专利名称：测定药物最低抑菌浓度的方法
技术领域：
本发明涉及一种测定抑菌浓度的方法，具体地说是一种基于荧光染料对药物最低抑菌浓度进行测定的方法。
背景技术：
常用的抗菌药物最低抑菌浓度(MIC)的测定方法包括肉汤稀释法、琼脂稀释法和E-test。以上几种方法均是根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，选择包含耐药、 中介和敏感分界点值的药物浓度范围(特殊情况例外)，利用细菌在含不同浓度药物的介质(肉汤或琼脂)中长时间培养后生长状态的不同，来判断抑制细菌生长的最低药物浓度。 一般培养时间均为20 Mh，获取结果的时间相对较长，对于急诊患者或危险期患者来说这个等待时间过长，容易延误病情。并且对于一些悬浮性较差的细菌，目测判读结果存在不可避免的人为因素造成的差异。肠球菌是人和动物肠道正常菌群的一部分，但在病理情况下可以引起严重的感染。肠球菌虽然种类繁多，但只有少数能够引起人类感染。随着耐药菌株的不断增长，肠球菌逐渐成为重要的医院致病菌。及时、有效、合理的抗生素应用是治疗肠球菌感染的关键。 本研究选用肠球菌标准株和临床分离株作为研究对象，考察临床常用的三种抗生素对其抑制作用。最低抑菌浓度是临床实验室确定细菌耐药和检测新药抗菌活性的重要指标。它不仅用来确定病人的用药剂量，也决定了用药方式，这对于减少耐药菌株的产生具有重要作用。通常，参照CLSI，BSAC或EUCAST等标准，MIC可以利用琼脂稀释法或肉汤稀释法进行测定。但是它们的统一弊病是测量时间较长，尤其是对于危重情况需要迅速给出相关药物信息时，传统方法略显不足。本研究采用两种优质的荧光染料，利用荧光法测定三种抗生素对肠球菌的最低抑菌浓度，成功将检测时间缩短至4h。现有肉汤稀释法利用肉眼目测判读培养20h后结果，以肉眼无混浊生长孔所对应的浓度作为药物最低抑菌浓度。而本发明中考察的肠球菌属细菌具有长时间培养易沉降的特性，目测法判读时，对于无混浊生长但孔板底部有菌体沉淀的临界孔的判读是造成实验室间结果差异的主要来源。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速、简便、对细菌毒害小、并可客观、定量、准确确定 MIC的检测方法。本发明的另一目的在于提出一种基于上述方法的肠球菌最低抑菌浓度的测定方法。为了实现上述目的，本发明采用如下具体技术方案一种测定药物最低抑菌浓度的方法，所述方法步骤如下(1)制备终浓度最佳为5X 106CFU/ml的菌悬液；实验过程中做过一系列浓度梯度，2. 5X106CFU/ml 5X106CFU/ml范围均可，选定该浓度是从荧光强度读数比较合理角度选择的。
(2)分别制备不同浓度梯度的药物工作液，浓度范围包括10对、512、256、1观、64、 32、16、8、4、2、1、0. 5、0. 25,0. 125yg/ml中的；本发明提供的药物工作液浓度是最全面的浓度，对于参照CLSI等相关标准已知大致MIC浓度范围的菌株，可以参照标准范围再分别向高浓度和低浓度方向各延展3个浓度梯度即可包括荧光强度比的折点，研究中选用多组梯度使得趋势更明显，更完整，图形更美观。另外，对于临床分离株中的耐药株，为了仍能给出明确的MIC浓度，我们选用的最高浓度很高，1024 μ g/ml为可选浓度；(3)将菌悬液分别加入到上述浓度梯度的药物工作液中，混勻，35°C，孵育4 他； 所述菌悬液与药物工作液体积比为1 1。其实菌悬液和工作液体积选为1 1计算比较方便，也可以为其他比例，在考虑到微孔的实际容积情况下，只要保证终浓度且不影响细菌的正常生长即可，不用严格要求比例范围。(4)向菌悬液与药物工作液混合液中加入染料SYTOX Green和DAPI的混合液，使两种染料终浓度分别为1.5μΜ和300nM。(实验中两种荧光染料选用了不同的浓度组合， 经检测虽然都可以得出相同的结果趋势，但此处所选终浓度为所认为的最佳工作浓度，可以使得所读取的两种染料的荧光强度值不至于相差过大，且可与荧光染料自身的本底影响很好区分。)