一种用于检测羊乳制品中牛乳含量的试剂盒及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种用于检测羊乳制品中牛乳含量的试剂盒及应用，属于食品安全技 术领域。
【背景技术】
[0002] 在一些发达国家，羊奶制品是乳制品市场的高端产品，消费对象主要是一些高收 入的家庭。虽然羊乳及其制品价格较高，但其市场占有率却一直居高不下。澳大利亚、新西 兰是重点的羊奶出口国家和地区。东南亚消费羊奶的地区主要在新加坡、马来西亚、香港和 台湾等地，以中国i的台湾省羊奶消费比较多，需求量也比较大，台湾人普遍认识到羊奶接 近母乳的优势，特别是台湾的婴幼儿配方羊奶粉已被广大父母接受，据调查，在经济能力较 高的白领阶层，给婴幼儿购买配方羊奶粉的比例达73. 3%。
[0003] 我国羊奶产业发展较晚，仅占据中国乳制品市场的较小份额，而且羊奶的资源相 对稀缺，主要集中在陕西、山东等地。由于羊奶产量的限制，不少企业无法进行大规模生产。 且乳山羊对生存环境的要求高于乳牛，所以在国际市场上山羊乳比牛乳普遍贵2-5倍。另 外，羊乳具有极高的医药价值、保健价值及养颜养肤价值，所生产的产品附加值也较高，更 减少了食用羊乳的用量，因此，全球羊乳价格比牛乳高的事实很难改变。但随着羊奶脱膻技 术的应用和广大消费者对羊奶营养价值的认同，羊乳制品有望在乳品市场上受到更多家庭 的欢迎。
[0004] 和牛奶相比，羊奶的营养价值更高，更容易消化，且不易引起婴儿过敏。乳牛适宜 圈养，喂人工饲料，而乳山羊适宜散养，以吃青草和干草为主，不喂人工饲料。奶山羊是一种 以整株草（包括根）为食的动物，在养殖方面会受到一定的限制，一些发达国家为了保护环 境和植被已经开始限制奶山羊的养殖。每年的3-10月为奶山羊的产奶期，所以产奶量不能 与奶牛相比。这些因素势必导致羊奶奶源比较稀少，价格较高。
[0005] 在羊奶粉的加工工艺中，为了获得高质量的蛋白质营养源，尤其在婴幼儿配方粉 的加工过程中，允许添加和使用脱盐乳清粉，这些成为羊乳制品中牛源性成分的来源，但我 国目前的羊奶粉概念模糊，对羊乳制品中的牛乳成分含量未作量化，由于牛乳价格较羊乳 便宜，一些不法分子以较高比例的牛奶粉掺入羊奶粉中来欺骗消费者以获取利益。
[0006] 目前有关于羊乳的标准就是2007年陕西省制定的《生鲜羊乳标准》和《全脂羊乳 粉、全脂加糖羊乳粉》的地方标准。该标准由陕西省乳品工业协会和陕西省产品质量监督检 验所共同提出。而在羊乳制品中的牛乳成分含量合理范围和羊乳制品中的牛乳成分的定量 检验等方面尚属空白。
[0007] 荧光定量PCR(FQ-PCR)，也称实时荧光定量PCR，简称荧光PCR。荧光定量PCR方法 的taqman探针法，反应体系具有更好的稳定性和重复性。该技术应用于动物源性成分的检 测已有报道，我国的出入境检验检疫系统根据该方法制定了检测肉骨粉中牛、羊源性成分 的行业标准。但国内在羊乳制品中的牛乳成分的定量检验这方面，尚属空白。
[0008] 不同物种都具有遗传上的独特性，该独特性体现在携带遗传信息的DNA分子上。 换言之，牛与羊之所以被认为是不同的、独特的物种，其根本原因是牛与羊都具有自身特性 的DNA序列。所谓特异性序列是指某物种的某些DNA序列为自然界其他物种所没有的。
[0009] 羊乳制品中本身细胞含量较低，据文献报道，乳制品在加工过程中，DNA片段会发 生断裂，由llOObp断裂成600bp左右，所以当检测对象中的目的动物源性成分含量很低时， 时常无法判定是否因为工艺的原因造成DNA的损失而导致阴性结果。
【发明内容】
[0010] 为解决现有技术的不足，本发明提供了一种用于检测羊乳制品中牛乳含量的试剂 盒，采用的技术方案如下：
[0011] 本发明的目的在于提供一种用于检测羊乳制品中牛乳含量的试剂盒，其特征在 于，包括内部对照基因的特异性引物、探针和牛的特异性基因的引物、探针；所述内部对照 基因的特异性引物是经过牛和羊的12SrRNA的同源性序列比对后设计得到；所述牛的特异 性基因的引物是针对牛的12SrRNA的部分核苷酸序列设计的。
[0012] 所述牛的12SrRNA的部分核苷酸序列如SEQIDNO. 7所示。
[0013] 所述内部对照基因的特异性引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示， 探针的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示；牛的特异性基因的引物核苷酸序列如SEQIDNO. 4 和SEQIDNO. 5所示，探针的核苷酸序列如SEQIDNO. 6所示。
[0014] -种检测羊乳制品中牛乳含量的方法，其特征在于，提取样品DNA，利用权利要求 1所述内部对照基因的特异性引物及探针和牛的特异性基因的引物及探针进行FQ-PCR扩 增反应，检测羊乳制品中牛乳的含量。
[0015] 所述方法步骤如下：
[0016] 1)采集牛乳对照用物质及待检羊乳样品，冷冻干燥，配制含有不同牛乳含量的羊 乳样品作为标准品，提取标准品和待检羊乳样品的DNA ;
