专利名称：卵巢癌原发化疗敏感性测评试剂盒及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种用于测评卵巢癌化疗敏感性的试剂盒及其在原发化疗敏感/耐药测评、肿瘤患者甄别、及原发化疗药物耐受性评估中的应用。
背景技术：
上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer，EOC)是女性生殖器官常见的肿瘤之一，是女性肿瘤中的首要杀手。其中浆液性癌最为常见，在西方国家占所有卵巢癌的80 85%,分为晚期和早期，其中晚期占绝大多数，早期非常少见约占所有卵巢的< 5%。现在认为早、晚期浆液性癌是卵巢癌的两种不同类型，其形态学的差别实际上反映了肿瘤生物学差异，归根到底为基因水平的差异。该病早期不易诊断，晚期就诊时病人已错过了最佳治疗时机。由于卵巢癌晚期病人有不同程度的扩散，因此病人术后必须立刻进行化疗。目前国际上对卵巢癌术后病人的化疗方案主要分为首期辅助性(adjuvant ；以钼为基础的顺钼或卡钼/紫杉醇)和后期抢救性(salvage;多种化疗药物配伍)治疗。由于病人的基因调节不同，其分子表达水平也不同，故对原发化疗药物的敏感性各异，因而以钼为基础的首期辅助性化疗对40 50%病人的症状来说未有任何缓解，也称原发耐药，由于治疗没有针对性，耽搁了最佳化疗时期，是导致病人快速死亡的原因之一。因此，化疗前预测病人对原发化疗药物的敏感性，对延长卵巢癌患者的生命至关重要。另一方面，长期以来按照组织形态分类的方法将上皮性卵巢癌分为四个不同的病理类型，即浆液性，子宫内膜样，粘液性和透明细胞性，其中又以浆液性最为常见。但临床实践发现，仅仅按照传统组织形态分类标准对卵巢癌进行分类，对进一步研究其病理特征以及指导临床诊断和治疗多有不足，因此也迫切地需要一种方法对传统分类学项下的肿瘤进行进一步的甄别和分类。再者，如前所述，临床用于治疗卵巢癌的药物对相当一部分病人的症状未有任何缓解，但这需要经过相当长的一段临床时期才能被发现，往往会导致延误治疗机会，增加病人痛苦。因此，药物研究开发中也需要一种快速而有效的高通量筛选方法，来针对性地评估目标的原发化疗药物在临床治疗卵巢癌中的可能的耐受性风险。
发明内容
本申请的发明人研究中发现，ERCC2的蛋白表达量在敏感细胞中比耐药细胞高2 倍以上，结合此发现，发明人利用我国卵巢癌病人标本，采用简单易行的免疫组织化学方法，定性的确认了 ERCC2在卵巢癌化疗病人的生物标记物作用。基于上述研究结果，本发明的目的之一在于提供一种卵巢癌化疗敏感性测评试剂盒，所述的试剂盒包括由5%山羊血清、1 % BSA、0. 01 %聚乙二醇辛基苯基醚和pH7. 4的磷酸缓冲液组成的封闭液，由ERCC2抗体(1 1000)、生物素化二抗工作液和封闭液组成的抗原抗体反应系统，由辣根酶标记链霉卵白素工作液和DAB试剂缓冲液组成的抗生物素蛋白-氧化物酶反应系统，以及作为复染剂的苏木精。
优选的实施方案中，所述的试剂盒还包括由0. OlM柠檬酸盐缓冲液和磷酸缓冲液组成的抗原修复系统，以及由3%过氧化氢和磷酸缓冲液组成的消除内源性过氧化物酶系统。所述试剂盒可针对性地适用于石蜡包埋的卵巢癌组织样本。本发明的目的之二在于提供一种测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤使用封闭液处理待测样品后，分别使用ERCC2抗体和生物素化二抗工作液进行一抗和二抗反应，然后使用辣根酶标记链霉卵白素工作液处理样品，最后进行DAB显色和苏木精复染；根据样品染色情况判定对原发化疗药物的敏感性呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织；呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织。上述测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法更具体地包括如下步骤①封闭在待处理样品的组织上加200 μ 1封闭液，室温孵育60分钟；②抗原抗体反应(1) 一抗孵育在组织上加150 μ 1按照1 100比例稀释的ERCC2抗体，以封口膜覆盖组织，于4°C孵育过夜，然后以PBS清洗3次，每次10分钟；设阴性对照组，用同体积封闭液代替ERCC2抗体。