室温避光作用15min ；(5)荧光酶标仪下，分别读取各孔SYTOX Green和DAPI两种染料的荧光强度值；(6)绘制荧光强度比与各药物浓度之间对应曲线图。所述步骤(1)中，菌悬液最佳终浓度为5X 106CFU/ml。所述两种染料的最佳激发波长和发射波长分别为DAPI 358/46Inm ；SYTOXGreen 504/535nmo所述步骤(6)绘制的荧光强度比与各药物浓度之间对应曲线图，在曲线图中最高点后的第一个拐点所对应的药物工作液浓度即为该药物对该菌的最低抑菌浓度。所述药物为氨苄西林、左氧氟沙星和万古霉素。所述菌为粪肠球菌ATCC 292120本发明的有益效果本发明所述MIC快速检测方法与现有技术肉汤稀释法进行比较，孵育时间由现有技术的20h 24h缩短为4h 他。发明人提出了经过绘制荧光强度比与各药物浓度之间对应曲线图，最高点后的第一个拐点所对应的药物工作液浓度即为该药物对该菌的最低抑菌浓度，本发明方法绘图后可以直接得出MIC值，且经过实验验证该拐点值为准确的MIC值。 本发明快速准确简便成本低廉，具有很好的应用前景和市场前景。本发明的可实施性和突出实质性特点以及积极效果可通过以下实例得以体现，但不限制其范围。
图1荧光法检测3种抗生素对ATCC 29212的MIC，孵育时间分别为4h和20h (万
古霉素Mh)。图2为ATCC 29212与一定浓度药物作用结束后加入两种荧光染料，同一视野不同荧光通道下的图片。A，DAPI通道下仅显示蓝色荧光；B，SYTOX Green通道下仅显示绿色荧光；C，为A和B的融合图片。
图3为荧光法检测死细菌百分数与荧光强度比(死细菌/活细菌)的对应关系 (校准曲线)。图4为所示为相对于肉汤稀释法，荧光法检测3种抗生素对90株临床分离肠球菌的MIC的准确性。曲线下面积分别为0. 85 (左氧氟沙星)，0. 765 (氨苄西林)和0. 832 (万
古霉素)O
具体实施例方式具体实施方式
中原料来源DAPI 染料Ivitrogen，Molecular Probes, D21490。SYTOX Green 染料Ivitrogen，Molecular Probes, S7020。万古霉素、左氧氟沙星、氨苄西林标准品均购自中国食品药品检定研究院粪肠球菌(ATCC 29212)购自ATCC，即美国标准生物品收藏中心。TECAN · infinite 200 荧光酶标仪实施例1所述快速荧光法检测氨苄西林、左氧氟沙星、万古霉素对粪肠球菌ATCC 29212 的 MIC 值(1)抗生素制备参照CLSI (2010版)提供的各抗生素针对肠球菌的MIC参考值， 设定药物浓度梯度为 1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2、1、0. 5,0. 25,0. 125μ g/ml。将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物分别加入到无菌96孔聚苯乙烯板中，每孔100μ 1，每个梯度做3个复孔。同时设置阴性对照孔(70%乙醇处理组)和不加药孔作为生长对照(阳性对照)。(2)菌悬液制备将0. 5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤(Muel Ier-Hinton Broth, 0X0ID)稀释10倍后，分别加入到含有不同浓度药物的各孔中，100 μ 1/孔，终浓度为 5X 106CFU/ml。密封后置35°C普通空气孵箱，孵育4h (万古霉素对于肠球菌的作用可适当延长至他后读取)。(3)孵育结束后向各孔加入100 μ 1 SYTOX Green染料和DAPI染料的混合液，两种染料的终浓度分别为1. 5 μ M和300ηΜ，室温避光反应15min。