Pdcd4重组表达载体在制备治疗胶质瘤药物中的应用的制作方法

专利名称：Pdcd4重组表达载体在制备治疗胶质瘤药物中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种PDCD4重组表达载体的应用，尤其涉及一种PDCD4重组表达载体在 制备治疗胶质瘤药物中的应用。
背景技术：
(1) 促进肿瘤细胞凋亡是当前抗癌新药研究的发展方向之一
目前，癌症在全世界人口死亡原因中排名第二，仅次于心脏病。以美国为例，2000 年就有50万人死于癌症。传统抗癌药物大都属于细胞毒性药物，其临床疗效的高低往往 取决于癌症细胞对药物的敏感性。传统抗癌药物的主要缺点包括治疗窗相对较窄，对 实体瘤效果较差，不良反应大，长期用药后易出现耐药性。
近年来的研究发现，某些参与细胞凋亡过程的基因在肿瘤细胞中的表达往往存在不 同程度的缺陷，例如，BCL2基因和caspase酶系基因在大约三分之一的癌症中呈现过度 表达。此外，某些细胞凋亡的调节基因，如p53基因，同样也与癌症的发生和发展有着 千丝万缕的联系。
大多数与细胞凋亡过程有关的生物分子都不是类似于细胞表面受体这样的比较典 型的药物作用靶位，因此，传统的干预措施，如小分子化学药物，都不能很好地调节细 胞凋亡过程。不过，利用单克隆抗体和反义寡核苷酸等新治疗手段却可以做到这一点。 其中，针对BCL2和p53基因开发的新型抗癌药物是近年来发展得最为迅速的几个品种。
1) BCL2基因反义药物BCL2是位于线粒体外膜的膜蛋白。目前的研究显示，BCL2 基因在多种人类恶性肿瘤中都呈现过度表达。专家指出，BCL2基因的过度表达可以抑制 线粒体释放细胞色素C，阻止caspase-9酶和随后参与凋亡的其它关键酶的激活，从而抑 制细胞凋亡过程；另有研究发现，BCL2还可以通过抑制由死亡受体Fas和Fas-L介导的 caspase-8酶激活Bid (BCL2家族中的凋亡促进因子)过程，从另一条途径来抑制细胞凋 亡。因此，人们认为，抑制BCL2基因在肿瘤细胞中的过度表达将会有助于促进肿瘤细胞 的凋亡，有利于癌症的控制和治疗。.反义药物是最早出现的一类BCL2基因治疗抗癌药物， 它由反义寡核苷酸组成，可封闭BCL2基因的表达，促进肿瘤细胞的凋亡，同时增加与之 合用的其他抗癌药物的临床疗效。奥利默森钠(Oblimersen sodium, G3139,商品名为 Genasense)是Genta公司开发的一种反义药物，其成分为18基体硫代磷酸反义脱氧核苷 酸，直接针对BCL2信使RNA (mRNA)开放阅读框的前6位密码子。大量各种细胞系的临床 前研究表明，Genasense能诱导BCL2mRNA核苷酸序列特异性降解，从而抑制BCL2蛋白的 表达。目前，Genta公司正与安万特公司合作，共同组织几项Genasense的ffl期随机临床 试验，其适应证包括恶性黑素瘤、多发性骨髓瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)和非小 细胞肺癌。2003年6月，美国食品药物管理局(FDA)同意将Genasense作为CLL治疗药物 纳入快速审批通道。与此同时，Genta公司宣布，它将启动四项新的临床试验，以验证 Genasense单独或联用其他抗癌药物治疗不同类型癌症的临床疗效。这四项临床试验包 括，与干扰素合用治疗晚期肾癌的II期临床试验，单药治疗晚期Waldenstrom巨球蛋白 血症的I/II期临床试验，与礼来公司的吉西他滨(健择)合用治疗晚期实体瘤(主要 是胰腺癌)的I期临床试验，以及与CH0P-R标准化疗方案合用治疗晚期非霍奇金氏淋巴
