专利名称：一种检测人乳中免疫球蛋白IgA含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种分析检测人乳中蛋白的方法，特别是一种检测人乳中免疫球蛋白IgA含量的方法，属于检测技术领域。
背景技术：
人免疫球蛋白IgA是人体血清免疫球蛋白的重要成分之一，在正常人血清中的含 量仅次于IgG，占血清免疫球蛋白含量的10 20%。相对分子量为160KDa或320KDa。IgA 按其免疫功能分为血清型及分泌型两种。血清型IgA存在于血清中，其含量占总IgA的85 % 左右，具有IgG和IgA的某些功能。分泌型IgA存在于分泌液中，如唾液、泪液、初乳、鼻和 支气管分泌液、胃肠液、尿液、汗液等，是机体粘膜局部抗感染免疫的主要抗体，具有抗粘膜 感染功能。IgA不能通过胎盘，新生儿血清中无IgA抗体，但可从母乳中获得分泌型IgA，人 乳中含量为0. 5-2g/L，新生儿出生4 6个月后，血中可出现IgA。目前，国内外检测人免疫球蛋白IgA主要方法为ELISA法、蛋白芯片和SDS电泳 法。这些方法均有操作复杂、时间较长、准确度低等缺点。鉴于以上方法的缺点，本专利发 明了将利用毛细管电泳快速检测人免疫球蛋白IgA含量的方法。毛细管电泳仪是一类包括 电泳、色谱及其交叉内容的液相微分离技术。方法操作简便、准确，检测到出结果时间仅为 Ih左右。现有技术《毛细管电泳法快速测定保健食品中免疫球蛋白G》，王茜，《分析化学研 究简报》，2006年8月34卷，1161-1164，公开了一种类似于本发明的测试方法，但其检测方 法检测人乳中免疫球蛋白IgA得到的结果具有较低的检出率，同时使用的设有涂层的毛细 管极大地增加了测试的成本。
发明内容
本发明提供了一种人乳中免疫球蛋白IgA含量的检测方法，实现快速，准确的检 测人乳中的免疫球蛋白IgA含量。本发明还提供了一种人乳中免疫球蛋白IgA含量的检测方法，解决了现有技术用 于人乳免疫球蛋白IgA含量检测中出现的检出率偏低的问题。本发明还提供了一种人乳中免疫球蛋白IgA含量的检测方法，使用的样品缓冲液 可以有效地分散人乳中免疫球蛋白IgA。本发明还提供了一种人乳中免疫球蛋白IgA含量的检测方法，省去了测试过程中 使用设有涂层的毛细管，在保证检出率的基础上，极大地降低了测试成本。本发明提供了一种检测人乳免疫球蛋白IgA含量的检测方法，包括如下步骤(1) 将人免疫球蛋白IgA标准品溶于样品缓冲液，制备得到所述标准品的多个不同含量标准 溶液，并利用所述分析仪对所述标准溶液分别检测分析后得到检测结果，根据所述标准溶 液的浓度与对应的所述检测结果绘制出标准曲线；(2)离心处理人乳样品后，利用所述高 压毛细管电泳分析仪对所述样品进行检测；(3)将所述样品的检测结果与所述标准曲线比对，得到所述样品中人免疫球蛋白IgA的含量。在本发明的再一种具体实施方式
中，所述步骤(1)中所述标准曲线的制定时所述标准溶液的检测结果与所述标准溶液浓度的线性范围应选择在4mg/ml 0. 25mg/ml，配制 五种浓度的所述标准溶液，分别为4mg/ml、2mg/ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml，摇勻后检 测分析，得出所述标准曲线。在本发明的再一种具体实施方式
中，把所述检测中离心管的容量为1. 5ml 2ml， 离心速度为2000 5000r/min，离心时间为2 15min，离心温度控制在5 25°C，将所述 样品与所述缓冲液按1 1 10的比例加入所述离心管中，摇勻之后精确提取10 IOOul 加入样品管中，超声波清洗1 lOmin。在本发明的再一种具体实施方式
中，所述的样品缓冲液为140 160mmol/L三 甲基氨基甲烷，40 6(kimol/L乙二胺四乙酸二钠，6 8mol/L尿素，2 4mg/ml的二硫 基苏糖醇，甲基羟乙基纤维素0. 02% 0. (0. 2 lmg/ml)，所述样品缓冲液的pH值为 8. 5 士 0. 3。在本发明的再一种具体实施方式
中，所述高压毛细管电泳检测参数如下检测温 度控制在25 45°C之间，毛细管柱直径40 75 μ m、长度400 600mm，紫外光检测器，压 力进样，压力为0. 2 1. 2psi，时间为2s 20s，工作电压为20 30kV。在本发明的再一种具体实施方式
中，所述的毛细管柱未设涂层。在本发明的再一种具体实施方式
中，电泳缓冲液PH为2. O 3. 0，所述电泳缓冲液 的成分为柠檬酸。在本发明的再一种具体实施方式
