基于双重扩增策略构建的免标记荧光适体传感器检测腺苷的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种基于外切酶III辅助的DNA循环和杂交链反应的双重扩增策略构 建的免标记焚光适体传感器检测腺苷。
【背景技术】
[0002] 腺苷是一种内源性核苷，也是ATP降解产物，其在中枢神经系统、外周神经系统和 免疫系统中起着非常重要的作用[1，2]。最近，越来越多的证据表明腺苷具有促进肿瘤活 性的作用[3-5]。因此，作为一种潜在的肿瘤标志物，腺苷的灵敏检测对理解其在肿瘤细胞 增殖和进一步说明其在癌症临床诊断和治疗方面功能上具有重要的作用。传统方法包括高 效液相色谱法（HPLC) [6, 7]、毛细管电泳法[8]和放射性免疫法[9]，但是这些方法具有一 些局限性，比如繁琐的样品前处理、较大的样品和试剂用量、低灵敏度以及放射性元素的危 害。作为另一种选择，荧光适体传感器因其简便、快速、高选择性和灵敏度的优势引起了越 来越多的关注。为了获得荧光信号，研宄者建立了一些常见的标记为基础的方法[10-12]。 Dong课题组够建了一种基于氧化石墨烯和外切酶III辅助信号扩增的荧光适体传感器 [12]。这种适体传感器实现了对腺苷的灵敏检测，但是标记的步骤可能会降低信号探针的 性能。此外，复杂性和高成本也会限制该方法的普遍应用。
[0003] 为了简化实验并降低成本，研宄者建立了一些免标记的荧光适体传感器用于检测 腺苷[13-15]。Lu课题组建立了一种基于孔雀石绿荧光的适体传感器，实现对腺苷的免标 记检测[13]，但是因为目标物与信号是1 :1的比率，这种方法的灵敏度相对较低，检测限为 2.0Xl(T5m〇lL'为了提高灵敏度，一些信号扩增的策略被引入到免标记荧光适体传感器 的构建中，用于腺苷的检测分析[16-18]。在这些方法当中，我们课题组报道了一种基于目 标物催化发卡自组装的免标记适体传感器用于腺苷的扩增检测[17]，通过采用信号扩增， 该方法的灵敏度有了一定的提高，检测限为6. 0Xl(T6m〇lL'但是这仍然达不到体液中低 腺苷含量的检测水平[19-21]。因此，腺苷检测的灵敏度需要进一步提高。
[0004] 此外，专利《基于共区域化触发链式杂交反应的适体传感器检测腺苷【申请号】 20140344669. 2》中报道了一种通过共区域化诱导的链式杂交反应为基础的适体传感器检 测腺苷，其主要是利用HCR和SYBRGreenI产生双重放大的荧光信号，同时结合共区域化 和磁球分离作用以实现低的背景。但是，由于该发明将识别腺苷的适体链分为两部分，这就 降低了适体本身的结合常数，影响适体与目标物的结合。而本发明是采用不同原理的荧光 传感设计--ExoIII辅助的DNA循环和HCR构建的新型荧光适体传感器，实现对腺苷的 灵敏检测；同时本发明是采用完整的适体结构，避免了上述结合常数低的问题。
[0005] 在过去的十年里，许多信号扩增策略作为一种有效提高目标物检测灵敏度的工具 被建立[22-25]。ExoIII辅助的DNA循环方法便是常用方法之一。不同于切刻内切酶， ExoIII无需特异的识别位点，能够选择性的催化双链DNA，从其3'突出端或嵌入端开始逐 步水解成单核苷酸[23, 26-28]。通过ExoIII辅助的DNA循环反应，可以获得大量的单链 DNA用于信号扩增。但是，采用ExoIII辅助DNA循环的大多数工作均涉及标记步骤，比如 标记有荧光团用于光学检测，或标记有氧化还原基团用于电化学分析[12, 27, 29, 30]。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种基于双重扩增策略构建的 免标记荧光适体传感器，将该适体传感器用于腺苷的分析检测。
