Pdcd4重组表达载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用的制作方法

专利名称：Pdcd4重组表达载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种PDCD4重组表达载体的应用，尤其涉及一种PDCD4重组表达载体在制 备治疗卵巢癌药物中的应用。
技术背景卵巢癌是最常见的三大妇科恶性肿瘤之一，其死亡率居妇科恶性肿瘤之首。目前临 床主要采取手术切除和联合化疗，但总体疗效不理想。这是因为卵巢癌缺乏完善的早期 诊断方法，70%的患者就诊时已属晚期而无法进行手术；再加上目前在临床上应用的传 统抗癌药物大都属于细胞毒性药物，其临床疗效的高低往往取决于癌症细胞对药物的敏 感性。传统抗癌药物存在着治疗窗相对较窄，对实体瘤效果较差，不良反应大，长期用 药后易出现耐药性的缺点，所以传统方法难以治愈，60%的患者最终将复发和转移。晚 期卵巢癌的5年生存率仍低于30%。随着分子生物学、免疫学和病毒学的发展，基因治疗 已成为逐渐成为现实。通过对致瘤基因的抑制或缺陷基因的修复，基因治疗已成为卵巢 癌继手术、化疗和放疗之后的第四种治疗模式，日益受到人们的重视。实现肿瘤基因治疗的关键是要使用高效安全的基因导入系统。用于基因治疗的载体 系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类。目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载 体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等，腺病毒、慢病毒 载体都能转导非分裂期细胞，二者在基因治疗中都具有广泛的应用前景。腺病毒载体是 一种非常有效的转基因载体，具有高效率、高滴度、低致病性及不整合入宿主细胞染色 体等优点。然而，第一、二代腺病毒载体仍有许多不足之处，如包装容量小、细胞毒性 大、免疫原性强及表达时相短等。因此，在第一、第二代腺病毒载体的基础上发展了第 三代腺病毒载体，又称辅助病毒依赖型腺病毒(helper-d印endent adenovirus)或空壳 载体(gutless vector),既保留了传统腺病毒载体的优点，又具有安全、长效、高容 量等特点，表现出在人类基因治疗中的特殊优势及良好前景。空壳载体不仅保留了传统 腺病毒载体基因转载效率高的优点，还进一步提高了安全性，扩大了基因的转载容量， 并且大幅延长了目的基因的表达时间，具有其它转基因载体所无法比拟的优越性。第三 代腺病毒载体不仅继承了传统腺病毒载体的优点，还有其独特优势(l)由于其不表达 腺病毒自身蛋白，显著降低了细胞毒性与免疫原性，安全性更好，表达目的基因的时间 更长；(2)转载容量大大提高，达到36kb，可同时表达多个基因及一些能控制基因表达 的调控因子；(3)由辅助病毒决定载体的血清型，采用不同的辅助病毒就可包装出不同 血清型的空壳载体。第三代腺病毒载体能够克服传统腺病毒载体的基因泄漏表达及包装 容量有限等缺点，可反复应用于临床治疗。由于上述优点，腺病毒载体已成为当前基因 治疗中基因转移载体研究的热点,人们对它寄予了攻克和治愈肿瘤的厚望。实现肿瘤基因治疗的另一关键是要选择合适的目的基因。与其他肿瘤一样，卵巢癌 的发生是与细胞增殖分化有关的癌基因、抑癌基因多阶段相互作用的结果，目前已发现 K-ras、 c-myc、 c-erb2(Her-2/neu)等癌基因和P53、 P16、 BCRA1等抑癌基因与卵巢癌密切相关。P53基因是目前研究最深入的抑癌基因，30-8096的卵巢癌病人存在P53突变。野生型的P53蛋白(wtP53)好比"分子警察"，监视着细胞基因组的完整性，如果DNA受损，则 wtP53通过转录调控机制使细胞分裂停滞于Gl期，以便使细胞有足够的时间修复损伤； 若修复失败，则启动程序性死亡而引发细胞自尽，即细胞凋亡。若wtP53功能丧失，则 导致基因异常有癌变倾向的细胞生长而引发肿瘤。此外，原癌基因c-myc的表达也受p53的抑制。因此当p53基因突变，c-myc过度表达 时易出现肿瘤。目前研制的p53基因治疗药物大都是通过各种方式将正常的野生型p53基 因导入肿瘤细胞，替换突变基因，利用野生型基因诱导细胞凋亡的作用来抑制肿瘤细胞' 的生长。将野生型p53基因转导入肿瘤细胞的载体包括病毒载体和非病毒载体两种，前 者又包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体等， 后者主要以脂质体，特别是阳离子脂质体载体为主。