考虑 furA基因和fabGl基因的突变，则可以容易地判定92个检体中有83个检体(90. 2% )的 耐性菌为INH耐性。因此，可以进行更准确且简便的检测。(实施例2:试验片的制作)1.探针的设计作为能够检测结核杆菌的INH敏感性的探针，设计以下两种探针(探针1和2 分 别为furA野生型探针和fabGl野生型探针)。这两种探针均为在具有突变的情况下不结 合、只与野生型基因结合(杂交)的野生型探针。探针 lgctccggacg gccgaccgtc g (SEQ ID NO 3)探针 2ggggcgctgc aatttatccc(SEQ ID NO :10)2.探针的固定化使用末端转移酶(Promega社)，在上述探针1和2(分别见SEQ IDNO :3和SEQ ID N0:10)各自的5，末端添加poly Τ。具体而言，将0. 4 μ L(30单位/ μ L)末端转移 _、2μ (10ρπιΟ1/μυ胸苷三磷酸、2μ (50πιΜ)寡核苷酸探针、产品附带的2 μ L反应缓 冲液和3. 6 μ L纯化水混合，制备反应溶液，使之在37°C下反应4小时，之后向其中加入 90 μ LlO X SSC缓冲液，由此得到lpmol/yL的添加有poly T的寡核苷酸探针。
然后，将添加有poly T的野生型探针(探针1和幻分别放入具备M-G针的分液 器中，边以0. 7 μ L/分钟的量吐出，边以2. 5mm/秒的涂布速度在硝基纤维素膜(纵75mmX 横150mm =Whatman社)上以2mm的间隔沿纵向涂布，使形成2mm宽的条纹。然后，对这些硝 基纤维素膜照射2分钟312nm的紫外线，固定探针。然后，按照包含所有条纹的方式切断硝 基纤维素膜，作成5mm X 150mm的试验片。产业实用性根据本发明，对迄今为止无法判定INH敏感性的INH耐性菌也可以进行鉴定。因 此，通过与现有的检测katG基因或inhA基因中的突变的方法组合，对于INH耐性菌中的约 90%，无需培养即可简便地鉴定为INH耐性菌，能够容易地诊断出不能用异烟胼进行治疗。 其结果，可以为这样的患者提供适当的治疗。因此，可以避免不必要的用药或检查，减轻患 者的负担，可以进一步削减不必要的医疗费。
权利要求
1.检测结核杆菌中的异烟胼敏感性的方法，该方法包括以下步骤获得检体中的结核杆菌的furA基因的步骤；以及对该获得的furA基因检测与异烟胼耐性有关的突变的步骤。
2.权利要求1所述的方法，其中，上述突变是指序列表的SEQIDNO :1记载的核苷酸序 列的41位的碱基C突变成T的突变、或其互补序列的突变。
3.试验片，该试验片用于检测结核杆菌中的异烟胼敏感性，该试验片上固定有至少1个探针，该至少1个探针由能够与具有结核杆菌的furA基因突变的核苷酸序列的区杂交的寡 核苷酸构成，或者由在具有该结核杆菌的furA基因突变的核苷酸序列的区中，虽然不能与 具有该突变的核苷酸序列的区杂交、但能够与该区所对应的野生型核苷酸序列构成的区杂 交的寡核苷酸构成。
4.权利要求3所述的试验片，其中，上述furA基因的突变是指序列表的SEQID NO=I 记载的核苷酸序列的41位的碱基C突变成T的突变、或其互补序列的突变。
5.权利要求4所述的试验片，其中，能够与上述野生型核苷酸序列的区杂交的寡核苷 酸由序列表的SEQ ID NO :3记载的核苷酸序列或其互补序列构成。
6.权利要求3 5中任一项所述的试验片，其中该试验片上进一步固定有探针，所述探 针由能够与具有结核杆菌的fabGl基因突变的核苷酸序列的区杂交的寡核苷酸构成，或者 由在具有该结核杆菌的fabGl基因突变的核苷酸序列的区中，虽然不能与具有该突变的核 苷酸序列的区杂交、但能够与由该fabGl基因的区所对应的野生型核苷酸序列构成的区杂 交的寡核苷酸构成。
7.权利要求6所述的试验片，其中，上述fabGl基因的突变是指序列表的SEQID NO 8记载的核苷酸序列的609位的碱基G突变成A或T的突变、或其互补序列的突变。
8.权利要求7所述的试验片，其中，能够与上述fabGl基因的野生型核苷酸序列的区杂 交的寡核苷酸由序列表的SEQ ID NO :10记载的核苷酸序列或其互补序列构成。
9.结核杆菌中的异烟胼敏感性的检测用试剂盒，该试剂盒包含权利要求3 8中任一 项所述的试验片。
10.检测结核杆菌中的异烟胼敏感性的方法，该方法包括以下步骤获得检体中的结核杆菌的furA基因的步骤；使该获得的furA基因与权利要求3 8中任一项所述的试验片接触，以使该furA基 因与固定在该试验片上的探针结合的步骤；以及使与该探针结合的furA基因显色的步骤。
11.权利要求10所述的方法，该方法进一步包括以下步骤获得上述检体中的结核杆菌的fabGl基因的步骤；使该获得的fabGl基因与权利要求6 8中任一项所述的试验片接触，以使该fabGl 基因与固定在该试验片上的探针结合的步骤；以及使与该探针结合的fabGl基因显色的步骤。
全文摘要
根据本发明，提供用于更准确地检测结核杆菌的异烟肼(INH)敏感性、即结核杆菌是否是INH耐性菌的新方法。本发明的检测结核杆菌中的异烟肼敏感性的方法包括以下步骤获得检体中的结核杆菌的furA基因的步骤、以及对该获得的furA基因检测与异烟肼耐性有关的突变的步骤。根据需要，本发明的方法还可以包括检测结核杆菌的fabG1基因突变的步骤，优选可以与其他公知的异烟肼敏感性检测方法组合。
文档编号G01N37/00GK102105596SQ20098012589
公开日2011年6月22日 申请日期2009年7月1日 优先权日2008年7月2日
发明者中村友彦, 切替照雄, 安藤弘树, 末竹寿纪 申请人:尼普洛株式会社, 独立行政法人国立国际医疗研究中心