(4)将反应后的微孔板置于TECAN · infinite 200荧光酶标仪中，分别读取两种染料在相应激发光和发射光作用下的荧光强度值，分别记作FDAPI和FSYTOX Green0所述两种染料的激发波长和发射波长分别为DAPI 358/46Inm ；SYTOXGreen 504/535nmo(5)数据分析，扣除相应本底荧光后，绘制细菌荧光强度比(Pdead/live)与药物浓度(CDrug)的对应曲线，Pdead/live不再波动时所对应的最小药物浓度(CDrug)即为该抗生素对该细菌的 MIC。[注Pdead/live = FSYTOX Green/FDAPI]结果如图1所示，不同浓度药物与荧光强度比的对应关系。A，B，C图分别为4h和 20h/24h时，不同浓度的左氧氟沙星、氨苄西林、万古霉素对应的荧光强度比(Pdead/live =FSYTOX Green/FDAPI)。图中箭头所示为荧光法(4h和20h/Mh)所测MIC值。箭头所示为不同作用时间下某药物的最低抑菌浓度(图C两种情况测定的MIC相差1个浓度梯度， 说明万古霉素对肠球菌的作用需适当延长至他)可见左氧氟沙星对ATCC 29212的MIC值为1 μ g/ml，氨苄西林对ATCC 29212的MIC值为2 μ g/ml，万古霉素对ATCC 29212的MIC值为2 μ g/ml，实验验证见实施例3。CLSI 文件2010版中明确有该三种抗生素对ATCC29212标准株的MIC范围，由于所选标准株为敏感株，CLSI中标定的左氧氟沙星，氨苄西林和/或万古霉素对其MIC的范围分别为< 2 μ g/ ml，彡8 μ g/ml,彡4 μ g/ml。本发明采用荧光法所得的三种药物对标准株的MIC值均在可控范围内。实施例2(1)抗生素制备参照CLSI (2010版)提供的各抗生素针对肠球菌的MIC参考值， 设定药物浓度梯度为 512、256、U8、64、32、16、8、4、2、1、0. 5、0· 25,0. 125 μ g/ml。将倍比稀释后不同浓度的抗菌药物分别加入到无菌96孔聚苯乙烯板中，每孔100 μ 1，每个梯度做3 个复孔。同时设置阴性对照孔(70%乙醇处理组)和不加药孔作为生长对照(阳性对照)。( 菌悬液制备将0. 5麦氏比浊标准的菌悬液，经MH肉汤(Mue 11 er-Hinton Broth, 0X0ID)稀释10倍后，分别加入到含有不同浓度药物的各孔中，100 μ 1/孔，终浓度为 2. 5Χ 106CFU/ml。密封后置34. 5°C普通空气孵箱，孵育4h(万古霉素对于肠球菌的作用可适当延长至他后读取)。(3)孵育结束后向各孔加入50 μ 1 SYTOX Green染料和DAPI染料的混合液，两种染料的终浓度分别为1. 5 μ M和300ηΜ，室温避光反应15min。(4)将反应后的微孔板置于TECAN · infinite 200荧光酶标仪中，分别读取两种染料在相应激发光和发射光作用下的荧光强度值，分别记作FDAPI和FSYTOX Green0所述两种染料的激发波长和发射波长分别为DAPI 358/46Inm ；SYTOXGreen 504/535nmo(5)数据分析，扣除相应本底荧光后，绘制死细菌荧光强度比(Pdead/live)与药物浓度(CDrug)的对应曲线，Pdead/live不再波动时所对应的最小药物浓度(CDrug)即为该抗生素对该细菌的 MIC。[注Pdead/live = FSYTOX Green/FDAPI]结果与实施例1相同，左氧氟沙星对ATCC 29212的MIC值为1 μ g/ml，氨苄西林对 ATCC 29212的MIC值为2 μ g/ml，万古霉素对ATCC四212的MIC值为2 μ g/ml。实施例3将本发明方法应用于90株临床分离的肠球菌，并与平行进行的微量稀释法所得MIC结果进行比较，验证快速荧光法检测MIC的可行性。一、材料与方法1.菌株与抗生素1. 1菌株粪肠球菌标准株ATCC 29212 ；90株临床分离肠球菌，经鉴定90株均为肠球菌，其中75株为粪肠球菌和15株为屎肠球菌。1. 1抗生素左氧氟沙星、氨苄西林、万古霉素标准品均购自中国食品药品检定研究院。用无菌去离子水将3种药物标准品制成储液，分装，-70°C冻存。2.