(2) 二抗孵育在组织上加150 μ 1生物素化二抗工作液，室温孵育60分钟，PBS清洗3次，每次10分钟；③在组织上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室温孵育60分钟，PBS 清洗3次，每次10分钟；④DAB 显色(1)制备底物混合液在Iml ρΗ值=7. 0的双蒸水中，加入一滴试剂Α，混合均勻后，将试剂B和试剂C各一滴加入其中，混合均勻得底物混合液；(2)显色将150 μ 1底物混合液滴加在组织上，室温显色3 10分钟，充分显色后自来水冲洗终止反应；⑤染色、脱水、透明、封片将组织切片浸入苏木精染液2次，每次2秒；然后用蒸馏水处理3次，每次5分钟；再依次以50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各处理1次，每次1分钟；再以无水乙醇处理2次，每次2分钟，二甲苯与无水乙醇1 1混合物处理1次，2分钟， 100%二甲苯处理2次，每次2分钟；最后用树胶封片，保存；⑥根据样品染色情况判定对原发化疗药物的敏感性呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织；呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织。上述本发明的测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法理论上适用于任何类型的离体肿瘤组织或细胞样本，包括新鲜采集的卵巢癌组织、福尔马林固定石蜡包埋卵巢癌组织、OCT包埋的冷冻卵巢癌组织，液氮保存的新鲜无固定卵巢癌组织等。无论应用于哪种类型的生物样本，本领域的技术人员可以根据现有技术信息确定样品的前处理方法，已使处理后的样品适用于本发明所述及的免疫组化检测。几种典型的样本及其处理方法分别是(1)所述测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法应用于卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织的测评时，对样品的预处理包括如下步骤a.脱蜡卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织常规切片，厚度4 5 μ m的石蜡组织切片依次经过100%二甲苯脱蜡3次，每次5分钟；无水乙醇脱蜡3次，每次2分钟；95%乙醇、90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇各脱蜡1次，2分钟；b.抗原修复以0. OlM柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，然后以PBS清洗3次，每次 5分钟；c.消除内源性过氧化物酶将组织切片置于3%过氧化氢中，室温孵育30分钟，用 PBS清洗3次，每次5分钟。处理所得样品直接用于检测。(2)所述测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法应用于OCT包埋的冷冻保存的卵巢癌组织的测评时，对样品的预处理包括如下步骤a.组织固定将卵巢癌病人手术时切除的新鲜肿瘤组织约&2側3立即置入4%多聚甲醛中，4°C，固定M小时；b. PBS清洗3次，每次10分钟；c.将组织浸入30%蔗糖，4°C过夜；d. OCT 混合物(opti-mum cutting temperature compound)包埋,放置在干冰上；e.待OCT混合物凝固后，恒冷箱冰冻切片7 IOum ；所述测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法应用于液氮保存的新鲜无固定卵巢癌组织时，对样品的预处理包括如下步骤a.将卵巢癌病人手术切除的新鲜肿瘤组织迅速置入液氮中，待用；b.用时首先将组织浸入4%多聚甲醛中，4°C，固定M小时；根据用户所具有的实验室设备，可行上述两种方法中的任何一种即石蜡包埋或 OCT包埋过程后，处理所得样品直接用于检测。