瘤的I期临床试验。在Genasense合并氮烯咪胺(dacarbazine)治疗恶性黑素瘤的I/H 期临床试验中，患者用药5天后其BCL2表达的中位值就下降40")i,核凋亡率也从治疗前的 0.85%上升到3.17%,加用氮烯咪胺后更上升至19.4%;有57%的患者经治疗后病情得以稳 定或有所改善，而作为对照的恶性黑素瘤标准治疗方案则只取得15% 20%的阳性反应 率。在另一项Genasense与多西紫杉醇(泰索帝，安万特公司生产)合并治疗乳腺癌的 I期临床试验中，7例可评价疗效的乳腺癌受试者中有2例达到临床缓解。业界人士认为， 如果目前正在进行的几项关键性临床试验取得成功，Genasense将有望在2004年获准上 市，从而成为首个上市销售的反义抗癌药物。此外，目前的资料显示，Genasense与其 他抗癌药物合并治疗多种癌症时具有协同作用，因此，这种药物完全有可能成为许多 BCL2过度表达的癌症的辅助治疗药物。据统计，每年在美国获准上市的抗癌新药的适应 证，大约有三分之一属于BCL2过度表达的癌症。假定在这些患者中有一半左右会用 Genasense进行治疗，而Genasense的平均治疗成本又假设为10, 000美元/人，那么， Genasense在美国及全球的市场规模就会分别达到15亿和30亿美元。
2) p53基因治疗药物p53是一种重要的抑癌基因，它在细胞周期调控、抑制细胞 生长、诱导肿瘤细胞凋亡等方面具有重要的作用。p53基因与肿瘤关系密切，人类恶性 肿瘤中至少有509i存在p53基因变异，因此，p53基因已成为近年来癌症研究领域中的一 个热点。作为一种转录因子，p53蛋白并不直接参与细胞凋亡过程；不过，它对一部分 能够引起细胞生长阻滞或凋亡的其他基因具有调节作用。例如，p53能下调其下游与凋 亡有关的bax、 igf-bp3基因，上调BCL2基因，从而调控细胞凋亡过程。目前已发现受p53 调控的与凋亡相关的其他基因还包括killer/dr5、 fas/apo1、 noxa、 ei24/pig8、 puma 等。此外，原癌基因c-myc的表达也受p53的抑制。因此当p53基因突变，c-myc过度表达 时易出现肿瘤。目前研制的p53基因治疗药物大都是通过各种方式将正常的野生型p53基 因导入肿瘤细胞，替换突变基因，利用野生型基因诱导细胞凋亡的作用来抑制肿瘤细胞 的生长。将野生型p53基因转导入肿瘤细胞的载体包括病毒载体和非病毒载体两种，前 者又包括腺病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒相关病毒载体和单纯疱疹病毒载体等， 后者主要以脂质体，特别是阳离子脂质体载体为主。2003年10月16日，我国食品药品监 督管理局(SFDA)正式颁给深圳赛百诺基因技术有限公司研制的重组人p53基因腺病毒 注射液(商品名为今又生) 一类新药证书，批准其用于实体癌，特别是头颈部癌的基因 治疗，这一事实意味着世界上第一种P53基因治疗药物在中国诞生，标志着我国在基因 治疗癌症临床和基因药物产业化方面正在加快追赶世界先进水平的步伐。国外目前也有 两种以腺病毒为载体的p53基因治疗药物正处于临床试验后期阶段。Introgen Therapeutics公司正在美国和欧洲开展有关Advexin (INGN201)治疗头颈部癌、卵巢癌 的m期临床试验，治疗肺癌的II期临床试验，以及治疗其他5种癌症的I期临床试验。 在头颈部癌临床试验中，瘤内单独注射Advexin可使47W的受试者病情稳定或改善。此外， 瘤内注射Advexin结合放疗可明显改善局限性肺癌患者的l年和2年生存率。先灵葆雅研 制的腺病毒型p53基因治疗药物SCH58500联合其他化疗药物治疗晚期卵巢癌的III期临床 试验也正在进行当中，目前发现，多次注射SCH58500的患者的生存率要明显长于单次给 药患者。
由于细胞凋亡在多种疾病中都具有相当重要的作用，因此，在今后10年中，科学 家们将有可能开发出许多以细胞凋亡为基础的新药。以细胞凋亡为基础的抗癌药物将与
细胞毒类抗癌药、新型分子靶向抗癌药(如表皮生长因子受体抑制剂) 一道，成为今后 肿瘤治疗药物中的生力军。