2003年10月16日，我国食品药品监 督管理局(SFDA)正式颁给深圳赛百诺基因技术有限公司研制的重组人p53基因腺病毒 注射液(商品名为今又生) 一类新药证书，批准其用于实体癌，特别是头颈部癌的基因 治疗，这一事实意味着世界上第一种p53基因治疗药物在中国诞生，标志着我国在基因 治疗癌症临床和基因药物产业化方面正在加快追赶世界先进水平的步伐。国外目前也有 两种以腺病毒为载体的p53基因治疗药物正处于临床试验后期阶段。Introgen Therapeutics公司正在美国和欧洲开展有关Advexin (INGN201)治疗头颈部癌、卵巢癌 的m期临床试验，治疗肺癌的II期临床试验，以及治疗其他5种癌症的I期临床试验。 在头颈部癌临床试验中，瘤内单独注射Advexin可使47X的受试者病情稳定或改善。此外， 瘤内注射Advexin结合放疗可明显改善局限性肺癌患者的l年和2年生存率。先灵葆雅研 制的腺病毒型p53基因治疗药物SCH58500联合其他化疗药物治疗晚期卵巢癌的in期临床 试验也正在进行当中，目前发现，多次注射SCH58500的患者的生存率要明显长于单次给 药患者。PDCD4是1995年Shibahara等在小鼠体内发现的与细胞凋亡有关的基因。此后Goke A 等和0nishi Y等又先后在大鼠及人类中发现该基因的存在。已知人PDCD4基因定位于 10q24, cDNA全长约3.5kb,其中编码区约1.4kb。 PDCD4编码蛋白约469氨基酸，在PDCD4 的氨基侧有两个重要的a螺旋结构区一MA3， PDCD4通过该功能域与真核细胞翻译起始因 子elF4A发生结合，从而抑制核糖体复合物的形成和蛋白质的合成，促进细胞凋亡；另 外，PDCD4还有多个与其活化有关的蛋白激酶的磷酸化位点。Northern blot分析小鼠 的正常组织发现PDCD4的分布在肝脏表达最高，其次是睾丸、肺、脑、肾及脾，而在骨 骼肌和心脏中表达较低。在大多数正常组织细胞中，PDCD4蛋白主要位于细胞核中，当 细胞周围环境发生改变，例如营养条件下降或细胞发生恶性增殖时，它可以通过核输出 信号(NES)转移到细胞浆中。近来在小鼠实验模型中PDCD4被确定为新的抑癌基因来自小鼠实验模型的研究结 果证明PDCD4对肿瘤具有明显抑制作用，是一种新的抑癌基因。主要证据有(1)来自 小鼠表皮细胞JB6模型转化试验的结果提示PDCD4是一种抑癌基因；JB6细胞有两种，一 种是对肿瘤诱导剂敏感、易向肿瘤细胞转化的细胞(P+);另一种是不易受肿瘤诱导剂影 响、不易向肿瘤细胞转化的细胞(P—)。差异显示结果证实PDCD4在JB6P—细胞中高表达， 而在JB6P+细胞系是低表达的。在稳定转染PDCM的JB6P+细胞系中，PDCD4的过表达可抑 制细胞的恶性转化；(2) PDCD4转基因小鼠模型的研究也证明PDCD4是一种抑癌基因Jansen AP等在PDCD4转基因小鼠模型中发现，PDCD4的表达不仅抑制了表皮乳头状瘤的 形成，而且降低了表皮乳头状瘤向皮肤癌的恶性转化和皮肤癌的发生率；(3)来自PDCD4 基因敲除小鼠的研究结果从另一方面证明了PDCD4确实是一种抑癌基因。HilliardA等 进一步发现敲除PDCD4基因后，84W小鼠产生恶性B细胞淋巴瘤。与其他肿瘤抑制基因相类似，PDCD4在人类某些肿瘤细胞系以及肿瘤标本中存在着 明显的表达缺失Jansen AP等检测了 60种来自肾脏、肺脏、结肠、乳腺以及神经胶 质细胞的肿瘤细胞系屮PDCD4的表达情况，结果显示在mRNA和蛋白水平PDCD4均有表 达较低或缺失，但是PDCD4在蛋白水平表达的缺失率明显高于RNA水平，证实人PDCD4 也是一种抑癌基因。有资料显示肺癌中PDCD4缺失率高达83呢。而且PDCD4缺失与肿瘤 的分化程度降低以及预后效果不良密切相关；在胰腺癌中亦发现癌组织中的PDCD4表达 与癌旁组织相比明显降低，而且PDCD4的低表达与肿瘤的分化程度密切相关。目前研究显示，PDCD4的抑癌机制主要有以下几方面(1) PDCD4通过抑制肿瘤细 胞翻译过程中起始复合物的形成来抑制肿瘤的生长。研究显示PDCD4蛋白能直接与 elF4A相互作用，从而阻断elF4A与elF4G结合，进而阻断翻译的顺利进行。(2) Hsin-ShengYang等的结果显示PDCD4可通过下调丝裂原活化的蛋白激酶1 (MAPK4K1) 的表达，阻断c-Jun的活化，从而抑制AP-1依赖的转录活性，进而抑制结肠癌细胞的 转移。