专利名称：一种牛乳中β-乳球蛋白含量的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种分析检测乳中蛋白的方法，特别是一种检测牛乳 中p-乳球蛋白含量的方法。属于检测技术领域。
背景技术：
卩-乳球蛋白是一种重要的牛乳清蛋白，占总蛋白质质量分数的8 %~10%， 20-40mg/ml 。卩-乳球蛋白分子量约为18400D，主要由 162个氨基酸所组成。(3-乳球蛋白的二级结构是由9个反平行的卩-折叠和1个一螺旋的分子所组成。p-乳球蛋白是是婴儿牛乳过敏症 的主要致壽文原。这是由于P-乳球蛋白被吸附在肠道黏膜上，产生免 疫反应而引起过敏。所以降低(3-乳球蛋白的含量有助于改善婴儿过 敏。因此准确检测出P-乳球蛋白含量有非常重要的意义。目前，尚未有(3 -乳球蛋白含量检测方法的国家标准和行业标准。 国内相关标准有GB/T 5413. 1、 2 - 1997嬰幼儿配方食品和乳粉-乳清 蛋白的测定。常用乳球蛋白的检测方法是分光光度计法、酶联免 疫法和高效液相色语法。免疫酶联吸附法灵敏度高，最小检测限低， 适合于p-乳球蛋白分离纯化的全程分析；高效液相色谱法快速准确， 操作简便，可实现p-乳球蛋白初步分离时的同步分析；分光光度法快速简便，准确性稍差，适合于纯化后具有较高浓度的p-乳球蛋白的在 线分析。
发明内容
本发明的目的 一种牛乳中P -乳球蛋白含量的检测方法。
鉴于现有技术中方法的优缺点，本专利发明了将使用毛细管电泳 仪快速4全测乳p-乳球蛋白含量的方法，而且针对此仪器创造性地试 验了 一系列的使用参数和专用緩冲液，使得检测的准确度和速度都非 常理想，是本发明的创造性所在。
本发明是一种检测P-乳球蛋白含量的检测方法，其中，包括如 下步骤l)将P-乳球蛋白溶于样品緩沖液，制备得到多个不同含量 P-乳球蛋白的标准溶液，并对多个溶液分别检测后得到P-乳球蛋白 含量与检测结果之间的标准曲线；2)对样品进行检测，并得到检测 结果；3)将所述的检测结果与所述的标准曲线比对，得到样品中P-乳球蛋白的含量；其中，检测样品的设备是高压毛细管电泳分析仪。
上述步骤1)中标准曲线的制定的方法优选如下配制p-乳球 蛋白标准溶液，在样品緩冲液中溶解P -乳球蛋白标准物质配制成分 别为2mg/ml、 lmg/ml 、 0.5mg/ml、 0.25mg/ml、 0. lmg/ml，制备得 到标准溶液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析，得到检测结果，即得 到P-乳球蛋白含量与平均校正因子的关系曲线；其中，所述的检测 结果按照如下方法计算按峰面积计算出平均校正因子。
上述的标准溶液或待检测样品的处理方法为把标准溶液或待检测样品装入离心管中，在2000-6000r/min离心条件下离心5-15min， 将样品与緩冲液:換照1: 4-20的比例加入冻存管(或其他容器)，并 摇匀，精确提取10-200ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清 洗机1 ~ 1 Omin, ^吏用毛细管电泳4义测定。
上述的样品緩沖液为能够使蛋白质M的緩冲液，优选如下緩 冲液
160 m mol/L三曱基氨基曱烷緩冲液中加40 m mol/L 3-吗啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，7 mol/L尿素，处理样品时 添加5ul/ml的e-巯基乙醇，甲基羟乙基纤维素0. 05%, pH值为8. 5
上述的摇匀步骤采用凝涡混合器。
上述高压毛细管电泳分析的使用检测参数如下毛细管电泳检测 检测的温度控制在15 40。C之间，毛细管柱直径25~75um、长度 20~ 600 mm， DAD (或紫外光)检测器，压力进样(或电动进样)，压 力为0 lpsi，进样时间为ls 20s,分离温度为15~40°C，工作电 压为10-30 kV。
上述的毛细管柱为石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。 上述的高压毛细管电泳分析的检测时电泳才莫式为区带电泳，其电 泳緩冲液为pH2. 0~9. 0，主要成分为无机盐緩沖液，优选磷酸盐、 硼酸或柠檬酸。
上述的检测结果的处理方法如下检测结果为样品分离的图谱， 运用毛细管电泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓 度，再乘稀释倍数，即得实际浓度。
6卩-乳球蛋白是一种重要的牛乳清蛋白，占常乳总蛋白质质量分
数的8%~10%， 20-40mg/ml 。毛细管电泳仪检测最低浓度能达到 10-5~10—8mol/L。所以毛细管电泳仪能检测出其含量。使用毛细管电 泳仪开发检测P-乳球蛋白含量的方法包括样品性质的了解、分离模 式、建立緩冲体系、优化緩冲体系和换分离模式等步骤。开发出的 方法能应用于产品开发、质量控制和分析;f企测领域中。
本发明主要使用毛细管电泳仪能准确测定P -乳球蛋白的含量， 从而应用于产品开发、质量控制和分析检测领域中。
