专利名称：20(s)－原人参二醇在制备抗肠癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医药领域，具体地说，涉及20(S)-原人参二醇在制备抗肠癌药物中的应用。
背景技术：
原人参二醇是二醇组人参皂甙的甙元，分为20(S)-原人参二醇和20-(R)原人参二醇，它们互为对映异构体，其结构如下 20-(S)原人参二醇 20-(R)原人参二醇肠癌是对化疗敏感性差的肿瘤，目前5-氟尿嘧啶、环磷酰胺是最为常用的药物，但是其有效率＜20％，有效时限短，对有效病例中延长生命时间仅半年左右，也不能提高术后5年生存率，且化疗的毒副反应大，仅作为晚期病例的安慰疗法。因此，人们一直未停止对具有更好疗效的抗肠癌药物的寻找。中国专利CN 1418633A公开了20-(S)原人参二醇在制备治疗抗人体肺癌、肝癌药物中的应用。《药理实验方法学》.北京人民卫生出版社，2002公开了5-氟尿嘧啶的半数致死量(LD50)为185mg/kg，而20(S)-原人参二醇的半数致死量(LD50)为540mg/kg，20(S)-原人参二醇的毒性要比5-氟尿嘧啶小的多。此外，市场价格上5-氟尿嘧啶、环磷酰胺也远高于20(S)-原人参二醇。因此，研究20-(S)原人参二醇可以作为一种新型抗癌药物治疗人体肠癌，特别是作为辅助药物治疗人体肠癌成为一件很有意义的工作。
人参作为名贵的滋补药物，有必要对其抗肿瘤活性进行更深入的研究，以便对其更好更正确的利用。
发明内容
(一)要解决的技术问题本发明的目的旨在提供20(S)-原人参二醇在制备抗人体肠癌药物中的应用。
(二)技术方案我们以含人参皂苷的人参属植物或叶的总皂甙提取物、绞股蓝属植物的绞股蓝提取物为原料，在有机溶剂中进行氧化碱解反应，经柱层析纯化，可以高收率的得到高纯度的原人参二醇，此方法已经申请了中国发明专利(专利号为2004100180388)。
20-(R)原人参二醇对抗人体肠癌有抑制肿瘤增长的作用。
主要的研究方法、结果如下1.受试药物1.1名称20(S)-原人参二醇1.2提供单位上海中药创新研究中心。
1.3批号0406021.4配制方法精密称量20-(S)原人参二醇原料加入少许吐温80湿润助溶，后逐渐加入0.5％羧甲基纤维素钠溶液(CMC-Na)，待充分混匀后，稀释至所需浓度即可。给药体积0.5ml/鼠。
2.实验材料2.1溶剂0.5％CMC-Na，生理盐水，培养液-RPMI1640+15％NBS(灭活小牛血清)+双抗。
2.2阳性对照品注射用环磷酰胺(CTX)，批号031204，上海华联制药集团出品；注射用丝裂霉素(MMC)，批号385BBE，协和发酵工业株氏会社出品；5-氟尿嘧啶(5-Fu)，批号040307，上海旭东海普制药厂；云芝糖肽，批号040615，上海新康制药厂；参一胶囊Rg3，吉林亚泰药业有限公司出品。每天一次，连续七天。
2.3瘤源人体肠癌LOVO模型；3.实验动物3.1来源C57BL/6及昆明种小鼠、裸小鼠及BALB/c+ICR的F1小鼠均由上海市中科院实验动物中心提供，合格证号SCXK2003-0003。
3.2体重裸小鼠为6周龄，BALB/c+ICR的F1小鼠、昆明种小鼠及C57BL/6小鼠为18～22克。
3.3性别雌雄皆可，每批实验使用同一种性别。
3.4动物数试验组及阳性对照组裸小鼠每组6只小鼠，其他小鼠每组10只，阴性对照各为两组。
4.剂量设置20-(S)原人参二醇设定高、中、低三个剂量，100mg/kg/d、50mg/kg/d及25mg/kg/d。
5.给药方案灌胃给药，每天1次，连续给药21天。
6.试验对照阴性对照组给以与试验组等体积的相应溶剂，给药方案同试验组。阳性对照CTX 30mg/kg，MMC 2mg/kg，腹腔或静脉给药每天一次，连续七天。同类参照样品Rg3 3mg/kg，ig×21qd。