(2) 脑胶质瘤是颅内最常见的恶性肿瘤，占颅内肿瘤的35.12%~61.10%,平均49.17%。 由于大多数胶质瘤呈浸润性生长，与周围脑组织边界不清，所以治疗十分困难。神经影 像学技术和显微外科技术的不断进展对神经外科的发展起了巨大的促进作用，而分子 生物学研究的不断深入，为肿瘤的基因治疗提供了广阔前景。然而，对脑胶质瘤的治疗 似乎并没有突破性的进展，如何提高胶质瘤的治疗效果，让病人的生命得到高质量的 延续，是当今神经外科医生的共同愿望。由于胶质瘤经手术以及放、化疗后，仍有多数 患者愈后不佳，近些年来，人们越来越多地把目光投向胶质瘤的基因治疗，但是到目 前为止还没有有效的基因药物进入临床。脑胶质瘤是原发性脑肿瘤中发病率最高，治疗 最棘手的一类肿瘤。尽管目前胶质瘤的治疗效果还不尽如人意，但是随着分子生物学技 术的进步，基因药物会逐步走向临床，为改善胶质瘤病人的预后，并最终为治愈胶质 瘤开辟一条崭新的道路。
(3) 随着对疾病分子机制认识的加深及生物技术的发展，基因治疗已成为治疗感染性疾 病、遗传疾病、神经系统疾病以及肿瘤的新焦点。用于基因治疗的载体系统可分为病毒 性载体和非病毒性载体两类。目前常用的病毒载体包括逆转录病毒载体、腺病毒载体、
腺相关病毒载体、疱疹病毒载体、痘苗病毒载体等,腺病毒、慢病毒载体都能转导非分 裂期细胞,二者在基因治疗中都具有广泛的应用前景。腺病毒载体是一种非常有效的转 基因载体，具有高效率、高滴度、低致病性及不整合入宿主细胞染色体等优点。然而， 第一、二代腺病毒载体仍有许多不足之处，如包装容量小、细胞毒性大、免疫原性强及 表达时相短等。因此，在第一、第二代腺病毒载体的基础上发展了第三代腺病毒载体， 又称辅助病毒依赖型腺病毒(helper-dependent adenovirus)或空壳载体(gutless vector)，既保留了传统腺病毒载体的优点，又具有安全、长效、高容量等特点，表现 出在人类基因治疗中的特殊优势及良好前景。空壳载体不仅保留了传统腺病毒载体基因 转载效率高的优点，还进一步提高了安全性，扩大了基因的转载容量，并且大幅延长了 目的基因的表达时间，具有其它转基因载体所无法比拟的优越性。第三代腺病稀载体不 仅继承了传统腺病毒载体的优点，还有其独特优势(l)由于其不表达腺病毒自U蛋白， 显著降低了细胞毒性与免疫原性，安全性更好，表达目的基因的时间更长；(2)转战容 量大大提高，达到36kb，可同时表达多个基因及一些能控制基因表达的调控因子；(3) 由辅助病毒决定载体的血清型，采用不同的辅助病毒就可包装出不同血清型的空壳载 体。第三代腺病毒载体能够克服传统腺病毒载体的基因泄漏表达及包装容量有限等缺 点，可反复应用于临床治疗。由于上述优点，腺病毒载体已成为当前基因治疗中基因转 移载体研究的热点,人们对它寄予了攻克和治愈肿瘤的厚望。
(4) 新型抑癌基因PDCD4 (programmed cell death 4)的发现和生物学特点
1) PDCD4是1995年Shibahara等在小鼠体内发现的与细胞凋亡有关的基因。此后Goke A等和0nishi Y等又先后在大鼠及人类中发现该基因的存在。己知人PDCD4基因定位于 10q24， cDNA全长约3.5kb,其中编码区约1.4kb。 PDCD4编码蛋白约469氨基酸，在PDCD4 的氨基側有两个重要的a螺旋结构区一MA3， PDCD4通过该功能域与真核细胞翻译起始因 子elF4A发生结合，从而抑制核糖体复合物的形成和蛋白质的合成，促进细胞凋亡；另
外，PDCD4还有多个与其活化有关的蛋白激酶的磷酸化位点。Northern blot分析小鼠的 正常组织发现PDCD4的分布在肝脏表达最高，其次是睾丸、肺、脑、肾及脾，而在骨骼 肌和心脏中表达较低。在大多数正常组织细胞中，PDCD4蛋白主要位于细胞核中，当细 胞周围环境发生改变，例如营养条件下降或细胞发生恶性增殖时，它可以通过核输出信 号(NES)转移到细胞浆中。
