专利名称：一种检测牛乳中免疫球蛋白lgG含量的预包被酶标板的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量的预包被酶标板的制备方法。
背景技术：
免疫球蛋白G(IgG)作为牛初乳中ー种非常重要的免疫因子，其含量的多少是衡量牛初乳及其产品优劣的ー个重要指标。IgG也是免疫乳及其制品的主要功能成分，其含量是免疫乳及其制品质量好坏的最重要标准。对牛乳IgG的检测还可以评估常乳中是否掺有牛初乳以及判断牛乳是否掺假。因而，牛乳IgG的检测对于乳制品的质量控制有着非常重要的意义。目前检测牛乳中免疫球蛋白IgG的手段主要有以下几类一、免疫单向扩散、免疫双向扩散以及火箭免疫电泳，这些方法具有操作简便、设备要求低的优点，但存在着检测时间长、精确性差的缺点；ニ、胶体金免疫层析技术虽然可以快速检测，但只局限于定性或半定量检测，无法达到精确检测的目的；三、高效液相和毛细管电泳虽然能够快速、精确检測，但对设备和操作人员的要求极高，不适合常规エ厂和普通试验室分析，普及困难。
发明内容
本发明是为了解决现有检测手段中存在检测时间长和精确性差或对设备和操作人员的要求极高造成普及困难的缺陷，而提供一种检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量的预包被酶标板的制备方法。本发明检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量的试剂盒是由10 μ g的牛免疫球蛋白lgG、
I.OmL的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体稀释液、50mL的稀释液、50mL洗涤液、IOmL的反应终止液和20mL的显色液制成；其中辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体稀释液是将辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体用pH值为8. O的Tris缓冲液稀释至9000 11000倍；稀释液为pH值为8. O的Tris缓冲液；洗涤液为TWeen20质量浓度为O. 05%,pH值为8. O的Tris缓冲液；反应终止液为浓度为2mol/L的硫酸；显色液按照体积份数由20份的PH值为5. O的磷酸氢ニ钠-柠檬酸缓冲液、I份的DMSO浓度为2g/L的TMB溶液和O. 064份的质量浓度为O. 75%的H2O2水溶液组成。本发明检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量的预包被酶标板按照以下方法制备一、用戊ニ醛质量浓度为O. 8%、pH值为9. 6的Tris缓冲液将兔抗牛IgG抗体稀释400 500倍，向酶标板上各孔加入兔抗牛IgG抗体稀释液100 μ L，再将加入抗体稀释液后的酶标板在37°C的条件下孵育2h或在4°C的条件下用包被液进行包被8 16小时，再将酶标板各孔洗涤3次；ニ、向步骤一洗涤后的酶标板各孔加入含有明胶质量浓度为1%、pH值为8. O的Tris缓冲液200 μ L，在37°C的条件下孵育Ih后再洗涤3次；三、向步骤ニ洗涤后的酶标板在_20°C的条件下保温Ih后，再在-20°C _40°C的条件下真空冷冻干燥8 IOh ;即得到预包被酶标板；其中步骤一和步骤ニ的洗涤为向酶标板上各孔加入250 μ L Tween20质量浓度为O. 05%、pH值为8. O的Tris缓冲液，静置3分钟后，再将孔内的溶液吸尽。本发明的试剂盒具有以下优点I、简化了酶联免疫吸附法检测牛乳中免疫球蛋白IgG过程的操作步骤，缩短了检测时间，单次检测时间仅需3 4小吋，而免疫单向扩散法和火箭免疫电泳法的检测时间通 常需要至少8小时和24小吋，同时试剂盒的检测结果灵敏度可达到ng级；2、试剂盒的检测范围在100 1000ng/mL之间，试剂盒的检测灵敏度达30ng/mL，在检测时组内变异系数为
I.86% 4. 22%，组间变异系数为3. 82% 9. 86%，回收率为98. 07% 105. 36%，具有很好的可重复性和可靠性；3、操作人员不需要特殊培训，易于普及。本发明制备的预包被酶标板具有以下优点本发明的酶标板缩短免疫吸附法检测免疫球蛋白IgG的检测时间，可在3 4小时完成检测分析，简化了操作，提高检测准确性；将本发明制备的预包被酶标板和本发明的试剂盒配合使用检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量，使用方便，对操作人员没有特殊要求，有效缩短了检测时间，检测结果准确，检测费用低，单次检测成本为5元左右。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的任意组合。
具体实施方式
一本实施方式检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量的试剂盒是由
10μ g的牛免疫球蛋白lgG、l. OmL的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体稀释液、50mL的稀释液、50mL洗涤液、IOmL的反应终止液和20mL的显色液制成；其中辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体稀释液是将辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体用pH值为8. O的Tris缓冲液稀释至9000 11000倍；稀释液为pH值为8. O的Tris缓冲液；洗涤液为Tween20质量浓度为O. 05%、pH值为8. O的Tris缓冲液；反应终止液为浓度为2mol/L的硫酸；显色液按照体积份数由20份的pH值为5. O的磷酸氢ニ钠-柠檬酸缓冲液、I份的DMSO浓度为2g/L的TMB溶液和O. 064份的质量浓度为O. 75%的H2O2水溶液组成。本实施方式的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体购于美国sigma-aldrich公司。