方法2. IMIC 的确定本研究平行采用微量肉汤稀释法(MIC/R)和荧光法(MIC/F)测定3种抗生素对肠球菌(标准株和90株临床分离株)的最低抑菌浓度。2. 1. 1微量肉汤稀释法测定MIC(参考方法，MIC/R)肉汤稀释法通常被视作体外检测某抗生素对微生物敏感性的基本实验室方法。一般认为与琼脂扩散法相比，肉汤体系更接近体内环境，并能直观地得出MIC而无需转换或回归计算。并且，该法可进一步用于最小杀菌浓度的测定。本研究选用微量肉汤稀释法作为标准的参考方法，参照CLSI标准并稍加修改进行。即将倍比稀释后的抗生素依次加入 96孔板，100 μ 1/孔。随后每孔分别加入100 μ 1新鲜培养的肠球菌悬液，终浓度为5 X IO6/ 孔。加样完成后，用锡箔纸将孔板密封，置35°C培养箱孵育20h(万古霉素与肠球菌作用时孵育时间延长至Mh)。终点判读选取黑色背景裸眼观察各孔细菌生长情况和透光度。将浊度消失的第一个孔对应的抗生素浓度作为相应的MIC。2. 1. 2本发明方法快速荧光法测定MIC(MIC/F)见实施例1。二、结果1.两种荧光染料具有完美的区分度1. 1荧光显微镜下观察两种荧光染料的区分度本发明选用两种核酸染料，二者穿透细胞膜的能力不同。SYTOX Green仅能穿透受损的细胞膜，而DAPI可以穿透所有细胞的细胞膜。当两种染料同时作用于细胞膜受损的细胞时，仅显示SYTOX Green的颜色。如图2所示，两种荧光染料可以将死细菌和活细菌很好地区分。ATCC 29212与一定浓度药物作用后加入两种荧光染料，同一视野不同荧光通道下的图片。A，DAPI通道下仅显示蓝色荧光；B，SYTOX Green通道下仅显示绿色荧光；C，为A 和B的融合图片。1. 2校准曲线进一步证明两种荧光染料适用于基于微孔板的MIC测定。为证明微孔板中两种荧光染料的荧光强度变化可以准确反映死细菌与活细菌的比例变化，我们将新鲜培养的细菌(活细菌)与经丙醇处理后的细菌(死细菌)以不同比例混合，制成不同比例的混悬液，具体如表1。分别测定不同比例各孔两种染料的荧光强度值，绘制荧光强度比(死细菌/活细菌)与死细菌所占比例的对应关系图(图3)。表1.死细菌与活细菌的不同配比关系
体积比(活细菌/死细菌)活细菌体积(ml)死细菌体积(ml )0:10003. 010:900.32. 750:501.51. 590:102.70. 3100:03.00图3以ATCC29212为例，荧光法检测死细菌百分数与荧光强度比(死细菌/活细菌)的对应关系。由图可见，随着死细菌含量的增高，其相应的荧光强度比也逐渐变大，二者呈正相关。图中各数据点为3次独立试验的平均值。2.荧光法检测三种抗生素对ATCC 29212的MIC2. 1实验体系的建立经过一系列的预实验，我们优化了整个实验体系，后续实验均按下述方案进行每个微孔的最适接种浓度为5X106CFU/ml。大量的前期试验表明，将药物与细菌共孵育的时
7间从4h延长至Mh，所得药物浓度与荧光强度比的对应曲线趋势完全一致(图1)。因此， 后续试验中，荧光法的孵育时间均为4h。同时，平行进行微量肉汤稀释法作为参考对照。图1荧光法检测3种抗生素对ATCC 29212的MIC，孵育时间分别为4h和20h (万古霉素Mh)。由图可见，两种孵育时间条件下，药物浓度与对应荧光强度比的变化曲线趋势完全一致。曲线中最高点后的第一个拐点所对应的抗生素浓度即为该药物对该菌的MIC，结果与参考方法相同。2. 2上述荧光强度比与抗生素浓度对应关系图的解释如图1，当抗生素浓度不足以抑制细菌生长时，随着药物浓度的增加，荧光强度比呈上升趋势，直至最高点。而一旦药物浓度足够大，则体系中的细菌生长可被有效抑制，并且药物浓度的再增加对其荧光强度比影响不大，表现为荧光强度比基本不变。这一现象与参考方法培养20h(万古霉素组需Mh)后有效抑菌后各孔均无混浊现象，肉眼观察无差别类似。本发明中，药物浓度与荧光强度比的对应关系图表现为一条上升的曲线，到达相应的最高点后陡然下降，之后为一段较平滑的曲线。平滑曲线上的第一个节点对应药物浓度即为MIC。