2) 近来在小鼠实验模型中PDCD4被确定为新的抑癌基因来自小鼠实验模型的研究 结果证明PDCD4对肿瘤具有明显抑制作用，是一种新的抑癌基因。主要证据有(i)来 自小鼠表皮细胞JB6模型转化试验的结果提示PDCD4是一种抑癌基因；JB6细胞有两种， 一种是对肿瘤诱导剂敏感、易向肿瘤细胞转化的细胞(P+);另一种是不易受肿瘤诱导剂 影响、不易向肿瘤细胞转化的细胞(P—)。差异显示结果证实PDCD4在JB6P—细胞中高表达， 而在JB6P+细胞系是低表达的。在稳定转染PDCD4的JB6P+细胞系中，PDCD4的过表达可抑 制细胞的恶性转化；(ii) PDCD4转基因小鼠模型的研究也证明PDCD4是一种抑癌基因 Jansen AP等在PDCD4转基因小鼠模型中发现，PDCD4的表达不仅抑制了表皮乳头状瘤的 形成，而且降低了表皮乳头状瘤向皮肤癌的恶性转化和皮肤癌的发生率；(iii〉来自 PDCD4基因敲除小鼠的研究结果从另一方面证明了PDCD4确实是一种抑癌基因。 Hilliard A等进一步发现敲除PDCD4基因后，84劣小鼠产生恶性B细胞淋巴瘤。
3) PDCD4在人类某些肿瘤细胞系以及肿瘤标本中存在着明显的表达缺失JansenAP 等检测了 60种来自肾脏、肺脏、结肠、乳腺以及神经胶质细胞的肿瘤细胞系中PDCD4 的表达情况，结果显示在mRNA和蛋白水平PDCD4均有表达较低或缺失，但是PDCD4在 蛋白水平表达的缺失率明显高于RNA水平，提示人PDCD4也是一种抑癌基因。有资料显 示肺癌中PDCD4缺失率高达83%。而且PDCD4缺失与肿瘤的分化程度降低以及预后效果 不良密切相关；在胰腺癌中亦发现癌组织中的PDCD4表达与癌旁组织相比明显降低，由 且PDCD4的低表达与肿瘤的分化程度密切相关。
综上所述，PDCD4不仅具有抑制肿瘤生长的特点甚至有能够诱导某些肿瘤细胞再分 化的趋势，这些结果提示PDCD4在神经胶质瘤中也可能发挥重要作用，具有潜在的临床 应用价值。

发明内容
针对目前制备治疗胶质瘤基因药物的不足，本发明的目的是提供一种PDCD4重组农 达载体在制备治疗胶质瘤药物中的应用。具体地说是利用新型抑癌基因PDCD4对胶质船 细胞生长抑制的特点，通过构建获得PDCD4重组表达载体，进而制备治疗胶质瘤的药物， 充分利用其自身抑癌基因的特点，使PDCD4在胶质瘤细胞中高效表达，实现治疗恶性胶 质瘤的目的。
本发明所述PDCD4重组表达载体在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
其中所述PDCD4重组表达载体是PDCD4基因与病毒性载体或非病毒性载体构建的重
组表达载体；进一步优选PDCD4重组表达载体是PDCD4基因与病毒性载体构建的重组表达载体。
上述PDCD4基因包含人PDCD4基因cDNA全长编码序列；所述病毒性载体优选是腺病毒 或慢病毒，其中病毒性载体中最优选使用的是腺病毒；所述非病毒性载体优选是质粒。 本发明的技术方案是基于申请人的前期研究，在前期研究中申请人发现PDCD4不 仅能够抑制人神经胶质瘤细胞的恶性增殖，而且具有诱导肿瘤细胞向正常细胞再分化的 趋势；同时发现PDCD4蛋白在人原发性神经胶质瘤中的缺失率髙达8(W左右，初步的临床 追踪调査发现PDCD4表达与病人预后好转有关。申请人还发现PDCD4可抑制肿瘤细胞的 增殖，并具有诱导肿瘤细胞再分化的趋势将PDCD4重组表达载体体外瞬时转染PDCD4缺 失的恶性神经胶质瘤细胞系-U251， 48小时后细胞的生长受到明显的抑制，令研究者兴 奋的是细胞出现向正常胶质细胞再分化的趋势，细胞周期分析显示G2-M期细胞的数量明 显减少。这些结果提示PDCD4在神经胶质瘤中的再分化中可能发挥重要作用，具有潜在 的临床应用价值。申请人通过构建PDCD4重组病毒转染外肿瘤细胞后使其高表达PDCD4 后，通过细胞周期、肿瘤侵袭性、集落形成率、分化程度特异性标志(GFAP)等的检测 及体内肿瘤生长速率的动态观察等，不仅进一步证实PDCD4对肿瘤的抑制作用，而且为 应用PDCD4治疗肿瘤及其药物开发提供强有力的实验依据，具有重大的理论价值和良好 的应用前景。