具体实施方式
ニ 本实施方式与具体实施方式
一的不同点为辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体稀释液是将辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体用pH值为8. O的Tris缓冲液稀释至10000倍。其它与具体实施方式
一相同。用本实施方式的试剂盒測定牛乳中免疫球蛋白IgG含量的方法按如下步骤进行一、样品处理取待测液态乳样在6°C、离心速度为5000r/min的条件下离心30min，取IOmL的下层脱脂乳样，用双蒸水稀释至IOOOmL,再从稀释后的溶液中取IOmL溶液，再用双蒸水稀释至IOOOmL,混匀后从再次稀释后的溶液中取100 μ L样品溶液，用pH8. OTris缓冲液稀释至lmL，得到处理好的样品；ニ、抗原添加取预包被好的酶标板，以其中一孔不加任何溶液作为空白对照孔，以另一孔加入100 μ L、pH8. OTris缓冲液作为阴性对照孔，将浓度为100ng/mL、125ng/mL、250ng/mL、500ng/mL、750ng/mL 和 1000ng/mL 的 IgG 标准溶液分别加入酶标板中，每个孔的IgG标准溶液加入量为100 μ L，再将步骤一处理好的样品溶液加入酶标板的其余各孔，每个孔的加入量为100 μ L，然后在37°C的条件下孵育lh，再洗涤5次；三、酶标抗体添加酶标抗体采用10000倍稀释的辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体，每孔加入酶标抗体100 μ L，空白对照孔不加酶标抗体，在37°C的条件下孵育lh，然后洗涤5次；四、添加酶促反应底物向酶标板各孔添加显色液100 μ L，在37°C的条件下孵育8 12min ;五、加终止液待标准品的100ng/mL、125ng/mL和250ng/mL三孔有明显的梯度蓝色，并且500ng/mL、750ng/mL和1000ng/mL三孔没有出现蓝色时，每孔加入浓度为2mol/L的H2S0450yL ;六、酶标仪检测以空白对照孔校领，450nm波长检测；七、标准曲线绘制以牛IgG标准品浓度为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线，得出线性方程(y =O.5417Lnx-2. 3222，R2为O. 998，x =标准样品的浓度，y =酶标仪检测得到的吸光值);八、样品中IgG含量的计算根据所得的线性方程，计算出样品溶液中IgG的含量，然后用样品溶液中IgG的含量乘以样品稀释的倍数，最終得出样品中IgG的含量；其中步骤ニ和步骤三的洗涤为向酶标板上各孔加入含有TWeen20质量浓度为0. 05%、pH值为8. O的Tris缓冲液250μ L，静置3分钟后，将孔内的溶液吸尽；步骤四的显色液按照体积份数由20份的pH值为5. O的磷酸氢ニ钠-柠檬酸缓冲液、I份的DMSO ( ニ甲基亚砜)浓度为2g/L的TMB (3，3'，5，5'-四甲基联苯胺)溶液和0. 064份的浓度为0. 75%的H2O2水溶液组成。用本实施方式的试剂盒和免疫透射比浊法对同一牛初乳产品进行检测，測定其免疫球蛋白IgG含量，每组试验5个重复(η = 5)，检测结果如表I所示，用T检验对结果进行比较，免疫透射比浊法和本实施方式试剂盒測定免疫球蛋白IgG含量差异不显著(Ρ>
0.05)，表I的数据说明本实施方式的试剂盒检测结果具有良好准确性。表I
权利要求
1.一种检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量的预包被酶标板的制备方法，其特征在于检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量的预包被酶标板按照以下方法制备一、用戊ニ醛质量浓度为O.8%、pH值为9. 6的Tris缓冲液将兔抗牛IgG抗体稀释至400 500倍，向酶标板上各孔加入兔抗牛IgG抗体稀释液100 μ L，再将加入抗体稀释液后的酶标板在37°C的条件下孵育2h或在4°C的条件下用包被液进行包被8 16小时，再将酶标板各孔洗涤3次；ニ、向步骤一洗涤后的酶标板各孔加入含有明胶质量浓度为1%、ρΗ值为8. O的Tris缓冲液200 μ L，在37°C的条件下孵育Ih后再洗涤3次；三、向步骤ニ洗涤后的酶标板在_20°C的条件下保温Ih后，再在_20°C -40°C的条件下真空冷冻干燥8 IOh ;即得到预包被酶标板；其中步骤ー和步骤ニ的洗涤为向酶标板上各孔加入250 μ L Tween20质量浓度为O. 05%、pH值为8. O的Tris缓冲液，静置3分钟后，再将孔内的缓冲液吸尽。
2.根据权利要求I所述的检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量的预包被酶标板的制备方法，其特征在于步骤一将兔抗牛IgG抗体的稀释450倍。
3.根据权利要求I所述的检测牛乳中免疫球蛋白IgG含量的预包被酶标板的制备方法，其特征在于步骤一中包被液为含有戊ニ醛质量浓度为O. 8%、pH值为9. 6的Tris缓冲液。
全文摘要
一种检测牛乳中免疫球蛋白lgG含量的预包被酶标板的制备方法，它涉及了一种检测牛乳中免疫球蛋白lgG含量的预包被酶标板的制备方法。它解决了现有检测手段中存在检测时间长和精确性差或对设备和操作人员的要求极高造成普及困难的缺陷。本发明的试剂盒是由免疫球蛋白lgG标准品、辣根过氧化物酶标记的兔抗牛IgG抗体、稀释液、洗涤液、反应终止液和显色液制成。本发明的预包被酶标板按照以下方法制备一、稀释抗体，包被；二、加入缓冲液，孵育；三、冷冻干燥；即得到制备好的预包被酶标板。本发明的试剂盒和制备的酶标板配合使用具有使用方便，对操作人员没有特殊要求，有效缩短了检测时间，检测结果准确的优点。
文档编号G01N33/543GK102621298SQ20121009286
公开日2012年8月1日 申请日期2008年12月31日 优先权日2008年12月31日
发明者吴刚, 姜瞻梅, 田波, 霍贵成 申请人:东北农业大学