(3) Jin H等利用咪唑丙烯酸(UAC)修饰的聚氨基葡糖/PDCD4基因复合物气雾 吸入治疗K-ras裸鼠肺癌模型，结果显示UAC/PDCD4复合物可促进肺癌细胞的凋亡；还 可抑制肿瘤血管生成。综上所述，PDCD4作为一种新发现的抑癌基因具有抑制肿瘤生长，抑制其恶性表型 的作用，这些结果提示PDCD4在卵巢癌中也可能发挥重要作用，具有潜在的临床应用价 值。发明内容针对目前制备治疗卵巢癌基因药物的不足，本发明的目的是提供一种PDCD4重组表 达载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用。具体地说是利用新型抑癌基因PDCD4对卵巢癌 细胞生长抑制的特点，通过构建获得PDCD4重组表达载体，进而制备治疗卵巢癌的药物， 充分利用其自身抑癌基因的特点，使PDCD4在卵巢癌细胞中高效表达，实现治疗卵巢癌 的目的。本发明所述PDCD4重组表达载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用。其中所述PDCD4重组表达载体是PDCM基因与病毒性载体或非病毒性载体构建的重组表达载体；进一步优选PDCD4重组表达载体是PDCD4基因与病毒性载体构建的重组表达载体。上述PDCD4基因包含人PDCD4基因cDNA全长编码序列；所述病毒性载体优选是腺病毒 或慢病毒，其中病毒性载体中最优选使用的是腺病毒；所述非病毒性载体优选是质粒。本发明的技术方案是基于申请人的前期研究，在前期研究中，申请人首先利用 RT-PCR技术检测了来源于人桨液性乳头状囊腺癌的卵巢癌上皮细胞系SK0V3中PDCD4 mRNA的表达，并利用免疫组化技术检测了43例浆液性囊腺癌组织中PDCD4的表达，结果 发现卵巢癌细胞系中PDCD4的表达明显下调，卵巢癌组织中50-60% PDCD4表达下调或缺 失，且与肿瘤分化程度和预后密切相关。在此基础上，申请人通过构建PDCD4重组病毒转染肿瘤细胞后使其高表达PDCD4后，通过肿瘤细胞生长曲线、集落形成率、成瘤率等 的检测及体内肿瘤生长速率的动态观察等，不仅进一步证实PDCD4对肿瘤的抑制作用， 而且为应用PDCD4治疗肿瘤及其药物开发提供强有力的实验依据，具有重大的理论价值 和良好的应用前景。本发明所述PDCD4重组表达载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用及效果验证，具体 方法是(1) 根据目的基因相关信息(序列，序列号等)，构建含有外源基因的重组表达载体；(2) 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化高质量的不含内毒素的重组质粒； 例如以正常人血细胞mRNA为模板，合成含有PDCD4的质粒载体或以其为模板通过PCR获得目的基因，将目的基因定向克隆至病毒穿梭质粒构建阳性重组PDCD4，筛选阳 性克隆，测序正确后，提纯和纯化高质量的不含内毒素的PDCD4重组病毒载体(3) 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装扩增，获 得重组病毒颗粒；(4) 收集病毒液；浓縮、纯化病毒液；(5) 用高纯度的病毒液感染肿瘤细胞，以肿瘤生物学研究指标检测肿瘤细胞的生 存情况；(6) 通过定量PCR精确测定病毒滴度(高精确滴定方法)和Western分析实验结果；(7) 用高滴度的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能以及使用药物进行稳定转染 细胞株的筛选。上述肿瘤生物学研究指标主要包括肿瘤细胞的生长曲线、肿瘤细胞集落形成能力以 及成瘤能力等。试验证实通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。 本发明应用新型抑癌基因PDCD4重组表达载体治疗卵巢癌，经试验证明使用PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞能够明显抑制卵巢癌细胞的生长。所产生的积极效果是(1)通过抑制卵巢癌细胞的生长周期抑制细胞生长(见图l、图2)、集落形成能力(见图3)和肿瘤细胞的成瘤能力，对动物模型体内的卵巢癌也同样具有良好的抑制效果(见图4); (2)重组病毒的获得使其治疗肿瘤的疗效更佳，不仅可以使PDCD4在肿瘤细胞内高效表达，而且有利于更好地发挥其自身抑癌基因的特点， 提高患者的生存率和生存质量，从而改善其预后。提示PDCD4重组病毒制备治疗卵巢癌 的基因药物在临床中的应用将是一种值得关注的治疗方案，对于其药物开发提供强有力 的实验依据，具有重大的理论价值和良好的应用前景。