本发明的另一方面的目的是提供一种筛选对原发化疗药物敏感的卵巢癌患者的方法，该方法也需要使用上述本发明所述的卵巢癌化疗敏感性测评试剂盒，包括如下步骤 以卵巢癌患者离体肿瘤组织为检测样品，使用封闭液处理待测样品后，分别使用ERCC2抗体和生物素化二抗工作液进行一抗和二抗反应，然后使用辣根酶标记链霉卵白素工作液处理样品，最后进行DAB显色和苏木精复染；根据样品染色情况判定样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物敏感性呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织，样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物敏感；呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织，样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物耐受。本发明再一方面的目的是提供一种用于指导卵巢癌术后病人首期化疗用药的方法，包括临床采集患者卵巢癌组织、进行免疫组化检测及判断、根据判断结果确定用药方案等步骤，具体地为I.样品采集II.样品免疫组化检测及结果判断①封闭在待处理样品的组织上加200 μ 1封闭液，室温孵育60分钟；②抗原抗体反应(1) 一抗孵育在组织上加150 μ 1按照1 100比例稀释的ERCC2抗体，以封口膜覆盖组织，于4°C孵育过夜，然后以PBS清洗3次，每次10分钟；设阴性对照组，用同体积封闭液代替ERCC2抗体。(2) 二抗孵育在组织上加150 μ 1生物素化二抗工作液，室温孵育60分钟，PBS清洗3次，每次10分钟；③在组织上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室温孵育60分钟，PBS 清洗3次，每次10分钟；④DAB 显色(1)制备底物混合液在Iml ρΗ值=7. 0的双蒸水中，加入一滴试剂Α，混合均勻后，将试剂B和试剂C各一滴加入其中，混合均勻得底物混合液；(2)显色将150 μ 1底物混合液滴加在组织上，室温显色3 10分钟，充分显色后自来水冲洗终止反应；⑤染色、脱水、透明、封片将组织切片浸入苏木精染液2次，每次2秒；然后用蒸馏水处理3次，每次5分钟；再依次以50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各处理1次，每次1分钟；再以无水乙醇处理2次，每次2分钟，二甲苯与无水乙醇1 1混合物处理1次，2分钟， 100%二甲苯处理2次，每次2分钟；最后用树胶封片，保存；⑥根据样品染色情况判定对原发化疗药物的敏感性呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织；呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织。III.结果分析及用药指导方案的确定根据步骤II的检测结果，可以初步判定阳性反应的卵巢癌组织的来源患者对术后原发化疗药物治疗敏感几率高；阴性反应的卵巢癌组织的来源患者对术后原发化疗药物治疗耐受几率高。对于后者，需要根据患者生理病理特性及其临床症状表现来确定合适的术后化疗方案。本发明的上述所有方法中所述及的原发化疗药物是指用于卵巢癌术后病人在实施化疗的首期化疗药物，临床实践中这类药物包括钼类、紫杉醇或二者的组合。本发明的上述技术方案中所述及的卵巢癌或肿瘤是指浆液性卵巢癌晚期。本申请的发明人发现了肿瘤细胞、尤其是浆液性卵巢癌细胞/组织中ERCC2的表达量与细胞、组织或作为宿主的肿瘤患者对原发化疗药物敏感性之间的关联性。尽管现有技术中已有关于ERCC2免疫组化检测方法的记载，但上述的二者之间的确定关系是现有技术中所不曾公开的、也未曾有过任何技术启示。基于此发现，本申请提供一系列用于判断原发化疗药物耐受性的方法，以及相关的试剂组合。这些方法可以应用于多种样本，冰冻组织、石蜡包埋组织、新鲜离体组织等，可提供多层次的检测信息，可为卵巢癌的研究提供支持，也为临床诊断和指导用药提供可依赖的检测指标。本发明所述的方法简单准确，对样品的要求不高，可用于大规模筛查或追溯性研究。用于临床诊断和用药指导时，采集手术后病人的离体癌症组织进行检测，无创、无痛、无侵入性的检测，病人极易接受。并且结果直观易见、快速灵敏，经济实用。合理地应用于临床用药的选择还有助于延长病人的生命，缓解病人的化疗痛苦，改善病人术后生活质量。