7.试验主要方法7.1体内抗肿瘤试验取无菌条件下取生长旺盛的瘤源，以匀浆法制备成约1-2×107/ml细胞悬液；于相应宿主腋皮下接种0.2ml/鼠，次日按实验设计方案给药，对肿瘤及荷瘤动物体重生长进行动态测量[以卡尺测量肿瘤长径a、短径b，肿瘤体积＝a×b2]。抗肿瘤活性评价指标为相对肿瘤增长率T/C(％)。
T/C(％)＝(TRTV/CRTV)×100％抗肿瘤活性评价T/C(％)＞60为无效，≤60为有效。
注本实验样品属生物反应调节剂故开始给药的时间均为肿瘤接种后24小时，因此以实测的肿瘤体积均值直接进行计算。
7.2应激试验使用荷瘤鼠进行各种试验。
7.2.1荷瘤动物常压耐缺氧试验取C57BL/6小鼠，由尾静脉接种B16黑色素瘤培养细胞，24小时后，按实验方案给药。实验结束时，将各组小鼠分别置于放有5克钠石灰的125ml容量的广口瓶中，瓶口壁涂以凡士林使之密闭，记录各组各小鼠的存活时间，以各组小鼠存活时间均值与阴性对照组进行比较，得出常压耐缺氧的延长率。
耐缺氧生命延长率％＝(试验组平均存活时间-对照组平均存活时间)/对照组平均存活时间×100％并将上述荷瘤小鼠进行免疫器官(脾脏及胸腺)的测试。
7.2.2对荷瘤动物体重增长试验人体肿瘤模型试验中，均进行荷瘤鼠体重的动态观察。
7.3延长荷瘤宿主生存周期试验观察荷瘤动物的生存周期。
7.4免疫试验7.4.1对荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠的淋巴细胞增殖试验取C57BL/6小鼠，足趾皮下接种无菌制备的Lewis肺癌混悬液0.05ml/鼠(约1×106个肿瘤细胞)。次日随机分组，按实验设计方案给药，末次给药后次日在无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网制成单个脾细胞悬液，用含10％灭活小牛血清的RPMI 1640培养液调节细胞浓度为1×107个细胞/ml，加入96孔细胞培养板，每孔100ul(1×106个细胞/孔)，再加入含ConA(刀豆蛋白A)(5ug/ml)的培养液100ul，置37℃5％CO2条件培养72小时。轻轻吸弃上清液100ul，加入MTT[3-(4，5-二甲基-2-噻唑)-2，5-二苯基溴化四唑]溶液(MTT溶液为5mg/ml)20ul。放置37℃5％CO2条件培养2小时后加入消化液100ul，再放置至次日测各孔OD值并以公式计算刺激指数。
刺激指数＝实验组OD值/对照组OD值
7.4.2对荷Lewis肺癌C57BL/6小鼠的NK细胞活性试验取C57BL/6小鼠，趾皮下接种无菌制备的Lewis肺癌混悬液0.05ml/鼠(约1×106个肿瘤细胞)。次日随机分组，按实验设计给药，末次给药后次日在无菌条件下取小鼠脾脏，用100目筛网制成单个脾细胞悬液，低渗除去红细胞，将细胞悬液转入培养瓶中，37℃5％CO2条件培养1小时后去除贴壁细胞，计数活细胞并调整细胞浓度为3×106个细胞/ml作为效应细胞。靶细胞取L929体外培养细胞，常规培养24小时，以培养液调整细胞浓度为1.5×105个细胞/ml，使效靶细胞之比为20∶1。取96孔培养板分别加入效应细胞和靶细胞，另设效应细胞和靶细胞对照，于37℃5％CO2条件培养4小时后，加入MTT染色液，再培养2小时后加入消化液于次日测各孔OD值，按公式计算NK细胞(天然杀伤细胞)毒活性。
NK细胞毒活性％＝{[靶细胞对照组OD均值-(实验组OD均值-效应细胞OD均值)]/靶细胞对照组OD均值}×100％7.4.3对正常小鼠的腹腔巨噬细胞吞噬功能试验取雄性昆明种小鼠随机分组，按实验设计方案给药，末次给药后各组小鼠腹腔注射0.5％水解蛋白1.5ml/鼠，24小时后腹腔注射每毫升1×106的鸡红细胞悬液0.2ml/只；隔40分钟后用生理盐水洗脱、收集小鼠腹腔液；离心，取细胞沉淀液制成涂片，用甲醇固定，吉姆萨染色封片，用油镜计数100个巨噬细胞中吞噬鸡红血球的巨噬细胞数及吞噬鸡红血球的总数，按下列公式计算吞噬百分比和吞噬指数。
吞噬百分比％＝(100个巨噬细胞中吞噬鸡红血球的巨噬细胞数/100个巨噬细胞)×100％吞噬指数＝100个巨噬细胞中吞噬鸡红血球的总数/100个巨噬细胞。