本发明的研究表明使用PDCD4重组表达载体转染肿瘤细胞，不仅能够高效转导肿瘤 细胞,而且在体内能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用不易引起免疫反应，提高 了基因治疗的有效性及安全性。病毒在宿主细胞内，能以病毒RNA为模板在自身反转录酶 (RT)的作用下合成cDNA，再以此cDNA为模板合成双链DNA，经环化后通过病毒整合酶(IN) 作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达。因此，以病毒基因组为基础除去其复制所 需要的基因而代之以治疗基因和选择性标记物,构建而成的病毒载体具有转移基因片段 容量大、不易诱发宿主免疫反应、安全性较好、不仅能感染分裂细胞最大特点是还能用 于感染不分裂细胞如神经细胞、造血干细胞、肌纤维细胞和肝细胞等；稳定整合于靶细胞的基因组,治疗基因表达时间长，在基因治疗中具有广泛的应用前景，其临床应用前 景更优。本发明提供了可高效治疗卵巢癌并含有新型抑癌基因PDCD4的重组表达载体和釆用 该重组表达载体进行制备治疗卵巢癌药物的方法。迄今为止，尚未有应用携带该基因的 重组表达载体治疗卵巢癌的研究报告。本发明通过将编码PDCD4基因的核苷酸序列插入重组表达载体基因组中，制备治疗 卵巢癌的化学药物，使其在肿瘤细胞内高效表达，用以治疗卵巢癌，并抑制卵巢癌细胞 的生长以及转移。此方法有望应用于卵巢癌的临床治疗，改善患者的预后，提高患者的 生存率，延长患者的生存时间。


图l:示PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞后明显抑制细胞生长周期，使G2-M期明显降 低。1为SK0V3组;2为SK0V3-Mock (空载体)组；3为SK0V3-PDCD4组。 图2:示PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞后细胞的生长曲线。图3:示PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞后明显抑制细胞克隆形成，使肿瘤细胞克隆 数明显减少。图4:示裸鼠体内PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞后肿瘤的生长曲线。
具体实施方式
本发明的试验中优选使用的重组表达载体是病毒性载体(购自武汉大学病毒所)， 病毒性载体中优选使用的是腺病毒 1.构建和生产PDCD4重组腺病毒 (1)腺病毒表达载体的构建1) PDCD4基因克隆入pMD-18T质粒根据PDCD4的cDNA序列(包括信号肽)设计一对特 异性寡核苷酸引物，上游引物序列为5' -CTGAGCACATATGATGAATCAAACTGCGATTCTGAT-3', 下游引物序列为5'-GAGGATCCTTMGGAGATCTTTTAGACATTTC-3'。以噬菌体人肺cDNA文 库为模板，使用上述上、下游引物，用Pyrobest高保真DNA聚合酶扩增目的基因PDCD4。 PCR参数是94 'C, 30 s; 53 'C, 1 min; 72 'C， 1 min, 30个循环。1%琼脂糖凝胶电 泳回收PCR产物。用T4连接酶在合适的缓冲液中连接pMD-18T与回收片段16'C、 lh。连接 产物转化DH5a,在Amp+LB平板上37'C培养12h。挑取阳性克隆，经HindIII和XbaI双酶 切鉴定。正确克隆命名为pMD-18T/PDCD4。2) 将PDCD4基因亚克隆入穿梭载体将质粒pMD-18T/PDCD4和pAdTrack-CMV-p38分别 经HindIII和XbaI双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收，回收产物用T4DNA连接 酶于16'C过夜连接后再转化感受态DH5a菌。在Kana+LB平板上37'C培养20 h，挑取较小 的阳性克隆。经HindIII和XbaI双酶切鉴定正确后命名为pAdTrack-CMV/PDCD4。3) BJ5183大肠杆菌感受态细胞的制备取冻存的大肠杆菌BJ5183菌液1 iil分别稀释 到lmlLB中，再从中取10nl，铺AMP+的LB平板，置37'C温育过夜。取出LB平板，分别 挑取单克隆于5mlLB中，37'C， 220r/min， 震荡培养4h。分别取菌液lml加入100mlLB 细菌培养液中，37'C震荡培养至D600-0.3时，将细菌分装到无菌的、冰预冷的50ml聚丙 烯管中，在冰上放置IO min,使培养物冷却至O'C。 