专利名称：一种牛乳中a-乳白蛋白含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种分析检测乳中蛋白的方法，特别是一种检测牛乳 中a-乳白蛋白含量的方法。属于分析技术领域。
背景技术：
目前，国内没有oc -乳白蛋白含量的检测方法的国家标准和行业 标准。国内相关标准有GB/T 5413. 2 - 1997婴幼儿配方食品和乳粉-乳清蛋白的测定。国外，相关国标有DIN-10466 - 2001牛奶和牛奶 制品的全部蛋白中乳清蛋白含量的测定、DIN-10470 -1999牛奶和牛 奶制品的全部蛋白质中乳蛋白含量和酪蛋白含量测定、DIN - 10472 -1996牛奶和乳制品总蛋白量中乳蛋白和酪蛋白成分量测定.电泳 法。常用a -乳白蛋白的检测方法是液相色谱法。该方法试验步骤较 繁杂，检测到出结果时间需3-4h。毛细管电泳仪是一类包括电泳、 色谱及其交叉内容的液相微分离技术，它能快速精确检测出牛奶中的 掺假成分、抗生素、添加的功能性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、 糖、添加剂和其他小分子的含量。该方法操作筒便、准确，检测到出 结果时间^义为lh左右。目前，毛细管电泳4义的应用前景非常广泛。许多国际官方权威机构，如FDA、 U.S. P、 CBER、 CDER等均已认可毛细管电泳方法。权 威机构European Pharmacopoeia中认可勒沃卡-贝斯庭盐酸盐中杂 质的CE测定；欧洲药典中还认可促红细胞生成素(EP0)的CE测定 等。它已成为化学、农业、医学、生物工程、药学等众多领域的一个 常规科研工具。发明内容本发明的目的是得到一种牛乳中a-乳白蛋白含量的检测方法。本发明的一种检测a-乳白蛋白含量的检测方法，其中，包括如 下步骤1)将a-乳白蛋白溶于样品緩冲液，制备得到多个不同含量 a-乳白蛋白的标准溶液，并对多个溶液分别4企测后得到a-乳白蛋白 含量与检测结果之间的标准曲线；2)对样品进行检测，并得到检测 结果；3)将所述的检测结果与所述的标准曲线比对，得到样品中a-乳白蛋白的含量；其中，检测样品的设备是高压毛细管电泳分析仪。上述步骤1)中标准曲线的制定的方法如下配制a-乳白蛋白标 准溶液，在样品緩冲液中溶解a-乳白蛋白标准物质配制成分别为 lmg/ml 、 0.5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0.05mg/ml,制备4寻到 标准溶液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析，得到检测结果，即得到 a-乳白蛋白含量与平均校正因子的关系曲线；其中，所述的检测结果 按照如下方法计算按峰面积计算出平均校正因子。将样品与緩冲液按照l: 4-10的比例加入冻存管，并摇匀，精确提取 40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机l~10min,使用 毛细管电泳仪测定。上述的样品緩冲液为能够使蛋白质分散的緩冲 液，优选如下緩冲液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩冲液中加40 m mol/L 3-吗啉代 丙烷石黄酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，处理样品时添加 5ul/ml的P-巯基乙醇，曱基羟乙基纤维素0. 4%。使用O. IM氢氧化 钠调至pH值为8.5。上述的摇匀步骤采用旋涡混合器。上述高压毛细管电泳分析的使用检测参数如下毛细管电泳检测 检测的温度控制在20-4(TC之间，毛细管柱直径25 ~ 75 ii m、长度 20~ 600 mm, DAD (或紫外光)检测器，压力进样(或电动进样)，压 力为0 lpsi，进样时间为ls 20s，分离温度为20~40°C,工作电 压为15~30 kV。上述的毛细管柱为石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。 上述的高压毛细管电泳分析的检测时电泳模式为区带电泳，其电 泳緩冲液为pH3. 0~8. 0,主要成分为无机盐緩冲液，优选磷酸盐、 硼酸或柠檬酸。上述的4全测结果的处理方法如下检测结果为样品分离的图谱， 运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓 度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。常乳里a -乳白蛋白含量O. 8g~2g/L，质量百分比约O. 2%。毛细管电泳仪检测限制浓度l 0—5 ~ 1 (T8 mo 1 /L。所以毛细管电泳仪能检测 出其含量。使用毛细管电泳仪开发检测a-乳白蛋白含量的方法包括 样品性质的了解、分离模式、建立緩冲体系、优化緩冲体系和换分离 模式等步骤。本发明使用毛细管电泳仪能准确测定a-乳白蛋白的含量，从而应 用于产品开发、质量控制和分析检测领域中。本发明在在传统的电泳和色谱的原理的基础上，使用高压毛细管 电泳仪检测a-乳白蛋白的含量，达到准确检测出乳制品中a-乳白蛋 白的含量。通过试-验，最终确定检测方法的最佳^t条件。具体如下 检测a-乳白蛋白含量的检测方法，包括样品前处理、上样检 观'J，还包括校准读数等步骤。毛细管电泳检测检测的温度控制在 30 40。