[0007] 为了获得免标记的基于ExoIII辅助DNA循环方法用于检测腺苷，结合了杂交链 反应（HCR)来产生大量的G-四分体结构，通过许多N-甲基卟啉二丙酸IX(NMM)的绑定获 得有效的信号输出和信号扩增[31-33]。通过这两种信号扩增策略，构建了一种新型免标 记和双重扩增的荧光适体传感器用于灵敏检测腺苷。首先，构建了一个包含催化链、适体链 和链霉亲和素化磁球的三功能探针。该链霉亲和素化磁球的功能是对目标物进行富集和分 离从而获得低背景信号。当目标物被适体链识别之后，催化链会立即被释放。然后，催化链 触发ExoIII辅助的DNA循环，产生大量的DNA片段，从而获得第一次扩增。随后，DNA片 段作为触发链引发HCR，形成带有许多G-四分体结构的双螺旋，获得了第二次扩增。最终， NMM插入到G-四分体结构中，产生增强的荧光响应，实现了免标记的检测。在该方法中，少 量的腺苷可被转化成大量的DNA触发链，致使目标物的扩增。该方法具有高的灵敏度，检测 限为4. 2X10_7m〇lL-1，这主要归功于ExoIII辅助DNA循环和HCR的双重扩增作用以及链 霉亲和素化磁球的低背景信号。更为重要的是，该方法能够显著的区分癌症病人和正常人 尿样中腺苷的含量，表明我们的方法能够为医学研宄和早期临床诊断提供一种新的可靠的 用于腺苷定量的策略。
[0008] 本发明是通过以下技术方案实现的：
[0009] 一种基于双重扩增策略构建的免标记荧光适体传感器，包括催化链、适体链和链 霉亲和素化磁球三功能探针；
[0010]其中，所述催化链（cDNA)为：5'-ACTGCATCGCAATACTCGATTTTTT-3'（核 苷酸序列如SEQIDNO. 2所示）；
[0011]所述适体链（Bio-Apt)为：5' -biotin-ITTITTITTACCTGGGGGAGTAITGCG GAGGAAGTT-3'（如SEQIDNO. 1 所示）；
[0012] 所述链霉亲和素化磁球，为现有技术中已有的常规产品，密度为1. 343gmL'直径 为 350nm〇
[0013] 其中，添加的链霉亲和素磁球呈悬浮液状态，浓度为3. 324X10nbeadsml/1，添 加的体积占溶液总体积的1/11，在溶液中，催化链的浓度为4. 55yM，适体链的浓度为 4. 55uM〇
[0014] 所述基于双重扩增策略构建的免标记荧光适体传感器，用于检测腺苷的过程如 下：
[0015] ⑴链霉亲和素化磁球-探针的制备：因链霉亲和素化磁球含有大量表面活性剂， 为了防止磁球的聚集，在使用前需将这些表面活性剂洗去，以活化磁球的功能。具体步骤如 下：
[0016] 首先，用TTL缓冲液对链霉亲和素化磁球洗涤，得到活化后的链霉亲和素化磁球。
[0017] 然后，将分装好的Bio-Apt和cDNA退火，冷却至室温；随后将两者混合并与活化后 的链霉亲和素化的磁球混合在室温下孵育。
[0018] 最后，孵育后的链霉亲和素化磁球用PBS缓冲液洗涤，以除去多余的cDNA，得到链 霉亲和素化磁球-探针。本工作中所有的洗涤步骤均是在外加磁场作用下完成的。
[0019] 所述TTL缓冲液的组成为：由Tris-HCl、Tween20、LiCl和水组成，其中，各组分的 浓度为：〇?lmolLlris-HCl，pH8. 0,0? 1% (v/v)Tween-20,1.OmolL-1LiCl〇
[0020] 所述PBS缓冲液的组成为：由NaCl、NaH2P04、Na2HP04，和水组成，其中，各组分的浓 度为：0? 15molLWaCl，7. 6mmolL 2. 4mmolL丨似巧卩。*，pH7. 4〇
[0021] 进一步地，用TTL缓冲液对链霉亲和素化磁球洗涤的次数为5次。
[0022] 进一步地，退火温度为95°C，时间为5min。
[0023] 进一步地，孵育时间为2h。
[0024] 进一步地，链霉亲和素化磁球用PBS缓冲液洗涤的次数为2次。
[0025] (2)ExoIII辅助的DNA循环和HCR反应：
