长滩军团菌的荧光原位杂交检测试剂盒的制作方法
【技术领域】：
[0001] 本发明涉及长滩军团菌检测鉴定的技术领域，具体为一种长滩军团菌的荧光原位 杂交检测试剂盒。
【背景技术】：
[0002] 军团菌是一类革兰氏阴性的兼性胞内寄生菌，广泛分布于自然环境与人工水体环 境中，主要以空气气溶胶的形式进入肺泡，并以胞内寄生的方式感染人体细胞，可引起军团 菌病。目前军团菌属共有58个种，20多个种与人类疾病有关，其中嗜肺军团菌（Legionella pneumophila)、长滩军团菌（L.longbeachae)和杜氏军团菌（L.dumoffii)为主要病原体。 长滩军团菌于1980年首次分离于美国长滩市的一位军团菌肺炎患者，并因此得名。同年， William分离得到长滩军团菌的第二个血清型，此后便不断有长滩军团菌的临床和环境分 离报道。在澳大利亚，新西兰等地，长滩军团菌感染病例数量与嗜肺军团菌相当，有些地区 甚至多于嗜肺军团菌感染病例。有研宄表明，欧洲军团菌肺炎患者中，大约5%病例源自长 滩军团菌感染，并在过去的十年间呈显著增多的趋势。在亚洲，日本近年来也发现长滩军团 菌感染的军团菌病患者。与嗜肺军团菌以空调系统产生的气溶胶为主要传播途径不同，长 滩军团菌主要存在于堆肥处理的土壤以及附近水体中。流行病学调查表明，长滩军团菌病 例大多在患病前接触了含有长滩军团菌的土壤或附近水体。我国军团菌的研宄多集中在城 市空调系统或环境水系中嗜肺军团菌的分离与培养，而长滩军团菌的相关研宄基本处于空 白，更无土壤中长滩军团菌的分离研宄报道，长滩军团菌对我国人群的危害尚不清楚。
[0003] 目前长滩军团菌的检测鉴定主要采用分离培养，血清凝集实验，生化反应，16S rRNA基因和mip基因测序鉴定等方法。传统分离培养方法耗时长，分离难度大。血清凝集 容易出现交叉凝集反应，生化反应鉴定重复性差，基因测序耗费大。因此需要一种简单的长 滩军团菌特异性检测方法。焚光原位杂交（fluorescenceinsituhybridization，FISH) 是一种特异性的微生物图像检测方法。荧光标记的核酸探针与微生物胞内高度相似的核酸 位点杂交，并在激发光照射下发射荧光，可用于微生物的检测和定位。目前已有针对军团菌 属和嗜肺军团菌种的特异性FISH探针，并广泛运用于环境、临床等样品的检测。本发明设 计了一个长滩军团菌的特异性FISH检测试剂盒用于长滩军团菌的检测。
【发明内容】
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[0004] 本发明的目的是提供一种长滩军团菌的荧光原位杂交检测试剂盒，本发明基于我 们在16SrRNA序列中新发现的一个长滩军团菌特异的探针结合位点，建立一种更为简单、 快速、且成本低廉的长滩军团菌检测试剂盒。
[0005] 本发明实现过程如下：
[0006] 1.荧光原位杂交探针设计与合成：
[0007] 通过对长滩军团菌、非长滩军团菌与其他非军团菌的16SrRNA序列比对，发现长 滩军团菌在该序列上存在一段特异性区域"GGATGATGTCTGAGGACG"，其他非长滩军团菌与非 军团菌在此区域至少存在一个碱基差异。据此我们设计一条长滩军团菌特异探针，通过该 荧光原位杂交探针可鉴别军团菌与其他细菌。委托商业探针合成公司合成探针：
[0008]探针：[FITC]-5'-CGTCCTCAGACATCATCC(核酸序列为SEQIDNO :1)
[0009] FITC:异硫氰酸焚光素（fluoresceinisothiocyanate)，通过一个氨基连接分子 与探针5'端相连。
[0010] 2.试剂盒的制备
[0011] 含有上述引物的军团菌检测试剂盒，其主要成分为：
[0012] (1)探针：上面1.荧光原位杂交探针设计与合成中制备的探针以无菌蒸馏水溶 解，配制成浓度l〇ng/y1。
[0013] (2)荧光原位杂交缓冲液：20mMTris-HCl，20% 甲酰胺，900mMNaCl。
[0014] (3)荧光原位杂交洗脱液：20mMTris-HCl，0. 01%SDS，225mMNaCl和 5mMEDTA。
[0015](4)阳性对照：长滩军团菌标准菌株（ATCC33462)，0. 5mllX104个菌/ml培养物。
[0016](5)阴性对照：嗜肺军团菌标准菌株（ATCC35072)，0.5mllX104个菌/ml的嗜肺军 团菌培养物。
[0017] 以上试剂盒在_20°C保存。
[0018]3.试剂盒使用
[0019] (1)样品前处理：将待检测样品和对照制成4%多聚甲醛菌悬液，置于4°C过夜固 定。12000rpm离心3分钟，弃上清，以PBS缓冲液（PH= 7. 6)重悬菌液。取20y1菌液均 匀涂于载玻片上，室温风干。
[0020] (2)探针杂交：将涂有菌液的玻片依次置于50%，80 %和96 %的乙醇溶液中脱水3 分钟，自然风干。在避光条件下，取含5ng探针的0. 5y1探针溶液以及19. 5y1杂交缓冲 液共计20y1混合，滴加至玻片中央，置于46°C湿盒中杂交2h，之后于46°C预热的洗脱缓冲 液洗去未杂交的探针，去离子水冲洗玻片，避光风干。
[0021] (3)焚光显微镜观察
[0022] 调整激发光波长至490~495nm，在焚光显微镜下观察玻片。
[0023] 本发明主要特点如下：
[0024] (1)高特异性：通过对19株长滩军团菌、4株非军团菌属菌株以及与探针匹配程度 较高的21株非长滩军团菌（包括10株嗜肺军团菌，1株圣克鲁伊军团菌，1株圣海伦军团 菌，1株辛辛那提军团菌，4株博兹曼军团菌，2株麦氏军团菌，2株杜氏军团菌），进行探针的 特异性检测试验，证明了本发明试剂盒能准确的鉴定出长滩军团菌，说明本发明的试剂盒 特异性很高。
[0025] (2)高灵敏性：本发明建立的长滩军团菌的荧光原位杂交试剂盒，灵敏性达 1. 49X103cfu/ml〇
[0026] (3)检测方法简便快速，无须先进设备，且结果容易分析。
[0027] (4)检测范围广：本发明的技术方案设计合理，可以广泛应用于水样、生物膜和胞 内寄生的长滩军团菌快速鉴定，但并不仅限于此。
[0028] 附图简述
[0029] 图1使用本发明试剂盒检测时，长滩军团菌在显微镜下的形态。
[0030] 图2使用本发明试剂盒检测时，嗜肺军团菌在显微镜下的形态
【具体实施方式】：
[0031] 本发明的一种检测长滩军团菌的荧光原位杂交试剂盒是一个完整的整体。下面结 合具