8.试验结果8.1抗肿瘤效果对人肠癌LOVO皮下接种模型的疗效见表1、2、3、4。
表1.20(S)-原人参二醇对人体肠癌LOVO皮下接种模型的疗效
注肿瘤接种后25天的实验结果，对人体肠癌LOVO皮下接种实体瘤模型下同表2.20(S)-原人参二醇对人体肠癌LOVO皮下接种模型的疗效肿瘤动态变化结果
表3.20(S)-原人参二醇对人体肠癌LOVO皮下接种模型的疗效荷瘤鼠体重动态变化结果
表4 合并5-Fu和20(S)-原人参二醇对人体肠癌LOVO皮下接种模型的疗效
以上试验表明20-(S)原人参二醇对人体肿瘤异种移植于裸鼠模型灌胃给药均显示一定的祛邪作用，20(S)-原人参二醇与5-Fu合用后可降低5-Fu的用药量，提示20-(S)原人参二醇可以作为辅助药物治疗人体肠癌。。
8.2生命延长率试验见表5。
表5 20(S)-原人参二醇对人体肠癌LOVO皮下接种模型生命延长率结果
与对照组相比***P＜0.018.3抗应激试验表6 20(S)-原人参二醇对荷瘤小鼠耐缺氧试验
表4、表5的试验结果表明20-(S)原人参二醇具有改善荷瘤鼠的生存质量和延长荷瘤鼠的生命周期的特点，一定程度可提高荷瘤鼠的应激能力。本品临床适合于作为抗肿瘤辅助治疗剂(支持和维持用药)应用。
8.4扶正作用8.4.1对荷瘤动物免疫功能的影响对荷瘤鼠淋巴细胞转化试验见表7。
表7.20(S)-原人参二醇对荷Lewis肺癌小鼠淋巴细胞增殖活性影响
与对照组相比***P＜0.01 #试验组OD值/对照组OD值对荷瘤鼠NK活性试验见表8。
表8.20(S)-原人参二醇对荷Lewis肺癌小鼠天然杀伤细胞(NK)活力影响
注1.与阴性对照组相比***P＜0.01注2.#指(效应细胞+靶细胞)-效应细胞的OD值注3.MMC为化疗药对照对正常小鼠溶血素试验见表9。
表9.20(S)-原人参二醇对C57BL/6小鼠溶血素抗体生成的影响
#为540nm时透光值与阴性对照组相比***P＜0.01对正常小鼠腹腔巨噬细胞吞噬试验见表10。
表10.20(S)-原人参二醇对昆明小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能试验
对荷瘤小鼠免疫脏器的影响见表11。
表11.荷B16肺转移小鼠免疫脏器的变化(n＝10)
表12.20(S)-原人参二醇对荷Lewis肺癌小鼠TNF(肿瘤坏死因子)的影响
#为595nm时透光值测定的结果换算而得.n＝3，每个样本为3只小鼠合并的血清.与阴性对照组相比***P＜0.01以上试验结果表明20-(S)原人参二醇可促进和提高荷瘤小鼠或正常小鼠的若干细胞、体液免疫及巨噬细胞的吞噬功能，同时具有改善荷瘤鼠的生存质量和延长荷瘤鼠的生命周期的特点，提高荷瘤鼠的应激能力。对机体具有一定扶正作用。本品属于免疫型宿主中介的抗肿瘤药物。
具体实施例方式
以下通过具体实施例，可以进一步理解本发明，但不能限制本发明的内容。
实施例1三七18kg(规格无数头，购自云南)粉碎成粉末状(100-200目)，用30kg 95％乙醇浸泡两天，过滤，滤液浓缩得三七乙醇提取物，乙醇回收重复使用浸泡滤渣六次，最终累计得三七乙醇提取物3.37kg，将其溶于水中，用石油醚提取三次，取水相用正丁醇提取四次，正丁醇层浓缩，共得三七总皂苷正丁醇提取物1.78kg。
取总皂苷提取物100g溶于1300ml正丁醇中，加热，搅拌，加入乙醇钠(化学纯，纯度80％)132.6g(1.56mol，浓度1.2mol/L)，通氧，90℃反应65小时，反应结束。反应液冷至室温，用正丁醇饱和的水洗，正丁醇层浓缩后用水溶解，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层用水洗，干燥。浓缩后，经硅胶柱层析[1～5％甲醇/氯仿溶液梯度淋洗]纯化，得原人参二醇(A2)6g，HPLC测定纯度为97.93％；实施例2取三七总皂苷提取物100g(实施例1中制备的)溶于1500ml正戊醇中，加热，搅拌，加入正丁醇钠(化学纯，纯度80％)150g(1.56mol，浓度1.04mol/L)，通压缩空气，100℃反应60小时，反应结束。