用于检测军团菌的引物组合及试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供一种用于检测临床和环境标本中军团菌的引物组合，所述引物组合包括用于PCR特异性扩增mip基因的引物对(Seq?ID?No.1-2)以及用于PCR特异性扩增16S?rRNA的引物对(Seq?ID?No.3-4)。本发明还提供含有上述引物组合的检测试剂盒。通过对320份临床肺炎患者的痰和肺泡灌洗液及210份环境水标本的验证，本发明的引物组合特异性达到100％，最低检出限为2×101cfu/ml。该双重PCR系统在菌株的鉴定，临床和环境标本的检测中得到了成功的应用，基于该双重PCR系统建立的PCR检测方法，具有简便、快速、可靠的特点，有望在流行病学的初步调查，环境水监测，临床标本的检测中得到更广泛的应用。
【专利说明】用于检测军团菌的引物组合及试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明涉及军团菌的分子生物学检测，具体地说，涉及一种用于检测临床和环境标本中军团菌的引物组合及试剂盒。
【背景技术】
[0002]军团菌(Leg1nella)是一种普通存在于各种人工和自然水环境中的细菌，它是引起军团菌病(Leg1nellosis)的病原体，能够在阿米巴和人单核细胞，主要是肺泡巨噬细胞中生长繁殖，引起肺炎和庞提阿克热。通常肺炎发病急，死亡率高。而庞提阿克热发病似感冒，主要症状为发热，感染率高，但预后比肺炎型好，无死亡。流行病学调查证实，军团菌通过气溶胶经空气传播给人，常见于冷却塔、热水供应系统、蒸汽浓缩器、矿泉疗养浴池、临床呼吸装置的加湿器、超级市场蔬菜喷雾器、喷泉等。个别报道，饮用被军团菌污染的水和接触被军团菌污染的土壤也能引起军团病。目前为止，人与人之间的传播尚未得到证实。
[0003]自从1976年美国费城爆发军团病以来，军团菌属已有48个军团菌种70个血清型被发现，其中19个种被认为与人类呼吸道感染有关。嗜肺军团菌(Leg1nellapneumophila,简写Lp)是引起军团菌病最常见的种，也是人工环境中最常见的种，据报道，军团病中80-85%是由嗜肺军团菌引起的。嗜肺军团菌有15个血清型，最常见的为I型。据美国CDC报告，在美国每年约有10，000到15，000人感染军团菌病，爆发通常发生在夏季和初秋，但全年均有病例出现，约5-10%的军团病病人死亡。军团菌在西方国家引起的肺炎占社区获得性肺炎的2-10.6%，一些地区军团菌病在医源性肺炎中至少占10%。我国自1982年首次从肺炎病人体内分离到一株嗜肺军团菌以来，已相继从病人和环境中分离到多种型别的军团菌，并且先后报道了数起军团病的爆发流行，散发病例不断有报道。任何年龄段的人都可发病，但中年和老年人，尤其是吸烟者或有慢性肺部疾患的人，发病率较高。因此，对于病人做出早期诊断，比较从临床标本和环境中分离到的军团菌，查找传染源，从而采取有效的控制措施是非常重要的。
[0004]检测军团菌最经典的方法是通过培养分离军团菌和免疫荧光抗体的检测。但是，这存在很多问题:首先，军团菌培养要求严格，培养时间长，且由于其他杂菌的过分生长难以从临床和环境标本中分离出来。据报道，从呼吸道分泌物中培养军团菌的灵敏度是30-70 %，此外，在一些标本中，存在活的非可培养状态的军团菌，因此，仅靠培养来检测临床和环境标本是不利于军团菌的快速检测和诊断的。其次，直接荧光抗体(DFA)检测尽管快速，但灵敏度低，约25-75%，特异度依赖于工作人员的经验。第三，间接荧光抗体(IFA)或凝集实验检测抗体时，由于患者抗体水平在感染该病一周后，才能被检出，故不适用于早期诊断，检测灵敏度约为75%。此外，军团菌与其他细菌存在抗体交叉反应性。国内外学者们一直致力于寻找军团菌的快速，可靠的检测手段。近年来随着分子生物学的飞速发展，研究者们认识到从基因水平上检测军团菌将克服上述方法的缺陷。
[0005]基因探针和PCR方法已被广泛应用于检测军团菌，而由于PCR能够百万倍地扩增相当少量的细菌DNA，且省时，省力，有着较高的敏感性和特异性而得到了广泛应用。目前，用于PCR检测军团菌特异性的基因片段，包括5S rRNA、16S rRNA、870bp基因片段和编码嗜肺军团菌特异性独立因子 mip 基因(macrophage infectivity potentiator)。对 5S rRNA、16S rRNA基因片段的扩增可以检测军团菌属，即包括所有的嗜肺军团菌和非嗜肺军团菌。对870bp基因片段的扩增只能检测嗜肺军团菌。而mip基因的PCR扩增根据设计的引物序列不同，可以检测嗜肺军团菌和部分非嗜肺军团菌。由于5srRNA和16srRNA基因在染色体上是以多拷贝形式存在，因此对它们进行PCR扩增检测的敏感性高于对单拷贝基因，如870bp基因片段和mip基因片段的PCR扩增。