4'C， 4000 r/min,离心10min;弃 上清。分别加入4。C预冷的0. lmol/LCaCl210ml,混匀，冰上放置约30 min。 4'C， 4000r/min,离心10min,弃上清。分别加入4'C预冷的0. lmol/LCaCl22 ml,混匀，置4'C过夜。加入10%无菌甘油，混匀，置冰上分装于EP管中，-80'C冻存备用。(2) 细菌内同源重组产生重组腺病毒质粒取lyg pAdTrack-CMV/PDCD4用Pmel线性化后，1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶 回收目的片断。挑取冻存的已含pAdEasy-1的BJ5183菌，用CaCl2法制备高效感受态，再 将l U g线性化pAdTrack-CMV/PDCD4转入含有pAdEasy-1的BJ5183菌；取适量的细胞在 Kana+的平板中，37'C培养16-20h;挑取阳性克隆，抽提质粒鉴定后再转入DH5 a菌中。 重组病毒质粒命名为pAd/PDCD4。用PacI对pAd/PDCD4重组病毒质粒进行酶切鉴定。(3) 重组腺病毒载体在HEK293细胞的包装和扩增从转化入pAd/PDCD4重组质粒的DH5a菌中提取质粒DNA10w g,用PacI酶切使之线性 化，同时切去Kan和Ori等载体构件，暴露反转录末段重复序列。酶切产物加入1/10体积 的3mol/L冷NH4Ac与2.5倍体积的无水乙醇，-20'C沉淀DNA, 4'C进行11000r/min离心 20mim弃上清；加入75%冷乙醇溶液，离心洗涤2次，每次5min，弃上清；空气干燥， 加入ddH20溶解DNA并定量。培养HEK293细胞，按照厂家说明用Polyfect进行细胞转染， 2d后用荧光显微镜进行观察。7-10d后收集细胞，离心沉淀后在37'C/-80'C条件下反复 冻融4次，4r、 7000g离心5min，取部分病毒上清再次感染HEK293细胞以扩增重组病毒。(4) 重组腺病毒的鉴定重组病毒Ad/PDCD4的鉴定取病毒上清2y 1，煮沸10min以制备病毒基因组DNA。以重 组病毒基因组DNA为模板，以扩增PDCD4的上、下游引物按前述条件进行PCR反应。2.体外实验通过PDCD4重组病毒感染人卵巢癌细胞系，研究PDCD4表达或过表达 对卵巢癌细胞的生长的影响■ PDCD4重组腺病毒转染卵巢癌细胞系将卵巢癌细胞株SK0V3细胞置于1640培养液(含10"M、牛血清)中，在37。C、 5%0)2的水 饱和条件下孵箱内培养，常规更换培养液，消化传代。实验用细胞均处于对数生长期。 细胞SK0V3以1. 8X105接种于6cm培养皿，在5%00237°(:条件下培养2411后换以新鲜培养液， 根据需要分别加入200 u 1的重组腺病毒悬液(100 MOI)继续培养24h后，换以新鲜培养液， 培养72h后在荧光显微境下观察GFP基因的表达。■用RT-PCR和Westernblot方法检测PDCD4在转染后人卵巢癌细胞系(购自中国科 学院上海细胞库)中的表达用Trizol—步法按说明书分别提取细胞总RNA，以32磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为 内参照，采用半定量RT-PCR分析PDCD4mRNA的表达。引物序列如下PDCD4上游引物5' TGG CAC TCT GCT TGC TCA CC 3' ， PDCD4下游引物:5， CTC ATC CAC AAT GCC CGT CT 3，，产物长度为179bp;内参照GAPDH的序列，上游引物5' TGG GGA AGG TGA AGG TCG GA 3，，下游引物5， GGG ATC TCG CTG CTC GAA GA 3，，产物长度为673bp。 PCR产 物经2%琼脂糖凝胶系统电泳(含0. 5g/L溴化乙啶)，用GDS28000凝胶成像分析系统拍照鉴定,图像分析软^^定量分析。Western印迹检测PDCD4蛋白的表达用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解溶液裂解收集 的细胞，经BCA蛋白质浓度测定试剂盒进行蛋白质定量。等量的细胞总蛋白(10ug/泳 道)上样进行电泳[12 %十二垸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)]，一抗采用美 国Upstate公司兔抗PDCD4抗体(1 : 2000)和兔抗GAPDH(1 : 5000), 二抗采用美国Sigma公 司抗兔IgG2辣根过氧化物酶(服P) (1 : 5000)。