本发明在在传统的电泳和色i普的原理的基础上，使用高压毛细管 电泳仪检测p-乳球蛋白的含量，达到准确检测出乳制品中p-乳球蛋 白的含量。通过试验，最终确定检测方法的最佳参数条件。具体如下 检测|3-乳球蛋白含量的检测方法，包括样品前处理、上样检测， 还包括校准读数等步骤。毛细管电泳检测检测的温度控制在15 ~ 40 。C之间，毛细管柱直径50~75um、长度20 600 mm的石英毛细管 柱，DAD (或紫外光)检测器，压力进样，压力为0. 5psi，进样时 间为5s 20s,分离温度为20~40°C，工作电压为15-25 kV。
校准曲线的制定配制P -乳球蛋白标准溶液浓度分别为 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml、 0. 051mg/ml。摇匀后 使用高压毛细管电泳分析，按峰高计算出平均校正因子。 检测步骤为
把原料奶样品装入15ml的离心管中，在5000r/min离心条件下 离心5min。准确提取样品100ul置入冻存管。提取400ul样品緩冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用旋涡混合器混匀。精确提取
40ul处理样品加入样品管中，放置于超声波清洗机3min，使用毛细 管电泳仪测定。
样品定量读数:根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的 分析软件，积分各峰高(或峰面积)，计算出试样浓度，再乘稀释倍 数，即得实际浓度。 有益效果
本发明方法现行回归方程相关系数〉0.98，其线性范围在 0. 01mg/ml ~ 2mg/ml ，最低检出线为0. 15ng,最低检出浓度为 0. 005mg/ml。精确度达90%以上，柱子回收率达到90%以上，样品回
收率达70%以上。能有"效检测出样品中的p-乳球蛋白的含量。
本专利发明了将使用毛细管电泳仪快速检测P -乳球蛋白含量的 方法。毛细管电泳仪是一类包括电泳、色谱及其交叉内容的液相微分 离技术。它能快速精确检测出牛奶中的织叚成分、抗生素、添加的功 能性因子、乳清蛋白、免疫球蛋白、酶、糖、添加剂和其他小分子的 含量。该方法操作简便、准确，检测到出结果时间仅为lh左右。
具体实施方式
实施例1 一种牛乳中P -乳球蛋白含量的检测方法
毛细管电泳温度控制在"。C,使用直径为50um、长度为20mm 的石英毛细管柱，DAD检测器，进样压力为0.5psi,进样时间为10s， 工作电压为15 kV。
校准曲线的制定利用P-乳球蛋白标准品配制浓度分别为2mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的才示准溶液。 摇匀后〗吏用高压毛细管电泳分析，积分后的峰面积分别为378089、 152088、 72110、 33124、 14112,利用软件得出标准曲线，线性回归 相关系数为0.9917,最低检出线为0. Olug,最低检出含量为 0. 01mg/ml，标准样品回收率达90%。
处理样品緩沖液配置方法160 m mol/L三甲基氨基曱烷緩冲 液中加40 m mol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二 钠，6mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的e-巯基乙醇，曱基羟 乙基纤维素0. 05%,使用氢氧化钠溶液把pH值调至8. 5。
电泳緩冲液的配置方法0. 32 mol/L柠檬酸，20 m mol/L柠檬 酸三钠，7 mol/L尿素，羟丙基曱基纤维素0. 05%。
检测步骤为把奶样品加入15ml的离心管中，在5000r/min 离心条件下离心10min。准确提取样品100ul置入冻存管(或其他 容器)。提取400ul样品緩冲液加入冻存管(或其他容器)，并使用 旋涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超 声波清洗机3m i n ，之后使用毛细管电泳仪测定。
样品定量读数:根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的 分析软件，积分P -乳球蛋白的峰面积为478090,利用分析软件自动 套入标准曲线方程内计算出试样浓度为2. 7mg/ml,再乘稀释倍数5, 即得实际浓度为13. 5mg/ml，所以该奶样含有的P -乳球蛋白浓度为 13. 5g/L。
实施例2 —种牛乳中P -乳球蛋白含量的检测方法毛细管电泳温度控制在30。C,使用直径为75um、长度为600 mm 的石英毛细管柱，DAD检测器，进样压力为0. 5psi,进样时间为5s, 工作电压为25 kV。
校准曲线的制定利用p-乳球蛋白标准品配制浓度分别为2 mg/ml、 lmg/ml、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml的标准溶液。摇 匀后使用高压毛细管电泳分析，积分后的峰面积分别为，393142、 178563、 87892、 43728、 21157,利用软件得出标准曲线，线性回归 相关系数为0.998，最低检出线为O.Olug,最低检出含量为 0. Olmg/ml,标准样品回收率达95%。