[0026] 首先，将含有腺苷的待检测物与TNaK缓冲液加入到试管中，在室温下孵育；随后， 在磁场作用下分离出链霉亲和素化磁球，并保留反应液至新离心管中。
[0027] 然后，分别取探针HP，ExoIII和lOXExoIII缓冲液加入到离心管中。混匀后进 行ExoIII辅助DNA循环反应。水解完成之后，加热以终止酶的活性。
[0028] 最后，加入发卡探针H1和H2,混匀进行HCR反应。
[0029] 所述探针HP为：5'-GCAATACTCGAACACGITACC-3'（核苷酸序列如SEQID NO. 3所示）；
[0030] 所述探针HI为：5'-CTCGAACACGITACCGGGTAGGGCGITAGGAGGTAACGT GITCGAGTAITGC-3'（核苷酸序列如SEQIDNO. 11 所示）。
[0031] 所述探针H2 为：5'-TGGGTTCCTAACGCCCTACCCGGTAACGTGTTCGAGGCA ATACTCGAACACGITACCGGGTAGGGCGGG-3'（核苷酸序列如SEQIDNO. 12 所示）。
[0032] 所述TNaK缓冲液的组成为：Tris、NaCl、KC1和水组成，其中各组分的浓度为： 20mmolI^TrisJOOmmolI^NaCljmmolL-1KCl，pH7.5。添加量为 15yL。
[0033] 所述lOXExoIII缓冲液的组成为：Tris_HCl、MgCl2、DTT和水组成，其中，各组分 的浓度为：〇? 5molL^ris-HCl, 50mmolLMgCl^，lOmmolLiTT。
[0034] 所述探针HP的浓度为5yM，用量为5yL。
[0035] 所述ExoIII的用量为 0? 20 ~0? 40UmL'
[0036] 所述发卡探针HI的浓度为0. 8X1(T6~1. 2X1(T6M，优选浓度1.OX1(T6M，用量为 5uL〇
[0037] 所述发卡探针H2的浓度为1. 2X1(T6~1. 8X1(T6M，优选浓度1. 5X1(T6M，用量为 5uL〇
[0038] 进一步地，所述含有腺苷的待检测物为人的尿液，添加量为5yL。
[0039] 进一步地，孵育时间为2h。
[0040] 进一步地，混匀后放至37°C进行ExoIII辅助DNA循环反应。
[0041] 进一步地，探针HP、H1和H2在使用之前进行退火，目的是确保发卡结构的形成。 退火的步骤是：探针HP、Hl、H2在95°C下退火5min，并冷却至室温。
[0042] 进一步地，水解完成之后，加热以终止酶的活性的加热时间为20min，温度为 75。。。
[0043] 进一步地，HCR反应的温度是37°C。
[0044] (3)荧光测量：
[0045]HCR反应完成后，向反应产物中加入NMM和KC1，孵育后进行荧光测量，得荧光值。
[0046] 所述NMM的浓度为1. 5X10_6~2. 5X10 _6M，优选浓度为2. 0X10_6M，用量为2yL。
[0047] 所述KC1的浓度为1M，用量为8yL。
[0048] 进一步地，孵育的温度是37°C，时间是20~40min。
[0049] 进一步地，所述荧光测量中荧光光度计的基本设置是：室温条件下，激发波长为 399nm，扫描范围为550~680nm，狭缝宽度均为10nm，PMT电压700V。
[0050] (4)计算：根据上述所测得的荧光值，利用下述线性方程计算含有腺苷的待检测 物中腺苷的浓度。
[0051] 进一步地，利用下述线性方程计算得到腺苷的浓度：
[0052] A F= 15. 12+143. 58X105C,r= 0. 998 ；
[0053] 其中，AF表不焚光净信号值，C表不腺苷的浓度，单位为mol LS该线性方程的线 性范围是1.OXl(T6mol L-1~1.OXl(T4mol L-1之间。
[0054] 本发明基于双重扩增策略构建的免标记荧光适体传感器的设