[0017] 2)以步骤1)所得标准品DNA为模板，利用内部对照基因的特异性引物和探针进行 FQ-PCR扩增反应，同时利用牛的特异性基因的引物和探针进行FQ-PCR扩增反应；所述内部 对照基因的特异性引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1和SEQIDNO. 2所示，探针的核苷酸序 列如SEQIDNO. 3所示；
[0018] 3)以步骤1)所得待检羊乳样品的DNA为模板，利用权利要求1所述内部对照基 因的特异性引物和探针进行FQ-PCR扩增反应，同时利用权利要求1所述牛的特异性基因的 引物和探针进行FQ-PCR扩增反应；所述牛的特异性基因的引物核苷酸序列如SEQ ID NO. 4 和SEQ ID NO. 5所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO. 6所示；
[0019] 4)通过步骤3)和步骤4)的FQ-PCR扩增反应获得标准品与待检样品的内部对照 基因的ct值和牛特异性基因的Ct值，求得标准品与待检样品的ACt值；所述ACt值为内 部对照基因Ct的值和牛特异性基因C的t值之差；
[0020] 5)以标准品浓度的对数值为横轴，以标准品的ACt值为纵轴，绘制标准曲线，获 得标准曲线方程，根据标准曲线方程计算待检羊乳样品中含牛乳的百分含量。
[0021] 所述FQ-PCR扩增反应，采用两步法，具体程序设定为：预变性95°C30s，1个循环； 扩增 95°C30s，60°C35s，45 个循环。
[0022] 所述FQ-PCR扩增反应，可以采用三步法，采用三步法时，利用内部对照基因的特 异性引物和探针进行FQ-PCR扩增反应时退火温度为47-5rC，利用牛的特异性基因的引物 和探针进行FQ-PCR扩增反应时，退火温度为49-51°C。
[0023] 所述FQ-PCR扩增反应，内部对照基因对应的扩增产物长度为121bp;牛特异性基 因对应的扩增产物长度为142bp。
[0024] 所述方法具体步骤如下：
[0025] 1)采集牛乳对照用物质及待检羊乳样品，冷冻干燥，配制含有不同牛乳含量的羊 乳样品作为标准品，提取标准品和待检羊乳样品的DNA;
[0026] 2)以步骤1)所得标准品DNA为模板，利用内部对照基因的特异性引物和探针进行 FQ-PCR扩增反应，同时利用牛的特异性基因的引物和探针进行FQ-PCR扩增反应，获得内部 对照基因对应的扩增产物长度为121bp，牛特异性基因对应的扩增产物长度为142bp;所述 FQ-PCR扩增反应，采用两步法，具体程序设定为：预变性95°C30s，1个循环；扩增95°C30s， 60°〇358,45个循环；所述内部对照基因的特异性引物核苷酸序列如5￡〇10勵.1和5￡〇10 NO. 2所示，探针的核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示；
[0027] 3)以步骤1)所得待检羊乳样品的DNA为模板，利用权利要求1所述内部对照基 因的特异性引物和探针进行FQ-PCR扩增反应，同时利用权利要求1所述牛的特异性基因的 引物和探针进行FQ-PCR扩增反应，获得内部对照基因对应的扩增产物长度为121bp，牛特 异性基因对应的扩增产物长度为142bp;所述FQ-PCR扩增反应，采用两步法，具体程序设定 为：预变性95°0 3〇8，1个循环；扩增951：3〇8,6〇1：358,45个循环；所述牛的特异性基因的 引物核苷酸序列如SEQIDNO. 4和SEQIDNO. 5所示，探针的核苷酸序列如SEQIDNO. 6 所示；
[0028] 4)通过步骤3)和步骤4)的FQ-PCR扩增反应获得标准品与待检样品的内部对照 基因的Ct值和牛特异性基因的Ct值，求得标准品与待检样品的ACt值；所述ACt值为内 部对照基因Ct的值和牛特异性基因C的t值之差；
[0029] 5)以标准品浓度的对数值为横轴，以标准品的ACt值为纵轴，绘制标准曲线，获 得标准曲线方程，根据标准曲线方程计算待检羊乳样品中含牛乳的百分含量。
[0030] 本发明所述方法应用于检测羊乳制品中牛乳的含量。
[0031] 本发明针对牛和羊目的区域分别设计相应的引物与探针。再通过实验后显示的不 同荧光信号（有无及强弱）来判断样品中的特异性成分。
[0032] 本发明通过FQ-PCR中的比较Ct值法（即ACt值法）对结果进行分析，该方法是 同时扩增待测靶基因片段和一个作为内部对照的基因片段（内源性管家基因片段）。根据 PCR扩增反应的原理，前提是假设每个循环增加一倍的产物数量，在PCR反应的指数期得到 Ct值来反应起始模板的量，一个循环（Ct= 1)的不同相当于起始模板数2倍的差异，通过 数学公式来计算相对量，通过内部对照基因校准目标基因可以弥补样本组织量的差异。比 较不同待测标本DNA的ACt值与正常标本DNA的ACt值的变化，即可对未知标本靶基因 的原始拷贝数作出判断。
[0033]目前对羊乳中牛乳成分的检测方法依据检测基础有两类：
[0034] 1.以脂肪组成为基础的检测方法。
[0035] 在羊乳和牛乳的脂肪中都含有较高的低分子量脂肪酸，并且大多数含有偶数碳原 子，其中以C10:0直链脂肪酸含量的差别最为显著。以此为基础，可以检测羊乳产品中掺 入的牛乳。利用色谱定量分析游离脂肪酸的方法，仅可以分析在5%~