C之间，毛细管柱直径50 75um、长度50 ~ 600 mm的石英 毛细管柱，DAD (或紫外光)检测器，压力进样，压力为0.5psi， 进样时间为5s 10s,分离温度为30~40°C,工作电压为25 kV。 检测步骤为把原料奶样品装入15ml的离心管中，在3000r/min离心条件下 离心10min。准确提取样品100ul置入冻存管。提取400ul样品緩 冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩涡混合器混匀。精确提取 40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，使用毛细 管电泳仪测定。样品定量读数:才艮据样品分离的图谱,运用毛细管电泳仪所带的 分析软件，积分各峰高(或峰面积)，计算出试样浓度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。 有益效果目前，国内毛细管电泳仪检测技术逐渐应用到乳品领域里，如产品开发和控制质量问题等领域中。但毛细管电泳技术尚未开发^r测a-乳白蛋白的方法。本发明成功弥补了乳品领域中的缺点，能准确测定 a-乳白蛋白的含量，从而有利于产品开发和质量控制当中。本发明是样品在毛细管电泳仪上跑电泳，从而毛细管色语系统检 测出样品的吸光值，以图语的形式表达出来，从而能准确检测出a-乳白蛋白的含量，为产品研发、质量控制和分析成分提供技术支持。本发明方法现行回归方程相关系数〉0. 99，其线性范围在 0. Olmg/ml ~ 2mg/ml ,最低4企出线为0. 04ng ,最低检出浓度为 0. 001mg/ml。精确度达90%以上，柱子回收率达到90%以上，冲羊品回 收率达70%以上。能有效^f企测出奶样中的a-乳白蛋白的含量。
具体实施方式
实施例1 一种牛乳中a-乳白蛋白含量的检测方法毛细管电泳温度控制在30。C，使用直径为50um、长度为600咖 的石英毛细管柱，DAD4全测器，进样压力为0. 5psi,进样时间为5s, 工作电压为25 kV。校准曲线的制定利用a-乳白蛋白标准品配制浓度分别为 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml的标准溶液。 摇匀后使用高压毛细管电泳分析，积分后的封面积分别为282154、 140793、 66924、 16810、 3520，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为0.9993，最低检出线为0. 08ug,最低检出含量为 0. 02mg/ml，标准样品回收率达94%。处理样品緩冲液配置方法160 m mol/L三曱基氨基甲烷緩冲 液中力口40 m mol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二 钠，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的巯基乙醇，曱基羟 乙基纤维素0. 5%， pH值为8. 5。电泳緩冲液的配置方法0. 32 mol/L柠檬酸，20 m mol/L柠檬 酸三钠，7 mol/L尿素，羟丙基曱基纤维素0. 5%。才企测步-骤为把奶样品加入15ml的离心管中，在5000r/min 离心条件下离心10min。准确提取样品100ul置入冻存管(或其他 容器)。提取400ul样品緩冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用 旋涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超 声波清洗机3min,之后使用毛细管电泳仪测定。样品定量读数:根据样品分离的图语，运用毛细管电泳仪所带的 分析软件，积分a-乳白蛋白的峰面积为24186,利用分析软件自动套 入标准曲线方程内计算出试样浓度为0. 17mg/ml,再乘稀释倍数5， 即得实际浓度为0. 85mg/ml,所以该奶样含有的a-乳白蛋白浓度为 0. 85g/L。实施例2 —种牛乳中a-乳白蛋白含量的检测方法毛细管电泳温度控制在4(TC,使用直径为75um、长度为50mm 的石英毛细管柱，DAD检测器，进样压力为0. 5psi，进样时间为10s， 工作电压为25 kV。校准曲线的制定利用a-乳白蛋白标准品配制浓度分别为 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml的标准溶液。 摇匀后使用高压毛细管电泳分析，积分后的封面积分别为292457、 151022、 71042、 18245、 3700,利用软件得出标准曲线，线性回归 相关系数为0.9982,最低检出线为0. 09ug,最低检出含量为0. 025mg/ml，标准4羊品回收率达93%。处理样品緩沖液配置方法160 m mol/L三甲基氨基甲烷緩冲 液中加40 m mol/L 3-吗啉代丙烷石黄酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的0 -巯基乙醇，曱基羟乙基纤 维素0. 4%。使用0. 1M氢氧化钠调至pH值为8. 5。电泳緩冲液的配置方法0. 32 mol/L柠檬酸，20 m mol/L柠檬 酸三钠，6 mol/L尿素，羟丙基曱基纤维素0.4%。检测步骤为把奶样品加入15ml的离心管中，在2000r/min 离心条件下离心10min。准确提取样品100ul置入冻存管(或其他 容器)。提取400ul样品緩冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用 漩涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超 声波清洗机3min,之后使用毛细管电泳仪测定。样品定量读数:根据样品分离的图谱,运用毛细管电泳仪所带的 分析软件，积分a-乳白蛋白的峰面积为29865,利用分析软件自动套 入标准曲线方程内计算出试样浓度为0. 21mg/ml，再乘稀释倍数5， 即得实际浓度为1.05mg/ml,所以该奶样含有的a-乳白蛋白浓度为1. 05g/L。