本发明所述PDCD4重组表达载体在制备治疗胶质瘤药物中的应用及效果验证，具体 方法是
(1) 根据目的基因相关信息(序列，序列号等)，构建含有外源基因的重组表达载
体；
(2) 对于测序正确的重组质粒，提取和纯化髙质量的不含内毒素的重组质粒； 例如以正常人血细胞mRNA为模板，合成含有PDCD4的质粒载体或以其为模板通过
PCR获得目的基因，将目的基因定向克隆至病毒穿梭质粒构建阳性重组PDCD4，筛选阳 性克隆，测序正确后，提纯和纯化高质量的不含内毒素的PDCD4重组病毒载体；
(3) 使用高效重组载体和病毒包装质粒共转染293T细胞，进行病毒包装扩增，获 得重组病毒颗粒；
(4) 收集病毒液；浓縮、纯化病毒液；
(5) 用高纯度的病毒液感染肿瘤细胞，以肿瘤生物学研究指标检测肿瘤细胞的生 存情况；
(6) 通过定量PCR精确测定病毒滴度(高精确滴定方法)和Western分析实验结果；
(7) 用高滴度的病毒液感染宿主细胞；检测基因功能以及使用药物进行稳定转染 细胞株的筛选。
上述肿瘤生物学研究指标主要包括肿瘤细胞的生长周期、肿瘤细胞分化和肿瘤细胞 的侵袭与转移以及肿瘤细胞的凋亡等。
试验证实通常状况下，筛选的细胞克隆株具有长期的表达稳定性。
本发明应用新型抑癌基因PDCD4重组表达载体治疗恶性胶质瘤，经试验证明使用 PDCD4表达载体转染胶质瘤细胞能够明显抑制胶质瘤细胞的生长。
所产生的积极效果是(1)具有抑制胶质瘤细胞的生长周期(见图1)、集落形成 (见图4)能力和肿瘤细胞的侵袭与转移力，促进胶质瘤细胞的凋亡(见图2)，诱导 胶质瘤细胞分化(见图3),对动物模型体内的胶质瘤也同样具有良好的抑制效果；(2) 重组病毒的获得使其治疗肿瘤的疗效更佳，不仅可以使PDCD4在肿瘤细胞内高效表达， 而且有利于更好地发挥其自身抑癌基因的特点，提高患者的生存率和生存质量，从而改 善其预后。提示PDCD4重组病毒制备治疗胶质瘤的基因药物在临床中的应用将是一种值 得关注的治疗方案，对于其药物开发提供强有力的实验依据，具有重大的理论价值和良 好的应用前景。
本发明的研究表明使用PDCD4重组表达载体转染肿瘤细胞，不仅能够高效转导肿瘤 细胞,而且在体内能实现目的基因稳定的长期表达,且反复应用不易引起免疫反应，提髙 了基因治疗的有效性及安全性。病毒在宿主细胞内，能以病毒RNA为模板在自身反转杀酶 (RT)的作用下合成cDNA,再以此cDNA为模板合成双链DNA,经环化后通过病毒整合酶(IN) 作用整合在宿主细胞的染色体上并长期表达。因此，以病毒基因组为基础除去其复制所 需要的基因而代之以治疗基因和选择性标记物,构建而成的病毒载体具有转移基因片段 容量大、不易诱发宿主免疫反应、安全性较好、不仅能感染分裂细胞最大特点是还能用 于感染不分裂细胞如神经细胞、造血干细胞、肌纤维细胞和肝细胞等；稳定整合于IE细 胞的基因组,治疗基因表达时间长，在基因治疗中具有广泛的应用前景，其临床应用前 景更优。
本发明提供了高效表达治疗胶质瘤并含有新型抑癌基因PDCD4的重组表达载体和釆 用该重组表达载体进行制备治疗胶质瘤药物的方法。迄今为止，尚未有应用携带该基因 的重组表达载体治疗胶质瘤的研究报告。
本发明通过将编码PDCD4基因的核苷酸序列插入重组表达载体基因组中，制备冶疗 胶质瘤的化学药物，使其在肿瘤细胞内高效表达，用以治疗脑恶性肿瘤，并抑制脑恶性 肿瘤的生长以及转移。此方法有望应用于恶性胶质瘤的临床治疗，改善患者的预后，提 高患者的生存率，延长患者的生存时间。