本发明附图4幅图1本发明实施例1待检测组织染色结果示例，其中a，e = 100X ;b，f = 200X ； c, g = 400X ；d, h = 1000X ；是ERCC2在晚期浆液性卵巢癌术后耐药与敏感的首期化疗病人的表达情况图化疗敏感病人的癌组织上皮呈现黄褐色阳性反应(箭头所示)；化疗耐药病人的癌组织上皮呈现兰色阴性反应(箭头所示)。CR =化疗敏感病人；IR =化疗耐药病人；放大倍数a，e =100X ；b, f = 200X ；C, g = 400X ；d, h = 1000X ；图2和图3是实施例2中卵巢癌敏感细胞0V2008与卵巢癌耐药细胞C13中ERCC2 的蛋白表达量的凝胶电泳图及统计分析结果。图4是实施例2中卵巢癌敏感细胞0V2008与卵巢癌耐药细胞C13的免疫荧光检测(b，e)和免疫组化反应(c，f)检测结果图。
具体实施例方式如无特殊说明，本发明中所述的溶剂配制方法为0. 0IM柠檬酸盐缓冲液将0. 885g柠檬酸盐溶入300ml蒸馏水中，加94. 5 μ 1 冰醋酸调PH值至6.0;其中，柠檬酸盐购自天津市科密欧化学试剂有限公司，产品批号 20070621 ；磷酸缓冲液(PBS)将8g氯化钠，0. 2g氯化钾，3. 62g磷酸氢二钠(12H20)及0. 24g 磷酸二氢钾溶入800ml蒸馏水中，稀盐酸调pH值至7. 4，定容IL ；封闭缓冲液5%山羊血清，牛血清蛋白，pH 7. 4磷酸缓冲液，0.01%聚乙二醇辛基苯基醚(tirtonX-100)；5%山羊血清购自美国ZYMED公司，1091950 ；BSA 购自美国 R0CHE，10735078001 ；0. 01%聚乙二醇辛基苯基醚(tirtonX-100)购自美国R0CHE，0694 ；ERCC2 一抗购自美国 Protein Tech Group, Inc.，10818-AP ；生物素化二抗工作液、辣根酶标记链霉卵白素工作液、试剂A(浓缩缓冲液20x)、 试剂B (浓缩DAB缓冲液20x)和试剂C (浓缩过氧化氢缓冲液20x)均来源于免疫组化试剂盒，购自美国ZYMED公司，SP-9000 ；聚乙二醇辛基苯基醚(Triton-X100)购自 Amersco，Cat#0694 ；牛血清蛋白(BSA)购自Roche, Cat#10735078001 ；其它药品或试剂均为分析纯级。下述非限制性实施例可以使本领域的普通技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。实施例1I.标本采集采集71例由大连市妇产医院病理科保存的浆液性卵巢癌组织石蜡样本，这些样本源自在该医院进行根治性切除手术浆液性卵巢癌病人，样本保存前经临床常规组织处理即10%福尔马林固定，石蜡包埋，室温保存。II.样本预处理，包括如下步骤
a.脱蜡卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织常规切片，厚度4 5 μ m的石蜡组织切片依次经过100%二甲苯脱蜡3次，每次5分钟；无水乙醇脱蜡3次，每次2分钟；95%乙醇、90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇各脱蜡1次，2分钟；b.抗原修复以0. OlM柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，然后以PBS清洗3次，每次 5分钟；c.消除内源性过氧化物酶将组织切片置于3%过氧化氢中，室温孵育30分钟，用 PBS清洗3次，每次5分钟。III.免疫组化检测①封闭在待处理样品的组织上加200 μ 1封闭液，室温孵育60分钟；②抗原抗体反应(1) 一抗孵育在组织上加150 μ 1按照1 100比例稀释的ERCC2抗体，以封口膜覆盖组织，于4°C孵育过夜，然后以PBS清洗3次，每次10分钟；设阴性对照组，用同体积封闭液代替ERCC2抗体。(2) 二抗孵育在组织上加150 μ 1生物素化二抗工作液，室温孵育60分钟，PBS清洗3次，每次10分钟；③在组织上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室温孵育60分钟，PBS 清洗3次，每次10分钟；④DAB 显色(1)制备底物混合液在Iml ρΗ值=7. 