中，计算所述样品检测结果的方法如下所述样 品的检测结果为样品分离的图谱，运用所述高压毛细管电泳仪所带的分析软件，积分所述 图谱各峰的面积，计算出所述样品浓度。本发明方法现行回归方程相关系数> 0. 98，其线性范围在0. 25mg/ml 4mg/ml， 最低检出限为lng，最低检出浓度为0.01mg/ml。精确度达90%以上，柱子回收率达到90% 以上，样品回收率达70%以上。能有效检测出样品中的人乳中免疫球蛋白IgA的含量使用本发明方法中的样品缓冲液，可以有效的分散样品中的蛋白质，同时可以有 效的防止蛋白质吸附在未设涂层的毛细管柱壁上。和现有技术其他领域中使用高压毛细管 电泳仪检测蛋白的方法直接转用到人乳中免疫球蛋白IgA的检测相比，本发明具有较高的 检出率，同时由于使用未设涂层的毛细管，极大地降低了测试的成本。
具体实施例方式实施例1毛细管电泳温度控制在25°C，使用直径为40 μ m、长度为400mm的未涂层石英毛细 管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0. 2psi，时间为20s，工作电压为20kV。标准曲线的制定利用人乳免疫球蛋白IgA标准品配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、0. Olmg/ml的标准溶液。摇勻后使用高压毛细管电泳分析，积分后的 峰面积分别为25124、12254、6388、3452、157利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为 0. 9982，最低检出限为lng，最低检出含量为0. Olmg/ml，标准样品回收率达94%，重复率能 达96%。以上数据均在于有意效果范围之内。
处理样品缓冲液配置方法140mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40mmol/L乙 二胺四乙酸二钠，6mol/L尿素，处理样品时添加2mg/g的二巯基苏糖醇，甲基羟乙基纤维素 0. 02%或者0. 2mg/ml，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8. 2。电泳缓冲液的配置方法柠檬酸缓冲液，pH值为3. 0。检测步骤为把奶样品加入1. 5ml的离心管中，在2000r/min离心条件下离心 15min,离心温度为5°C。准确提取样品IOul置1. 5ml离心管中(或其他容器)，提取IOOul 样品缓冲液加入1. 5ml离心管中稀释11倍，使用漩涡混合器混勻。精确提取IOul处理样 品加入样品管中，放置于超声波清洗机lmin，之后使用毛细管电泳仪测定。样品定量读数根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分人 乳免疫球蛋白IgA的峰面积为523，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓 度为0. 082mg/ml，再乘稀释倍数11，即得浓度为0. 9mg/ml，所以该人乳样品含有的人乳免 疫球蛋白IgA浓度为0. 9g/L。实施例2毛细管电泳温度控制在45°C，使用直径为75 μ m、长度为600mm的未涂层石英毛细 管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为1.2psi，时间为2s，工作电压为30kV。标准曲线的制定利用人乳免疫球蛋白IgA标准品配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 025mg/ml的标准溶液。摇勻后使用高压毛细管电泳分析，积分后的 峰面积分别为，22101、10321、5682、2654、1542，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数 为0. 9982，最低检出限为2ng，最低检出含量为0. 02mg/ml，标准样品回收率达94%。处理样品缓冲液配置方法160mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加60mmol/L乙二 胺四乙酸，8mol/L尿素，处理样品时添加4mg/g 二硫基苏糖醇，甲基羟乙基纤维素0. 或 者lmg/ml。使用0. IM氢氧化钠调至pH值为8. 8。电泳缓冲液的配置方法柠檬酸缓冲液，pH值为3. 0。检测步骤为把人乳样品加入2ml的离心管中，在5000r/min离心条件下离心 2min，温度25°C。准确提取样品IOOul置入2ml离心管(或其他容器)，提取IOOul样品缓 冲液加入2ml离心管，稀释2倍，并使用漩涡混合器混勻。精确提取IOOul处理样品加入样 品管中，放置于超声波清洗机lOmin，之后使用毛细管电泳仪测定。样品定量读数根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分人 乳免疫球蛋白IgA的峰面积为3125，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓 度为0. 