图l:示PDCD4表达载体转染胶质瘤细胞后明显抑制细胞生长，使细胞生长阻滞在S 期，而G2-M期明显降低，抑制率为57.87%。
图2:示PDCD4表达载体转染胶质瘤细胞后明显抑制细胞生长，使细胞发生凋亡，凋 亡率为12%。
图3:示PDCD4表达载体转染胶质瘤细胞后明显抑制细胞生长，使细胞数量明显减少， 形态发生明显改变。
图4:示PDCD4表达载体转染胶质瘤细胞后明显抑制细胞克隆形成，使肿瘤细胞爽隆 数明显减少。
具体实施例方式
本发明的试验中优选使用的重组表达载体是病毒性载体(购自武汉大学病毒所、 病毒性载体中优选使用的是腺病毒 1.构建和生产PDCD4重组腺病毒
(1)腺病毒表达载体的构建 1) PDCD4基因克隆入pMD-18T质粒根据PDCD4的cDNA序列(包括信号肽)设计一 对特异性寡核苷酸引物，上游引物序列为-5'-CTGAGCACATATGATGAATCAAACTGCGATTCTGAT-3'，下游引物序列为 5'-GAGGATCCTTAAGGAGATCTTTTAGACATTTC-3'。以噬菌体人肺cDNA文库为模板，使用 上述上、下游引物，用Pyrobest高保真DNA聚合酶扩增目的基因PDCD4。 PCR参数是94 'C， 30 s; 53 'C， 1 min: 72 。C， 1 min， 30个循环。W琼脂糖凝胶电泳回收PCR 产物。用T4连接酶在合适的缓冲液中连接pMD-18T与回收片段16'C、 lh。连接产物转 化DH5a，在Amp+LB平板上37'C培养12h。挑取阳性克隆，经HindIII和XbaI双酶切鉴
定。正确克隆命名为pMD-18T/PDCD4。
2)将PDCD4基因亚克隆入穿梭载体将质粒pMD-18T/PDCD4和pAdTrack-CMV-p38 分别经HindIII和XbaI双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶回收，回收产物用 T4DNA连接酶于16'C过夜连接后再转化感受态DH5a菌。在Kana+LB平板上37"C培养20 h,挑取较小的阳性克隆。经HindIII和XbaI双酶切鉴定正确后命名为 pAdTrack-CMV/PDCD4。
3)BJ5183大肠杆菌感受态细胞的制备取冻存的大肠杆菌BJ5183菌液1 w l分 别稀释到lmlLB中，再从中取10nl，铺AMP+的LB平板，置37'C温育过夜。取出LB平 板，分别挑取单克隆于5mlLB中，37'C, 220r/min，震荡培养4h。分别取菌液lml 加入100ralLB细菌培养液中，37"C震荡培养至D60(^0.3时，将细菌分装到无菌的、冰 预冷的50ml聚丙烯管中，在冰上放置10min,使培养物冷却至0r。4'C, 4000r/min, 离心10min;弃上清。分别加入4'C预冷的0. lmol/LCaCl210ml,混匀，冰上放置约30 min。 4'C, 4000r/min,离心10min,弃上清。分别加入4'C预冷的0. lmol/LCaCl22 ml, 混匀，置4'C过夜。加入10%无菌甘油，混匀，置冰上分装于EP管中，-80'C冻存备 用。
(2) 细菌内同源重组产生重组腺病毒 质粒取lugpAdTrack-CMV/PDCD4用Pmel线性化后，1%琼脂糖凝胶电泳分离，切
胶回收目的片断。挑取冻存的己含pAdEasy-l的BJ5183菌,用CaCl2法制备高效感受态， 再将lu g线性化pAdTrack-CMV/PDCD4转入含有pAdEasy-1的BJ5183菌；取适量的细胞 在Kana+的平板中，37'C培养16-20h;挑取阳性克隆，抽提质粒鉴定后再转入DH5a 菌中。重组病毒质粒命名为pAd/PDCD4。用PacI对pAd/PDCD4重组病毒质粒进行酶切 鉴定。