0的双蒸水中，加入一滴试剂Α，混合均勻后，将试剂B和试剂C各一滴加入其中，混合均勻得底物混合液；(2)显色将150 μ 1底物混合液滴加在组织上，室温显色3 10分钟，充分显色后自来水冲洗终止反应；⑤染色、脱水、透明、封片将组织切片浸入苏木精染液2次，每次2秒；然后用蒸馏水处理3次，每次5分钟；再依次以50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各处理1次，每次1分钟；再以无水乙醇处理2次，每次2分钟，二甲苯与无水乙醇1 1混合物处理1次，2分钟， 100%二甲苯处理2次，每次2分钟；最后用树胶封片，保存；IV.根据样品染色情况判定对原发化疗药物的敏感性呈褐色阳性反应(即IHC 染色阳性)的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织，呈兰色阴性反应(即IHC染色阴性)的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织。附图Ia d是具有典型阳性反应的组织染色结果照片，可见组织上皮呈现明显黄褐色；附图Ie h是具有典型阴性反应的组织染色结果照片，可见组织上皮呈现明显蓝色。将根据常规临床诊治指标所得判断结果与IHC染色结果对照，统计分析本发明方法的有效性，如V。V.检测结果及分析根据卵巢癌病人化疗预后的常规临床诊治指标，71例病人样品中，44例样品判定为原发化疗药物敏感型，27例判定为对原发化疗药物耐受型。判定具体方法如下对上述71例样品来源的肿瘤患者进行信息统计，根据患者术后6个月时血清 CA125的检测水平，结合化疗随访的情况，比如是否6个月内还有新的肿物出现，肿物直径大小，是否存在持续性腹胀、腹痛、食欲不振、消瘦、乏力等显示病程仍在进展的临床症状，将病人分为两类①化疗敏感型所有可预测和评估的疾病症状消失，或者病人化疗6个月内CA125 检测水平低于< 30U/ml)，新的肿物小于3cm3。②化疗耐药型6个月化疗后，CA125检测仍然高于30U/ml，并且伴有显示病程仍在进展的临床症状，新的肿物大于3cm3。上述常规临床指标判断为化疗敏感型的44例样品中，34例(占检测标本的 73.3%)样品判定为IHC染色阳性(对原发化疗药物敏感)，11例(占检测标本的沈· 7% ) 显示IHC染色阴性。上述常规临床指标判断为化疗耐受型的27例样品中，19例(占检测标本的 70.4% )样品判定为IHC染色阴性(对原发化疗药物耐受)，8例(占检测标本的四.6% ) 显示IHC染色阳性。经过统计分析表明，IHC染色判断的结果与对照方法判断结果无显著性差异，说明以本发明的方法，即上述的IHC染色方法可以对卵巢癌肿瘤患者进行准确的原发化疗药物耐药/敏感的分型。实施例2利用美国NCI (National Cancer hstitute)公认的卵巢癌病人原发化疗敏感细胞(0V2008)禾口耐药细胞(C13) (Yamamoto K，等=Heat shock protein 27wasup-regulated in cisplatin resistant human ovarian tumor cell line and associated with the cisplatin resistance. Cancer Lett. 2001,168 :173-181 ；Xu G,等Nodal Induces Apoptosis and Inhibits Proliferation in Human Epithelial Ovarian Cancer Cells via Activin Receptor-Like Kinase 7. The Journal of Clinical Endocrinology & Metabolism 2004. 89(11) :5523-5534)，采用免疫荧光检测(immunofluorescence IF)，免疫组织化学反应(IHC)以及 Western Blotting 改良法(Lee B 等· Perlecan domain V is neuroprotective and proangiogenic following ischemic stroke in rodents. J Clin Invest. 2011Jul 11. pii :46358. doi :10. 