最终用以色列Biological industries公司EZ-ECL荧光底物试剂盒曝光显影。画流式细胞术分析PDCD4转染后人卵巢癌细胞系细胞凋亡与细胞周期的变化情况 取1X1(T个PDCD4重组腺病毒转染后的SK0V3细胞，以1000r/min的转速离心5min,弃上清。加入lxPBS轻轻振荡使细胞悬浮，经PI染色，应用流式细胞术检测细胞周期。结果如图l示PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞后明显抑制细胞的生长周期，使G2-M期的细胞数明显减少。■ OLYMPUS 1X71-F22FL/PH荧光倒置显微镜观察PDCD4在转染前后人卵巢癌细胞系 生长的形态学变化，并绘制生长曲线结果如图2示PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞后明显抑制细胞生长，使细胞数量明显 减少。■集落形成实验观察PDCD4转染后人卵巢癌细胞系集落形成程度的变化情况 取PDCD4重组腺病毒转染后的SK0V3细胞，胰蛋白酶消化制备细胞悬液、计数，接种 于6孔板，1500个细胞/孔。常规培养，每日观察克隆形成情况，2周后，利用20%甲醇固 定细胞并用结晶紫染色，镜下计数>50个细胞的克隆数。计算克隆形成率克隆形成率 (%)=克隆数/接种细胞X10(m。结果如图3示PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞后明显 抑制细胞克隆形成，使肿瘤细胞克隆数明显减少。3.体内实验用PDCD4重组病毒感染人卵巢癌细胞系，在裸鼠体内研究PDCD4表达对卵巢癌细胞生长和转归的影响■皮下注射卵巢癌细胞系构建荷瘤裸鼠模型本实验使用的18只SPF级4 6周龄BALB/c雌性裸鼠由上海中科院斯莱克实验动物中 心提供。在每只裸鼠右侧腋下接种5X105个SK0V3细胞，6-7天成瘤后，将实验动物随机 分为3组①PBS对照组；②空载体对照组；③注射PDCD4重组腺病毒组。每组采用6只裸 鼠，分别瘤内注射PBS、空载体、PDCD4重组腺病毒。此后每周定期测量肿瘤的长径和短 径，计算肿瘤的体积。4周后无痛处死动物，分离皮下形成的肿瘤并称重。结果如图4示 PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞后明显抑制肿瘤的生长。
权利要求
1、PDCD4重组表达载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用。
2、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述PDCD4重组表达载体是PDCD4基因 与病毒性载体或非病毒性载体构建的重组表达载体。
3、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述PDCD4重组表达载体是PDCD4基因与病毒性载体构建的重组表达载体。
4、 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述PDCD4基因包含人PDCD4基因 cDNA全长编码序列。
5、 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述病毒性载体是腺病毒或慢病毒。
6、 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述病毒性载体是腺病毒。
7、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述非病毒性载体是质粒。
全文摘要
本发明公开了一种PDCD4重组表达载体在制备治疗卵巢癌药物中的应用。本发明通过将编码PDCD4基因的核苷酸序列插入重组表达载体基因组中，制备治疗卵巢癌的化学药物，使其在肿瘤细胞内高效表达，用以治疗卵巢癌，并抑制卵巢癌细胞的生长以及转移。本发明为抗癌药物开发提供强有力的实验依据，具有重大的理论价值和良好的应用前景。
文档编号A61K48/00GK101219222SQ200710115320
公开日2008年7月16日 申请日期2007年12月11日 优先权日2007年12月11日
发明者霞 张, 张利宁, 朱法良, 群 王, 王晓燕, 春 郭, 飞 高, 魏增涛 申请人:山东大学