反应液冷至室温，用正丁醇饱和的水洗，正丁醇层浓缩后用水溶解，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层用水洗，干燥。浓缩后，经硅胶柱层析[环己烷∶乙酸乙酯＝10∶1-1∶1(V/V)梯度淋洗]纯化，得原人参二醇(A2)8g，HPLC测定纯度为97％；实施例3三七叶甙(含量以人参皂苷Rb3计，91.9％；购自云南)1000g溶于14L正丁醇中，加热，搅拌，加入乙醇钠(化学纯，纯度80％)1190g(14.0mol，浓度1.0mol/L)，通氧，110℃反应55小时，反应结束。反应液冷至室温，用正丁醇饱和的水洗，正丁醇层浓缩用水溶解，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯萃取相经水洗、干燥、蒸干。经硅胶柱层析[石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1-2∶1(V/V)梯度淋洗]纯化，得原人参二醇(A2)181.6g，HPLC测定纯度为99.3％。其物化数据相符于文献值J.Asakawa et al，Tetrahedron，1977，33，1935-1939；Nagai，M.et al，Chem.Pharm.Bull，1972，20(6)，1212-1216。
化合物(A2)测定的物化数据如下1H NMR(300MHz，CDCl3)δ5.13(t，1H)，3.6(m，1H)，3.2(s，1H)，2.15-1.72(m，12H)，1.64-1.22(m，14H)，1.01(d，8H)，0.92(s，6H)，0.81(s，6H)，0.78(s，3H)。
13C NMR(300MHz，CDCl3)131.4，125.2，78.8，74.0，70.8，56.0，53.6，51.6，50.2，47.7，39.8，39.0，39.0，37.1，34.8，34.8，31.2，31.1，28.1，27.4，26.8，26.6，25.8，22.4，18.3，17.8，16.9，16.2，15.7，15.5。
实施例4三七叶甙(含量以人参皂苷Rb3计大于85％；购自云南)1000g溶于10L正丁醇和4L异丁醇混合溶剂中，加热，搅拌，加入乙醇钠(化学纯，纯度80％)1230g(14.5mol，浓度1.04mol/L)，通压缩空气，90℃反应88小时，反应结束。反应液冷至室温，用正丁醇饱和的水洗，正丁醇层浓缩后用水溶解，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯萃取相经水洗、干燥、蒸干。经硅胶柱层析[石油醚∶乙酸乙酯＝8∶1-2∶1(V/V)梯度淋洗]纯化，得原人参二醇(A2)157.0g，HPLC测定纯度为97.9％。其测定的物化数据与实施例3产物的相符。
实施例5红参(总皂苷含量2.36％；购自安徽)提取物5g溶于100ml 1，4-丁二醇中，搅拌，加入叔丁醇钠(化学纯，纯度97％)3.96g(0.04mol，浓度0.4mol/L)，通氧，130℃反应41小时，反应结束。反应液冷至室温，用正丁醇饱和的水洗，正丁醇层浓缩后用水溶解，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层用水洗，干燥。浓缩后，经硅胶柱层析[1～8％甲醇/二氯甲烷溶液梯度淋洗]纯化，得原人参二醇(A2)150mg，HPLC测定纯度＞98％；测定的物化数据与实施例3产物的相符。
实施例6红参(总皂苷含量2.36％；购自安徽)提取物5g溶于80ml丙三醇中，搅拌，加入丙醇钠(化学纯)3.28g(0.04mol，浓度0.5mol/L)，通入压缩空气，135℃反应36小时，反应结束。反应液冷至室温，用正丁醇饱和的水洗，正丁醇层浓缩后用水溶解，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层用水洗，干燥。浓缩后，经硅胶柱层析[环己烷∶乙酸乙酯＝10∶1-3∶1(V/V)梯度淋洗]纯化，得原人参二醇(A2)136mg，HPLC测定纯度为＞98％；测定的物化数据与实施例3产物的相符。