1172/JCI46358)，验证了 ERCC2 在卵巢癌病人原发化疗敏感细胞(0V2008)和耐药细胞(CU)中的不同表达，和ERCC2蛋白含量在敏感细胞中比耐药细胞高2. 49倍。获得了 ERCC2在化疗敏感和耐药病人切片中完全一致的结果。I.标本采集采集国际妇科肿瘤界认可的卵巢癌原发化疗敏感细胞0V2008和卵巢癌原发化疗耐药细胞C13。0V2008细胞源于上皮浆液性卵巢癌病人(Andrews et al,Cancer Res 1985， 45(12 Pt 1) :6250-6253 ；Andrews et al =Cancer Chemother Pharmacol 1987,19(2) 149-154)，而0V2008/C13化疗敏感和耐药细胞源自0V2008细胞上百次的IuM顺钼的体外多个月的培养和筛选(Andrews et al,Cancer Res 1985，45(12Pt 1) :6250-6253)，这些细胞获赠于加拿大Chun Peng博士(York University, Toronto Canada)，细胞保存前常规体外细胞处理即细胞培养，蛋白提纯，_20°C保存。II.样本预处理，包括如下步骤①细胞培养(1)取前一天换液的一瓶细胞，用0. 25的胰酶消化，镜下观察细胞变圆后，加入含 10%胎牛血清的1640培养基Iml终止胰酶的作用，并用毛细滴管吹打，将细胞制成悬液；
(2)取少量细胞用0. 4 %的胎盘蓝计数，然后将细胞悬液稀释成2 X IO4个细胞/ ml ；(3)将稀释好的细胞悬液接种于6孔板中，每孔2ml ；(4)置入37°C 5% C02孵箱中培养48小时。②蛋白提纯(1)细胞数量6孔细胞培养板，每组二个平行孔细胞提取蛋白；(2)细胞裂解以 50mM Tris-HCL PH6. 8，2% SDS，10%甘油，ImM PMSF(现用现加) 裂解液，每孔加40 μ 1裂解液冰上充分裂解10 30min ；(3) 14000rpm 离心 IOmin 吸上清；(4) BCA试剂盒测定蛋白浓度，并以30ug分装于Ep管中，-70 V保存。III. Western Blot 检测①SDS-PAGE电泳5%浓缩胶100V，10%分离胶120V电泳；②采用NC膜，BIO-RAD转膜仪湿转200 250mA 45min ；③5 %奶粉室温封闭1小时；④抗体孵育一抗(ERCC21 500，β -actin 1 1000) 4°C过夜；预冷 PBST (含 0. 5%o tween-20)洗 IOminX3 ；二抗 1 5000 室温 Ih ；预冷 PBST(含 0. 5%。tween-20)洗 IOminX3 ；⑤ECL化学发光发光试剂A、B液等量(0. 125ml/cm2膜)混合，加在膜上室温孵育 5min，5min后吸去多余液体，用保鲜膜包好，放入X光暗盒中曝光(曝光时间根据显影后条带强弱而定)，显影液中显出明显条带后，自来水清洗，定影液定影2 ;3min，自来水冲洗， 室温晾干胶片。⑥凝胶图象分析将胶片进行数码拍照，经Lab works 4. 6软件进行分析处理，以内参基因β-actin为基准分析各条带的相对密度值。其结果如附图2. A和图2. B所示从图2. A可以看出对照标志蛋白β-actin在两组细胞中的成像灰度相似，但卵巢癌敏感细胞0V2008比卵巢癌耐药细胞C13的成像灰度强，厚度宽，表明ERCC2的蛋白含量在卵巢癌敏感细胞中高于耐药细胞。应用Excel和SPSS 10. 0软件进行作图及统计分析，图2. B显示分析结果证明 ERCC2的蛋白含量在卵巢癌敏感细胞(0V2008)中高于卵巢癌耐药细胞(Cl!3)2.49倍。IV.免疫荧光检测①溶剂与配制方法I 抗:ERCC2(ProteinTech, Catalog No :101818-1_AP)荧光II抗FITC标记山羊抗兔IgG(中杉金桥，Catalog No :ZF_0311)OLYMPUS倒置相差荧光显微镜(日本，OLYMPUS 1X71)②免疫荧光反应(1)将0V2008和C13细胞用0.25%胰酶消化，稀释成2X104个/ml接种于六孔板，每孔2ml细胞悬液；(2)待细胞M小时贴壁后，用4% PFA(多聚甲醛)固定10分钟；⑶PBS 洗 5minX3;(4)封闭液(含10%羊血清、30%血清白蛋白)封闭Ih ；