(3) 重组腺病毒载体在HEK293细胞的包装和扩增 从转化入pAd/PDCD4重组质粒的DH5 a菌中提取质粒DNAIO y g，用PacI酶切使之
线性化，同时切去Kan和Ori等载体构件，暴露反转录末段重复序列。酶切产物加入 1/10体积的3mol/L冷NH4Ac与2.5倍体积的无水乙醇，-20'C沉淀DNA, 4'C进行 11000r/min离心20min,弃上清；加入75%冷乙醇溶液，离心洗涤2次，每次5rain,弃 上清；空气干燥，加入ddH20溶解DNA并定量。培养HEK293细胞，按照厂家说明用 Polyfect进行细胞转染，2d后用荧光显微镜进行观察。7-10d后收集细胞，离心沉淀 后在37'C/-80'C条件下反复冻融4次，4'C、 7000 g离心5min，取部分病毒上清再次 感染HEK293细胞以扩增重组病毒。
(4) 重组腺病毒的鉴定 重组病毒Ad/PDCD4的鉴定取病毒上清2n 1,煮沸10min以制备病毒基因组DNA。
以重组病毒基因组DNA为模板，以扩增PDCD4的上、下游引物按前述条件进行PCR反应。 2.体外实验通过PDCD4重组病毒感染人胶质瘤细胞系，研究PDCD4表达或过表达 对胶质瘤的生长、再分化的影响
■ PDCD4重组腺病毒转染胶质瘤细胞系
将胶质瘤细胞株U251细胞置于DMEM培养液(含1(^小牛血清)中，在37'C、 5%C02 的水饱和条件下孵箱内培养，常规更换培养液，消化传代。实验用细胞均处于对数 生长期。细胞U251以2X105接种于6cm培养皿，在5")6C0237'C条件下培养24h后换以新
鲜培养液，根据需要分别加入200iil的重组腺病毒悬液(100 M0I)继续培养24h后， 换以新鲜培养液，培养72h后在荧光显微境下观察GFP基因的表达。 ■用RT-PCR和Western blot方法检测PDCD4在转染后人胶质瘤细胞系(购自中国科 学院上海细胞库)中的表达-.
用Trizol—步法按说明书分别提取细胞总RNA,以32磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH) 作为内参照，采用半定量RT-PCR分析PDCD4mRNA的表达。引物序列如下PDCD4上游 引物5' TGG CAC TCT GCT TGC TCA CC 3， ， PDCD4下游引物:5， CTC ATC CAC AAT GCCCGTCT3'，产物长度为179bp;内参照GAPDH的序列，上游引物5， TGG GGA AGG TGA AGG TCG GA 3,,下游引物5， GGG ATC TCG CTG CTC GAA GA 3，，产 物长度为673bp。 PCR产物经2W琼脂糖凝胶系统电泳(含0.5g/L溴化乙啶)，用 GDS28000凝胶成像分析系统拍照鉴定，图像分析软件定量分析。
Western印迹检测PDCD4蛋白的表达用含有蛋白酶抑制剂的细胞裂解溶液裂解 收集的细胞，经BCA蛋白质浓度测定试剂盒进行蛋白质定量。等量的细胞总蛋白(IO ug/泳道)上样进行电泳[12X十二垸基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)]， 一抗采用美国L'pstate公司兔抗PDCD4抗体('i : 2000)和兔抗GAPDH(1 : 5000), 二抗 采用美国Sigma公司抗兔IgG2辣根过氧化物酶(服P)(1 : 5000)。最终用以色列 Biological indust ries公司EZ-ECL荧光底物试剂盒曝光显影。
■ OLYMPUS 1X71-F22FL/PH荧光倒置显微镜观察PDCD4在转染前后人胶质瘤细胞系
生长、分化的形态学变化
结果如图3示PDCD4表达载体转染胶质瘤细胞后明显抑制细胞生长，使细胞数量 明显减少，形态发生明显改变。
■免疫细胞化学检测胶质瘤细胞表面特异性标记因子GFAP等的变化，确定细胞的 分化程度-.