实施例7西洋参茎叶提取物(人参总皂苷含量85％；购自吉林)10g溶于100ml正己醇中，加热，搅拌，加入甲醇钠(化学纯，纯度50％)12.96g(0.12mol，浓度1.2mol/L)，通氧，120℃反应70小时，反应结束。反应液冷至室温，用正丁醇饱和的水洗，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层用水洗，干燥。浓缩后，经硅胶柱层析[1～5％甲醇/氯仿溶液梯度淋洗]纯化，得原人参二醇(A2)650mg，HPLC测定纯度＞98％；测定的物化数据与实施例3产物的相符。
实施例8西洋参根部提取物(人参总皂苷含量30％；购自吉林)10g溶于100ml乙二醇中，加热，搅拌，加入甲醇钠(化学纯，纯度50％)12.96g(0.12mol，浓度1.2mol/L)，通氧，130℃反应55小时，反应结束。反应液冷至室温，用正丁醇饱和的水洗，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层用水洗，干燥。浓缩后，经硅胶柱层析[石油醚∶乙酸乙酯＝9∶1-2∶1(V/V)梯度淋洗]纯化，得原人参二醇(A2)300mg，HPLC测定纯度＞98％；测定的物化数据与实施例3产物的相符。
实施例9绞股蓝(总皂苷含量约80％，其中人参皂苷Rb1约占6％，原人参皂苷Rg约占20％；购自湖北)提取物10g溶于100ml乙醇中，加热，搅拌，加入乙醇钠(化学纯，纯度80％)10.2g(0.12mol，浓度1.2mol/L)，通氧，80℃反应84小时，反应结束。反应液冷至室温，用正丁醇饱和的水洗，乙酸乙酯提取，乙酸乙酯层用水洗，干燥。浓缩后，经硅胶柱层析[石油醚∶乙酸乙酯＝10∶1-2∶1(V/V)梯度淋洗]纯化，得原人参二醇(A2)450mg，HPLC测定纯度＞98％；测定的物化数据与实施例3产物的相符。
实施例1010g20(S)-原人参二醇，加乳糖适量，混匀，以70％乙醇为黏合剂，制粒，装入胶囊，即得，每粒含20(S)-原人参二醇50mg。
实施例11乳化剂(吐温、司盘等)适量，溶于水中，加入10g20(S)-原人参二醇，研磨制成初乳，再加水至1000ml，即得口服液。
实施例12以实施例11中的乳剂，其中的水改用注射用水，经过过滤，灭菌，灌封后，即得注射液。
实施例1310g20(S)-原人参二醇，加乳糖适量，混匀，以70％乙醇为黏合剂，制粒，干燥，加入适量硬酯酸镁，压片，即得片剂，每片含20(S)-原人参二醇50mg。
实施例1310g20(S)-原人参二醇，加蔗糖适量，混匀，以70％乙醇为黏合剂，制粒，干燥，即得颗粒剂。
权利要求
1.20(S)-原人参二醇在制备抗肠癌药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物是由20(S)-原人参二醇与医药学上可接受的载体制备成的口服剂、注射剂、片剂、胶囊剂、丸剂或颗粒剂。
3.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述药物为免疫型宿主中介的抗肿瘤药物。
全文摘要
本发明提供了20(S)－原人参二醇在制备抗肠癌药物领域中的新用途。实验结果显示20(S)－原人参二醇对人体肿瘤异种移植于裸鼠模型灌胃给药均显示一定的祛邪作用，无细胞毒药物样的毒副作用，同时具有改善荷瘤鼠的生存质量和延长荷瘤鼠的生命周期的特点，提高荷瘤鼠的应激能力。
文档编号A61P35/00GK1895257SQ200610027508
公开日2007年1月17日 申请日期2006年6月9日 优先权日2006年6月9日
发明者惠永正, 杨子荣, 杨志奇, 葛强 申请人:上海中药创新研究中心