55mg/ml，再乘稀释倍数2，即得浓度为1. lmg/ml，所以该人乳样品中含有的人乳免 疫球蛋白IgA浓度为1. lg/L。实施例3毛细管电泳温度控制在30°C，使用直径为60 μ m、长度为500mm的未涂层石英毛细 管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0. Spsi，时间为6s，工作电压为25kV。标准曲线的制定利用人乳免疫球蛋白IgA标准品配制浓度分别为8mg/ml、4mg/ml、lmg/ml、0. 25mg/ml、0. Olmg/ml的标准溶液。摇勻后使用高压毛细管电泳分析，积分后的 峰面积分别为，51241、24125、6214、1421、624，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数 为0. 9989，最低检出限为2ng，最低检出含量为0. 02mg/ml，标准样品回收率达91%。处理样品缓冲液配置方法150mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加50mmol/L乙二胺四乙酸，7mol/L尿素，处理样品时添加3mg/g 二硫基苏糖醇，甲基羟乙基纤维素0. 05%或 者0. 5mg/ml。使用0. IM氢氧化钠调至pH值为8. 5。
电泳缓冲液的配置方法柠檬酸缓冲液，pH值为2. 0。检测步骤为把人乳样品加入1. 8ml的离心管中，在3000r/min离心条件下离心 8min，温度15°C。准确提取样品IOul置入1. 8ml离心管(或其他容器)，提取40ul样品缓 冲液加入1. 8ml离心管，稀释5倍，并使用漩涡混合器混勻。精确提取40ul处理样品加入 样品管中，放置于超声波清洗机5min，之后使用毛细管电泳仪测定。样品定量读数根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分人 乳免疫球蛋白IgA的峰面积为1491，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓 度为0. 24mg/ml，再乘稀释倍数5，即得浓度为1. 2mg/ml，所以该人乳样品中含有的人乳免 疫球蛋白IgA浓度为1.2g/L。实施例4对比涂层和未涂层毛细管检测得到的样品中IgA含量毛细管电泳温度控制在25 °C，使用直径为40 μ m、长度为400mm的涂层石英毛细管 柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0. 2psi，时间为20s，工作电压为20kV。标准曲线的制定利用人乳免疫球蛋白IgA标准品配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 01mg/ml的标准溶液。摇勻后使用高压毛细管电泳分析，积分后的 峰面积分别为22415、11541、5321、2657、529，利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为 0. 9960，最低检出限为3ng，最低检出含量为0. 02mg/ml或者0. 2mg/ml，标准样品回收率达 90%，重复率为90%。处理样品缓冲液配置方法、检测步骤为均同与实例1。样品定量读数根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分人 乳免疫球蛋白IgA的峰面积为426，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓 度为0. 08mg/ml，再乘稀释倍数11，即得实际浓度为0. 88mg/ml，所以该人乳样品含有的人 乳免疫球蛋白IgA浓度为0. 88g/L。实例1和实例4使用的测试样品相同。未涂层毛细管检出值于涂层毛细管检出值 相当，前者为检出0. 9mg/ml，后者检出含量为0. 88mg/ml。未涂层毛细管柱子重复性高于涂 层毛细管柱子重复性，其中未涂层毛细管的重复性为96%和涂层毛细管重复性为90%。涂 层毛细管柱子2000元/根(2009年市场价)能检测200-500个样品，而未涂层毛细管柱子 300元/根(2009年市场价)能检测500-1000个样品。由此可见，本发明的检测方法在保 证测试准确的前提下，可以有效降低测试成本。实施例5使用背景技术中公开的测试方法直接转用到人乳中免疫球蛋白IgA含量 的测试毛细管电泳温度控制在25 °C，使用直径为50 μ m、长度为370mm的有涂层石英毛细 管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0. 5Mpa，时间为10s，工作电压为15kV。标准曲线的制定配制2mg/ml的人乳免疫球蛋白IgM标准品溶液。分别移取5、 10、20、30、40及60 μ L IgM标准储备液于500 μ L样品管中，用样品缓冲液稀释成100、200、 400、600、800、1200mg/L IgM工作液，用外标法定量，得到峰面积(A)与质量浓度(C，mg/L) 的线性关系；线性范围为0. 05 2mg/ml ；检出限为0. 00625mg/mL·处理样品缓冲液配置方法5mmol/L H3B03缓冲液(0. 5mol/L LiOH调pH = 8. 7)。