采用S-P法，鼠抗人GFAP单克隆抗体(l : IOO)及试剂盒均为DAKO公司产品，阴 性对照采用PBS代替一抗进行反应，以胞浆内出现明确棕黄色为阳性结果。 ■流式细胞术分析PDCD4转染后人胶质瘤细胞系细胞凋亡与细胞周期的变化情况
取lX10e个细胞，以1000r/min的转速离心5min，弃上清。加入2 ml冷的柠檬 酸固定液轻轻振荡使细胞悬浮，应用流式细胞术检测细胞凋亡率。结果如图l示 PDCD4表达载体转染胶质瘤细胞后明显抑制细胞生长，使细胞生长阻滞在S期；图2 示PDCD4表达载体转染胶质瘤细胞后明显抑制细胞生长，使细胞发生凋亡。
■ TransWell实验观察PDCD4转染后人胶质瘤细胞浸润、细胞侵袭能力的变化情 况
应用24孔Transwell进行侵袭实验，设对照组和实验组，每组重复三孔。聚碳 酸脂微孔滤膜上铺Matrigel胶50iU/孔(于4'C融解Matrigel,用无血清DMEM按l : 3 的比例稀释)。在上室孔中加入细胞2乂104个/孔(无血清培养基的单细胞悬液)，下 室中加入趋化因子600u1,孵育24h，将Transwell上室的附着细胞用湿棉签擦去， 用甲醛室温下固定30rain， DAPI法染核，封片后显微镜(X40)下直接观察穿过膜的 细胞数。每张膜中央部分和周围部分各随机取5个视野，计数每个视野内的穿过8 lim微孔的细胞数，以每个视野的平均数表示肿瘤细胞的迁移能力，并拍照。 ■软琼脂集落形成实验观察PDCD4转染后人胶质瘤细胞系集落形成程度的变化情况
取50g/L琼脂凝胶l份，在5(TC条件下加9份预温的37'CDMEM培养液，注入24孔板制 备底层琼脂，每孔0.8ml。制备质量分数为0.3%的琼脂(37'0,立即注入铺有底层琼脂 的24孔板中形成上层琼脂。取对数生长期细胞，胰蛋白酶消化制备细胞悬液、计数。常 规培养2周，每日观察克隆形成情况并计算克隆形成率克隆形成率(%)=克隆数/接种 细胞X 1009L结果如图4示PDCD4表达载体转染胶质瘤细胞后明显抑制细胞克隆形成， 使肿瘤细胞克隆数明显减少。
3.体内实验用PDCD4重组病毒感染人胶质瘤细胞系，在小鼠体内研究PDCD4表达 对神经胶质瘤生长和转归的影响
■皮下注射胶质瘤细胞系构建荷瘤小鼠模型
本实验使用的18只SPF级4 6周龄BALB/c雄性裸鼠由上海中科院动物中心提供。 在每只裸鼠右侧腋下接种2X1()5个U251细胞，定期测量肿瘤的直径，成瘤后将实验动物 随机分为3组①PBS对照组；②空载体对照组；③注射PDCD4重组腺病毒组。每组采用6 只裸鼠，分别瘤内注射PBS、空载体、PDCD4重组腺病毒。此后每周定期测量肿瘤的长径 和短径，计算肿瘤的体积。4周后无痛处死动物，分离皮下形成的肿瘤并称重。结果显示 PDCD4表达载体转染卵巢癌细胞后明显抑制肿瘤的生长。
权利要求
1、PDCD4重组表达载体在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
2、 根据权利要求l所述的应用，其特征在于所述PDCD4重组表达载体是PDCD4基因 与病毒性载体或非病毒性载体构建的重组表达载体。
3、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述PDCD4重组表达载体是PDCD4基因与病毒性载体构建的重组表达载体。
4、 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述PDCD4基因包含人PDCD4基因 cDNA全长编码序列。
5、 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于所述病毒性载体是腺病毒或慢病毒。
6、 根据权利要求5所述的应用，其特征在于所述病毒性载体是腺病毒。
7、 根据权利要求2所述的应用，其特征在于所述非病毒性载体是质粒。
全文摘要
本发明公开了一种PDCD4重组表达载体在制备治疗胶质瘤药物中的应用。本发明通过将编码PDCD4基因的核苷酸序列插入重组表达载体基因组中，制备治疗胶质瘤的化学药物，使其在肿瘤细胞内高效表达，用以治疗脑恶性肿瘤，并抑制脑恶性肿瘤的生长以及转移。本发明为抗癌药物开发提供强有力的实验依据，具有重大的理论价值和良好的应用前景。
文档编号A61K48/00GK101204583SQ20071011532
公开日2008年6月25日 申请日期2007年12月11日 优先权日2007年12月11日
发明者霞 张, 张利宁, 朱法良, 群 王, 王晓燕, 春 郭, 飞 高 申请人:山东大学