权利要求
1. 一种检测a-乳白蛋白含量的检测方法，其特征在于包括如下步骤1)将a-乳白蛋白溶于样品缓冲液，制备得到多个不同含量a-乳白蛋白的标准溶液，并对多个溶液分别检测后得到a-乳白蛋白含量与检测结果之间的标准曲线；2)对样品进行检测，并得到检测结果；3)将所述的检测结果与所述的标准曲线比对，得到样品中a-乳白蛋白的含量；其中，检测样品的设备是高压毛细管电泳分析仪。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤l)中 标准曲线的制定的方法如下配制a-乳白蛋白标准溶液，在样 品緩冲液中溶解a-乳白蛋白标准物质配制成分别为lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 05mg/ml，制备得到标准溶 液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析，得到检测结果，即得到 a-乳白蛋白含量与平均校正因子的关系曲线；其中，所述的检测 结果按照如下方法计算按峰面积计算出平均校正因子。
3. 如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述的标准溶 液或待;险测样品的处理方法为4巴标准溶液或待;险测样品装入离 心管中，在2000-5000r/min离心条件下离心5-15min，将样品 与緩冲液按照1: 4-10的比例加入冻存管，并摇匀，精确提取 40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机1 ~ 10min， 使用毛细管电泳仪测定。
4. 如权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于:,所述的样品緩 冲液为能够^f吏蛋白质M的緩冲液，优选如下緩冲液160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩冲液中加40 m mol/L 3-吗啉代 :丙烷磺酸，60咖ol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，处理样品时 添加5ul/ml的P-巯基乙醇，曱基羟乙基纤维素0.4%,使用 0, 1M氬氧化钠调至pH值为8. 5。
5. 如权利要求2或3所述的检测方法，其特征在于所述的摇匀步 骤采用凝涡混合器。
6. 如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述高压毛细 管电泳分析的使用检测参数如下毛细管电泳检测检测的温度控 制在20 40。C之间，毛细管柱直径25 75ixm、长度20 600 mm, DAD (或紫外光)检测器，压力进样(或电动进样)，压力为0~ lpsi,进样时间为ls 20s,分离温度为20~40°C,工作电压为 15~30 kV。
7. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述的毛细管柱为 石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。
8. 如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述的高压毛 细管电泳分析的4企测时电泳模式为区带电泳，其电泳緩冲液为 pH3. 0~8. 0,主要成分为无机盐緩冲液，优选磷酸盐、硼酸或 柠檬酸。
9. 根据权利要求2中所述的检测方法，其特征在于所述的检测结 果的处理方法如下^r测结果为样品分离的图i普，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓度,再乘稀 释倍数，即得实际浓度。
全文摘要
本发明涉及一种检测乳中成分的方法，特别是一种检测a-乳白蛋白含量的检测方法。属于分析技术领域。本发明毛细管电泳仪检测a-乳白蛋白含量的检测方法，包括样品前处理、上样检测，还包括校准读数等步骤。本发明是样品在毛细管电泳仪上跑电泳，从而毛细管色谱系统检测出样品的吸光值，以图谱的形式表达出来，从而能准确检测出a-乳白蛋白的含量，为产品研发、质量控制和分析成分提供技术支持。
文档编号G01N33/02GK101281203SQ20081008898
公开日2008年10月8日 申请日期2008年4月11日 优先权日2008年4月11日
发明者刘卫星, 孙国庆, 康小红, 胡新宇 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司