电泳缓冲液的配置方法50mmol/LK2B407+65g/L 聚乙二醇 20000 (Imol/CsOH调 pH 10. 0)。检测步骤为空白样品中添加IgA标准品至0. 2mg/ml。称取200ul样品于2ml离 心管，加入200ul样品缓冲液，涡旋混勻后，以13000r/min离心lOmin，取上清液直接分析。样品定量读数根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分人 乳免疫球蛋白IgA的峰面积为2778，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓 度为0. 06mg/ml，再乘稀释倍数2，即浓度为0. 12mg/ml，而样品的实际浓度为0. 2mg/ml,由 此可见背景技术中公开的检测方法其检出率为60%。实施例6毛细管电泳温度控制在25°C，使用直径为40 μ m、长度为400mm的未涂层石英毛细 管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0. 2psi，时间为20s，工作电压为20kV。标准曲线的制定利用人乳免疫球蛋白IgA标准品配制浓度分别为4mg/ml、2mg/ ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 01mg/ml的标准溶液。摇勻后使用高压毛细管电泳分析，积分后的 峰面积分别为25124、12254、6388、3452、157利用软件得出标准曲线，线性回归相关系数为 0. 9982，最低检出限为lng，最低检出含量为0. 01mg/ml，标准样品回收率达94%，重复率能 达 96%。处理样品缓冲液配置方法140mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40mmol/L乙 二胺四乙酸二钠，6mol/L尿素，处理样品时添加2mg/g的二巯基苏糖醇，甲基羟乙基纤维素 0. 02%或者0. 2mg/ml，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8. 2。电泳缓冲液的配置方法柠檬酸缓冲液，pH值为3. O。检测步骤为空白样品中添加IgA标准品至0. 2mg/ml。称取200ul样品于2ml离 心管，加入200ul样品缓冲液，涡旋混勻后，以13000r/min离心lOmin，取上清液直接分析。样品定量读数根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分人 乳免疫球蛋白IgA的峰面积为3582，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓 度为0. 09mg/ml，再乘稀释倍数2，即得浓度为0. 18mg/ml，而样品的实际浓度为0. 2mg/ml, 由此可见对比文献公开的检测方法其检出率为90%。实施例6使用的是本发明的检测方法(实验条件与实施例1相同)，只是使用的测 试样品是与实施例5相同的加入IgA标准品的空白样品。对比实施例5和实施例6可以看 出，本发明较背景技术中公开的检测方法具有较高的检出率。实施例7毛细管电泳温度控制在25 °C，使用直径为50 μ m、长度为370mm的有涂层石英毛细 管柱，紫外线检测器，压力进样，压力为0. 5Mpa，时间为10s，工作电压为15kV。标准曲线的制定配制2mg/ml的人乳免疫球蛋白IgM标准品溶液。分别移取5、 10、20、30、40及60 μ L IgM标准储备液于500 μ L样品管中，用样品缓冲液稀释成100、200、 400、600、800、1200mg/L IgM工作液，用外标法定量，得到峰面积(A)与质量浓度(C，mg/L) 的线性关系；线性范围为0. 05 2mg/ml ；检出限为0. 00625mg/mL·处理样品缓冲液配置方法140mmol/L三甲基氨基甲烷缓冲液中加40mmol/L乙二胺四乙酸二钠，6mol/L尿素，处理样品时添加2mg/g的二巯基苏糖醇，甲基羟乙基纤维素 0. 02%或者0. 2mg/ml，使用氢氧化钠溶液把pH值调至8. 2。