(5)封闭液配制的 I 抗(ERCC21 150 ；ProteinTech, Catalog No 101818-1-AP) 4 度孵育过夜；(6)PBS 洗 5minX3 ；(7)FITC 标记 II 抗[1 50 ;FITC 标记山羊抗兔 IgG (中杉金桥，Catalog No: ZF-0311)]避光孵育Ih ；(8)PBS 洗 5minX3 ；(9)OLYMPUS倒置相差荧光显微镜(日本，OLYMPUS 1X71)观察、摄片。V.免疫组织化学检测①溶剂与配制方法本方法所述的溶剂配制方法与实施例1所述溶剂及其配制方法完全相同。②免疫组织化学反应(1)将0V2008和C13细胞用0.25%胰酶消化，稀释成2X104个/ml接种于六孔板，每孔2ml细胞悬液；(2)待细胞M小时贴壁后，用4% PFA(多聚甲醛)固定10分钟；⑶PBS 洗 5minX3;(4)封闭液(含10%羊血清、30%血清白蛋白)封闭Ih ；(5)抗原抗体反应i. 一抗孵育在培养的细胞上加150 μ 1按照1 100比例稀释的ERCC2抗体，于 4°C孵育过夜，然后以PBS清洗3次，每次10分钟； 二抗孵育在培养的细胞上加150 μ 1生物素化二抗工作液，室温孵育60分钟， PBS清洗3次，每次10分钟；(6)在细胞上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室温孵育60分钟， PBS清洗3次，每次10分钟；(7) DAB 显色i.制备底物混合液在Iml pH值=7. 0的双蒸水中，加入一滴试剂A，混合均勻后，将试剂B和试剂C各一滴加入其中，混合均勻得底物混合液； 显色将150 μ 1底物混合液滴加在细胞上，室温显色3 10分钟，充分显色后自来水冲洗终止反应；(8)染色、脱水、透明、封片将组织切片浸入苏木精染液2次，每次2秒；然后用蒸馏水处理3次，每次5分钟；再依次以50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各处理1次，每次1分钟；再以无水乙醇处理2次，每次2分钟，二甲苯与无水乙醇1 1混合物处理1次，2分钟， 100%二甲苯处理2次，每次2分钟；最后用树胶封片，保存；(9) OLYMPUS倒置相差荧光显微镜观察、摄片；(10)免疫荧光与免疫组织化学检测结果(如附图4所示)图4-a，d是未经任何染色的卵巢癌培养细胞；图4-b，e是经免疫组织化学荧光染色的卵巢癌培养细胞，显示ERCC2在原发化疗敏感细胞(0V2008)的表达明显增强，呈强绿色，而在原发化疗耐药细胞(C13)的表达很弱，呈暗绿色。图4-c，f是经免疫组织化学染色的卵巢癌培养细胞，显示ERCC2在原发化疗敏感细胞(0V2008)的表达呈深褐色，明显强于在原发化疗耐药细胞(C13)的表达，呈浅褐色。此结果与ERCC2在化疗敏感和耐药病人切片中所获结果完全一致。
权利要求
1.卵巢癌原发化疗敏感性测评试剂盒，其特征在于该试剂盒包括由5%山羊血清、 1% BSA、0. 01%聚乙二醇辛基苯基醚和pH7. 4的磷酸缓冲液组成的封闭液，由ERCC2抗体、 生物素化二抗工作液和封闭液组成的抗原抗体反应系统，由辣根酶标记链霉卵白素工作液和DAB试剂缓冲液组成的抗生物素蛋白-氧化物酶反应系统，以及作为复染剂的苏木精。
2.权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括由0.OlM柠檬酸盐缓冲液和磷酸缓冲液组成的抗原修复系统，以及由3%过氧化氢和磷酸缓冲液组成的消除内源性过氧化物酶系统。
3.测评卵巢癌组织样品对原发化疗药物敏感性的方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤使用封闭液处理待测样品后，分别使用ERCC2抗体和生物素化二抗工作液进行一抗和二抗反应，然后使用辣根酶标记链霉卵白素工作液处理样品，最后进行DAB显色和苏木精复染；根据样品染色情况判定对化疗药物的敏感性呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织；呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组幺口 /Ν ο