处理样品緩沖液配置方法160 m mol/L三甲基氨基曱烷緩沖 液中加40 m mol/L 3-吗啉代丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸，6 mol/L尿素，处理样品时添加5ul/ml的P-巯基乙醇，曱基羟乙基纤 维素0. 4%。使用0. 1M氢氧化钠调至pH值为8. 5。
电泳緩沖液的配置方法0. 32 mol/L柠檬酸，20 m mol/L柠檬 酸三钠，6 mol/L尿素，羟丙基曱基纤维素O. 4%。
检测步骤为把奶样品加入15ml的离心管中，在5000r/min 离心条件下离心5min。准确提取样品100ul置入冻存管(或其他容 器)。提取400ul样品緩沖液加入冻存管(或其他容器)，并使用漩 涡混合器混匀。精确提取40ul处理样品加入样品管中，放置于超声 波清洗机3min，之后使用毛细管电泳仪测定。
样品定量读数:根据样品分离的图谱，运用毛细管电泳仪所带的 分析软件，积分P -乳球蛋白的峰面积为514202,利用分析软件自动套入标准曲线方程内计算出试样浓度为2. 6mg/ml，再乘稀释倍数5, 即得实际浓度为13mg/ml,所以该奶样含有的P-乳球蛋白浓度为 13g/L。
权利要求
1.一种检测β-乳球蛋白含量的检测方法，其特征在于包括如下步骤1)将β-乳球蛋白溶于样品缓冲液，制备得到多个(优选6-10个)不同含量β-乳球蛋白的标准溶液，并对多个溶液分别检测后得到β-乳球蛋白含量与检测结果之间的标准曲线；2)对样品进行检测，并得到检测结果；3)将所述的检测结果与所述的标准曲线比对，得到样品中β-乳球蛋白的含量；其中检测样品的设备是高压毛细管电泳分析仪。
2. 根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于所述步骤l)中 标准曲线的制定的方法优选如下配制|3-乳球蛋白标准溶液， 在样品緩沖液中溶解P -乳球蛋白标准物质配制成分别为 2mg/ml、 lmg/ml 、 0. 5mg/ml、 0. 25mg/ml、 0. lmg/ml，制备得到 标准溶液，摇匀后使用高压毛细管电泳分析，得到检测结果，即 得到p-乳球蛋白含量与平均校正因子的关系曲线；其中，所述 的检测结果按照如下方法计算按峰面积计算出平均校正因子。
3. 如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于把标准溶液或 待检测样品装入离心管中，在2000-6000r/min离心条件下离心 5-15min，将样品与緩冲液按照1: 4-20的比例加入冻存管(或 其他容器)，并摇匀，精确提取10-200ul处理样品加入样品管中， 放置于超声波清洗机1 ~ 10min,使用毛细管电泳仪测定。
4. 如权利要求3所述的检测方法，其特征在于所述的样品緩沖液为能够使蛋白质分散的緩冲液，优选如下緩冲液 160 ra mol/L三曱基氨基曱烷緩冲液中加40 m mol/L 3-吗啉代 丙烷磺酸，60mmol/L乙二胺四乙酸二钠，7mol/L尿素，处理样 品时添加5ul/ml的e-巯基乙醇，曱基羟乙基纤维素0. 05%， pH值为8.5。
5. 如权利要求2所述的检测方法，其特征在于所述的摇匀步骤采 用旋涡混合器。
6. 如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述高压毛细 管电泳分析的使用检测参数如下毛细管电泳检测检测的温度为 15 ~ 40°C ,毛细管柱直径25 ~ 75 u m、长度20 ~ 600 mm, DAD (或 紫外光)检测器，压力进样，压力为0 lpsi,进样时间为ls~ 20s，分离温度为15~40°C,工作电压为7~30 kV。
7. 如权利要求6所述的检测方法，其特征在于所述的毛细管柱为 石英毛细管柱，包括涂层和未涂层。
8. 如权利要求1或2所述的检测方法，其特征在于所述的高压毛 细管电泳分析的检测时电泳模式为区带电泳，其电泳緩冲液为 pH2. 0-9. 0,主要成分为无机盐緩冲液，优选磷酸盐、硼酸或 柠檬酸。
9. 根据权利要求2中所述的检测方法，其特征在于所述的检测结 果的处理方法如下检测结果为样品分离的图谱，运用毛细管电 泳仪所带的分析软件，积分各峰的面积，计算出试样浓度,再乘稀 释倍数，即得实际浓度。
全文摘要
本发明涉及一种检测乳中成分的方法，特别是一种检测β-乳球蛋白含量的检测方法。属于检测技术领域。本发明毛细管电泳仪检测β-乳球蛋白含量的检测方法，包括样品前处理、上样检测，还包括校准读数，编辑报告等步骤。本发明是样品在毛细管电泳仪上跑电泳，从而毛细管色谱系统检测出样品的吸光值，以图谱的形式表达出来，从而能准确检测出β-乳球蛋白的含量，为产品研发、质量控制和分析成分提供技术支持。
文档编号G01N27/447GK101294931SQ200810126799
公开日2008年10月29日 申请日期2008年6月24日 优先权日2008年6月24日
发明者刘卫星, 孙国庆, 康小红, 胡新宇 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司