电泳缓冲液的配置方法32mmol柠檬酸，20mmol柠檬酸三钠，0.05%羟丙甲基纤 维素，6mol/L尿素，用水稀释到pH值为3. 0。检测步骤为空白样品中添加IgA标准品至0. 2mg/ml。称取200ul样品于2ml离 心管，加入200ul样品缓冲液，涡旋混勻后，以13000r/min离心lOmin，取上清液直接分析。样品定量读数根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分人 乳免疫球蛋白IgA的峰面积为3704，利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓 度为0.08mg/ml，再乘稀释倍数2，即得浓度为0. 16mg/ml，检出率为80%。除使用的样品缓 冲液和电泳缓冲液不同于实施例5 (背景技术中公开的现有技术)以外，其他的实验条件完 全相同，而最终的测试结果显示，使用本发明的样品缓冲液和电泳缓冲液可以有效的提升 样品测量结果的检出率。样品缓冲液中，甲基羟乙基纤维素用量的表述使用的百分含量和浓度含量均满足 本发明的需要。上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明， 它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更 均应包含在本发明的保护范围之内。
权利要求
一种检测人乳中免疫球蛋白IgA含量的方法，包括如下步骤(1)将人免疫球蛋白IgA标准品溶于样品缓冲液，制备得到所述标准品的多个不同含量标准溶液，并利用高压毛细管电泳分析仪对所述标准溶液分别检测分析后得到检测结果，根据所述标准溶液的浓度与对应的所述检测结果绘制出标准曲线；(2)离心处理人乳样品后，利用所述高压毛细管电泳分析仪对所述样品进行检测；(3)将所述样品的检测结果与所述标准曲线比对，得到所述样品中人免疫球蛋白IgA的含量。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述步骤(1)中所述标准曲线的制定时，所述标 准曲线的线性范围应选择在4mg/ml 0. 25mg/ml，配制五种浓度的所述标准溶液，分别为 4mg/ml、2mg/ml、lmg/ml、0. 5mg/ml、0. 25mg/ml，检测分析后，得出所述标准曲线。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述离心处理中离心管的容量为1.5ml 2ml， 离心速度为2000 5000r/min，离心时间为2 15min，离心温度为5 25°C，所述样品与 所述缓冲液按1 1 10的比例加入所述离心管中，离心后精确提取10 IOOul加入样 品管中，超声波清洗1 lOmin。
4.根据权利要求3所述的方法，其中，所述的样品缓冲液为140 160mmol/L三甲 基氨基甲烷，40 60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，6 8mol/L尿素，2 4mg/ml的二硫基 苏糖醇，甲基羟乙基纤维素0. 02% 0. 或0.2 lmg/ml，所述样品缓冲液的pH值为 8. 5 士 0. 3。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述高压毛细管电泳仪检测参数如下检测温 度控制在25 45°C之间，毛细管柱直径40 75μ m、长度400 600mm，紫外光检测器，压 力进样，压力为0. 2 1. 2psi，时间为2s 20s，工作电压为20 30kV。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，所述的毛细管柱未设涂层。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，电泳缓冲液pH为2.O 3. 0，所述电泳缓冲液的 成分为柠檬酸。
8.根据权利要求1所述的方法，其中，计算所述样品检测结果的方法如下所述样品的 检测结果为分离的图谱，运用所述高压毛细管电泳仪所带的分析软件，积分所述图谱各峰 的面积，计算出所述样品浓度。
全文摘要
本发明涉及一种检测人乳中成分的方法，特别是一种检测人乳免疫球蛋白IgA含量的检测方法，包括(1)将人免疫球蛋白IgA标准品溶于样品缓冲液，制备得到所述标准品的多个不同含量标准溶液，并利用高压毛细管电泳分析仪对所述标准溶液分别检测分析后得到检测结果，根据所述标准溶液的浓度与对应的所述检测结果绘制出标准曲线；(2)离心处理人乳样品后，利用所述高压毛细管电泳分析仪对所述样品进行检测；(3)将所述样品的检测结果与所述标准曲线比对，得到所述人乳样品中人免疫球蛋白IgA的含量。本发明具有检出结果准确，重复性高，成本低廉的特点。
文档编号G01N27/447GK101806770SQ201010134428
公开日2010年8月18日 申请日期2010年3月29日 优先权日2010年3月29日
发明者刘卫星, 孙国庆, 康小红 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司