需要指出的是荧光法检测万古霉素对肠球菌的MIC时，结果与24h后的测定结果偏差一个梯度，这可能与万古霉素作用需要适当延长孵育时间有关，比如《1。3.快速荧光法测定90株临床分离肠球菌的MIC。为了验证本发明快速荧光法检测抗生素对肠球菌MIC的有效性，随机选取90株临床分离的肠球菌(75株粪肠球菌和15株屎肠球菌)，采用荧光法(MIC/F)和微量肉汤稀释法(MIC/R)同时进行检测，结果见表2。两种方法检测左氧氟沙星、氨苄西林、万古霉素对 90株临床分离肠球菌的MIC结果具有较高的相关性，相关系数为0. 834 0. 953。并且通过与参考方法相比，荧光法与参考方法判读结果梯度差异的影响，梯度差异均不造成结果判读性质的差异。表2.荧光法、参考法检测三种抗生素对90株临床分离肠球菌MIC结果的比较
权利要求
1.一种测定药物最低抑菌浓度的方法，其特征在于，所述方法步骤如下(1)制备终浓度为2.5X106CFU/ml 5X 106CFU/ml的菌悬液；(2)分别制备不同浓度梯度的药物工作液，浓度范围包括512、256、1观、64、32、16、8、 4、2、1、0· 5,0. 25,0. 125μ g/ml 中的；(3)将菌悬液分别加入到上述浓度梯度的药物工作液中，混勻，35°C士0.5°C，孵育4 6h ；(4)向菌悬液与药物工作液混合液中加入染料SYTOXGreen和DAPI的混合液，终浓度分别为1. 5 μ M和300ηΜ,室温避光作用15min ；(5)荧光酶标仪下，分别读取各孔SYTOXGreen和DAPI两种染料的荧光强度值；(6)绘制荧光强度比与各药物浓度之间对应曲线图。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，菌悬液终浓度为 5X106CFU/ml。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述两种染料的激发波长和发射波长分别为DAPI 358/461nm ；SYTOX Green 504/5;35nm。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)绘制的荧光强度比与各药物浓度之间对应曲线图，在曲线图中最高点后的第一个拐点所对应的药物工作液浓度即为该药物对该菌的最低抑菌浓度。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤(6)中荧光强度比为SYTOX Green荧光强度值与DAPI荧光强度值比。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述药物为氨苄西林、左氧氟沙星和/或万古霉素。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述为菌粪肠球菌ATCa9212。
全文摘要
本发明公开一种能够快速、简便、定量检测最低抑菌浓度的方法，包括以下步骤按照CLSI标准(2010版)将一定浓度的新鲜肠球菌悬液，加入到含有浓度梯度抗菌药物的无菌96孔板中共孵育；4h孵育结束后，向各孔加入一定量的荧光染料SYTOX Green和DAPI，室温避光15min，利用荧光酶标仪分别读取各孔两种染料的荧光强度，记为FSYTOX Green和FDAPI；扣除相应本底荧光后，绘制细菌荧光强度比(Pdead/livel)与药物浓度(CDrug)的对应曲线，当Pdead/live不再波动时所对应的最低药物浓度(CDrug)即为该抗生素对该细菌的MIC。[Pdead/live＝FSYTOX Green/FDAPI]。本发明的检测方法具有简便、快速、客观，能对所测数据直接进行数学统计与分析等特点，为测定抗菌药物的最低抑菌浓度提供了新的检测方法，具有广阔的应用前景。
文档编号G01N21/64GK102288586SQ20111012709
公开日2011年12月21日 申请日期2011年5月17日 优先权日2011年5月17日
发明者孙伟, 苏建荣 申请人:首都医科大学附属北京友谊医院