【发明内容】
[0006]本发明的目的是提供用于检测临床和环境标本中军团菌的引物组合及试剂盒。
[0007]为了实现本发明目的，本发明提供的用于检测军团菌的引物组合，包括用于PCR特异性扩增mip基因的引物对I以及用于PCR特异性扩增16S rRNA的引物对II。引物序列如下:
[0008]引物对1:
[0009]上游引物QTl 5' -GCAATGGCTAAAGGCATG-3'
[0010]下游引物QT2 5' -AATACAACAACGCCTGGCTTG-3'
[0011]引物对I1:
[0012]上游引物16sQ-F 5' -AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3'
[0013]下游引物16sQ-R 5' -CCAACAGCTAGTTGACATCG-3'
[0014]本发明还提供含有上述引物组合的用于检测军团菌的试剂盒。优选地，所述试剂盒还包括dNTPs、Taq DNA聚合酶、PCR反应缓冲液等中的一种或多种。更优选地,所述试剂盒还包括标准阳性模板。
[0015]本发明进一步提供上述引物组合或试剂盒在检测环境样本中军团菌污染中的应用。包括以下步骤:
[0016]I)提取环境样品中的DNA ；
[0017]2)以步骤I)中提取的DNA为模板，利用引物对I和II进行PCR扩增反应；
[0018]3)分析PCR产物。
[0019]对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，若出现206bp和386bp两条带，则环境样品受到嗜肺军团菌污染；若仅出现386bp —条带，则环境样品受到非嗜肺军团菌的污染。
[0020]PCR反应体系以30 μ I计为:
[0021]
【权利要求】
1.用于检测军团菌的引物组合，其特征在于，所述引物组合包括用于PCR特异性扩增mip基因的引物对I以及用于PCR特异性扩增16S rRNA的引物对II ;引物序列如下: 引物对1: 上游引物 QTI 5' -GCAATGGCTAAAGGCATG-3' 下游引物 QT2 5' -AATACAACAACGCCTGGCTTG-3'
引物对II: 上游引物 16sQ-F 5' -AGGGTTGATAGGTTAAGAGC-3' 下游引物 16sQ-R 5' -CCAACAGCTAGTTGACATCG-3'。
2.含有权利要求1所述引物组合的用于检测军团菌的试剂盒。
3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括dNTPs、TaqDNA聚合酶、PCR反应缓冲液中的一种或多种。
4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括标准阳性模板。
5.权利要求1所述引物组合或权利要求2-4任一项所述试剂盒在检测环境样本中军团菌污染中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，包括以下步骤: 1)提取环境样品中的DNA； 2)以步骤I)中提取的DNA为模板，利用引物对I和II进行PCR扩增反应； 3)分析PCR产物。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR反应体系以30μ I计为:
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征在于，PCR反应条件为:94°C2分钟，61°C45秒，720C 45秒，I个循环；94°C 45秒，61°C 45秒，72°C 45秒，共33个循环。
【文档编号】C12Q1/04GK104131089SQ201410339450
【公开日】2014年11月5日 申请日期:2014年7月16日 优先权日:2014年7月16日
【发明者】秦天, 任红宇, 邵祝军 申请人:中国疾病预防控制中心传染病预防控制所