4.权利要求3所述的方法，包括如下步骤①封闭在待处理样品的组织上加200μ 1封闭液，室温孵育60分钟；②抗原抗体反应(1)一抗孵育在组织上加150μ 1按照1 100比例稀释的ERCC2抗体，以封口膜覆盖组织，于4°C孵育过夜，然后以PBS清洗3次，每次10分钟；设阴性对照组，用同体积封闭液代替ERCC2抗体；(2)二抗孵育在组织上加150 μ 1生物素化二抗工作液，室温孵育60分钟，PBS清洗3 次，每次10分钟；③在组织上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室温孵育60分钟，PBS清洗 3次，每次10分钟；④DAB显色(1)制备底物混合液在ImlρΗ值=7. 0的双蒸水中，加入一滴试剂Α，混合均勻后，将试剂B和试剂C各一滴加入其中，混合均勻得底物混合液；(2)显色将150μ 1底物混合液滴加在组织上，室温显色3 10分钟，充分显色后自来水冲洗终止反应；⑤染色、脱水、透明、封片将组织切片浸入苏木精染液2次，每次2秒；然后用蒸馏水处理3次，每次5分钟；再依次以50%乙醇、70%乙醇、90%乙醇各处理1次，每次1分钟；再以无水乙醇处理2次，每次2分钟，二甲苯与无水乙醇1 1混合物处理1次，2分钟，100% 二甲苯处理2次，每次2分钟；最后用树胶封片，保存；⑥根据样品染色情况判定对化疗药物的敏感性呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织；呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织。
5.权利要求3所述的方法，其特征在于所述方法应用于卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织的测评时，还包括对样品的预处理步骤a.脱蜡卵巢癌福尔马林固定石蜡包埋组织常规切片，厚度4 5μπι的石蜡组织切片依次经过100%二甲苯脱蜡3次，每次5分钟；无水乙醇脱蜡3次，每次2分钟；95%乙醇、 90%乙醇、70%乙醇、50%乙醇各脱蜡1次，2分钟；b.抗原修复以0.OlM柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，然后以PBS清洗3次，每次5分钟；c.消除内源性过氧化物酶将组织切片置于3%过氧化氢中，室温孵育30分钟，用PBS 清洗3次，每次5分钟。
6.筛选对原发化疗药物敏感的卵巢癌患者的方法，其特征在于使用权利要求1所述的试剂盒，包括如下步骤以卵巢癌患者离体肿瘤组织为检测样品，使用封闭液处理待测样品后，分别使用ERCC2抗体和生物素化二抗工作液进行一抗和二抗反应，然后使用辣根酶标记链霉卵白素工作液处理样品，最后进行DAB显色和苏木精复染；根据样品染色情况判定样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物敏感性呈褐色阳性反应的样品判定为对原发化疗药物敏感的卵巢癌组织，样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物敏感；呈兰色阴性反应的样品判定为对原发化疗药物耐受的卵巢癌组织，样品来源的卵巢癌患者对原发化疗药物耐受。
7.权利要求3 6中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述的原发化疗药物是顺钼、紫杉醇或二者的组合。
8.权利要求3 6中任一权利要求所述的方法，其特征在于所述的卵巢癌是浆液性卵巢癌。
全文摘要
一种卵巢癌原发化疗敏感性测评试剂盒及其应用，所述试剂盒包括封闭液、抗原抗体反应系统、抗生物素蛋白-氧化物酶反应系统以及复染剂。本申请的发明是基于浆液性卵巢癌细胞/组织中ERCC2的表达量与细胞、组织或作为宿主的肿瘤患者对原发化疗药物敏感性之间的关联性。可通过ERCC2检测实现化疗敏感/耐药测评、肿瘤患者甄别、及原发化疗药物耐受性评估等多种用途。本发明所述的方法简单准确，对样品的要求不高，可用于大规模筛查或追溯性研究。用于临床诊断和用药指导时，采集手术后病人的离体癌症组织进行检测，无创、无痛、无侵入性的检测，病人极易接受、有助于延长病人的生命，缓解病人的化疗痛苦，改善病人术后生活质量。
文档编号G01N33/574GK102435734SQ20111026604
公开日2012年5月2日 申请日期2011年9月8日 优先权日2011年9月8日
发明者丁艳芳, 姜继勇, 崔世英, 杨亮, 毕丽华, 赵瑾瑶 申请人:大连医科大学