一种TACC3基因的mRNA原位杂交检测试剂盒及其检测方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种试剂盒，具体地说关于一种TACC3基因的mRNA原位杂交检测试剂 盒及其检测方法和应用。
【背景技术】
[0002] 膀胱癌是指发生在膀胱黏膜上的恶性肿瘤。是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，也是 全身十大常见肿瘤之一。占我国泌尿生殖系肿瘤发病率的第一位，而在西方其发病率仅次 于前列腺癌，居第2位。2012年全国肿瘤登记地区膀胱癌的发病率为6. 61/10万，列恶性肿 瘤发病率的第9位。膀胱癌可发生于任何年龄，甚至于儿童。其发病率随年龄增长而增加， 高发年龄50~70岁。男性膀胱癌发病率为女性的3~4倍。既往将膀胱黏膜上皮称为移 行细胞，1998年WHO与国际泌尿病理学会联合建议用尿路上皮一词代替移行细胞一词，以 区别于在鼻腔以及卵巢内的移行上皮，使尿路上皮成为尿路系统的专有名词。2004年WHO 《泌尿系统及男性生殖器官肿瘤病理学和遗传学》中尿路系统肿瘤组织学分类中膀胱癌的 病理类型包括膀胱尿路上皮癌、膀胱鳞状细胞癌、膀胱腺癌，其他罕见的还有膀胱透明细胞 癌、膀胱小细胞癌、膀胱类癌。其中最常见的是膀胱尿路上皮癌，约占膀胱癌患者总数的90% 以上，通常所说的膀胱癌就是指膀胱尿路上皮癌，既往被称为膀胱移行细胞癌。
[0003] 研究发现TACC3基因在膀胱癌组织的高表达，可能是肿瘤发生过程中的一个重要 因素，其高表达不是自身扩增导致，而是通过FGFR3致。TACC3可作为临床上膀胱癌最早期 (病变前期)诊断和治疗的一个重要指标。随着分子生物技术日益完善，功能基因组学，癌症 基因组学等研究的深入展开，至今，我们已有可能在基因水平上做更精确的早期诊断，在癌 变前期或癌细胞形成(单克隆时）就能做到早期预测诊断。
[0004] 原位杂交技术（insituhybridization)是将分子生物学与细胞化学技术结合起 来，以标记的核酸分子为探针，在组织细胞原位检测特异性核酸分子的技术。其原理是使含 有特异序列、经过标记的核酸单链（即探针)，在适宜条件下与组织细胞中的互补核酸单链 即靶核酸发生杂交，再以放射自显影或免疫细胞化学方法对标记探针进行探测，从而在细 胞原位显示特异的DNA或RNA分子。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种TACC3基因的mRNA原位杂交检 测试剂盒的用途。
[0006] 本发明的再一的目的是，提供一种TACC3基因的mRNA原位杂交检测试剂盒。
[0007] 本发明的另一的目的是，提供一种TACC3基因的mRNA原位杂交检测方法。
[0008] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案是： 一种TACC3基因的mRNA原位杂交检测试剂盒在制备检测膀胱癌疾病药物中的应用，所 述的试剂盒包括杂交探针、标记物，所述的杂交探针序列如SEQIDN〇M_006342所示，位于 4pl6. 3,全长 2847bp中取CDS:156--2672bp中一段，探针长 480bp。
[0009] 所述的杂交探针序列如SEQIDNO:NM_006342中一段序列所示的mRNA序列。
[0010] 所述的标记物选自放射性核素或非放射性标记物。
[0011] 所述的放射性核素选自3h、35s、125i或32P中的一种。
[0012] 所述的非放射性标记物选自生物素、地高辛、碱性磷酸酶、辣根过氧化酶或荧光素 中的一种。
[0013] 所述的非放射性标记物优选自地高辛。
[0014] 所述的试剂盒还包括增效剂，所述的增效剂是碱性磷酸酶抗体。
[0015] 为实现上述第二个目的，本发明采取的技术方案是： 一种TACC3基因的原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物，其中所述的杂交探针 序列如SEQIDN0:NM_006342中一段序列所示，所述的标记物选自放射性核素或非放射性 标记物。
[0016] 为实现上述第三个目的，本发明采取的技术方案是： 一种TACC3基因的mRNA原位杂交检测方法，该方法包括以下步骤： a、 将试剂盒中的杂交探针与底物中待测RNA接触，形成杂交复合体； b、 检测a步骤得到的杂交复合体。
[0017] 本发明的诊断试剂盒的组份是由杂交探针，杂交液，显色剂，增效剂等组成。本试 剂盒的核酸杂交原理是分子生物学业内人士均熟知，具体操作步骤是标本处理、预杂交、杂 交、免疫组化染色、镜下进行定量分析、结果报告，其中杂交的具体步骤包括： 仪器操作： 1) .将待测标本放入反应槽中； 2) .仪器自动弃去液体，自动加消化液； 3) .仪器自动弃去液体，自动后固定； 4) .仪器自动弃去液体，自动预杂交（42°C); 5) .仪器自动弃去液体，自动清洗； 6) .仪器自动弃去液体，自动杂交（42°C); 7) .仪器自动弃去液体，自动清洗； 8) .仪器自动弃去液体，自动与DIG抗体培养(室温）； 9) .仪器自动弃去液体，自动清洗，显色； 10) .取出封片镜检。
[0018] 本发明优点在于： 1、本发明提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强的特点。
[0019] 2、本发明的检测方法操作方便、简单，能在区级以上医院普遍使用和推广。
[0020] 3、本发明的临床意义是更早期跟踪检测膀胱癌发生动态过程，以及用于膀胱癌预 防医学的检测和筛选工具。本发明的诊断试剂盒与临床上其它检测癌胚蛋白标志物，以及 影像医学检查有显著不同。本发明可以在基因水平上检测TACC3异常表达，在影像医学检 查及其它检查未发现占位性膀胱癌病灶之前，癌症生化指标未产生异常之前，亦未形成肿 块之前，能及早做到以上基因表达异常的信息采集，给临床膀胱癌病患一个真正的预后早 期诊断。这样才有可能实施膀胱癌的早期诊断、早期预防、早期治疗，有可能从源头上彻底 根治膀胱癌恶疾。
【附图说明】
[0021] 图1是本发明原位杂交实施流程图； 图2是本发明实施例中癌症病人TACC3过量表达图片； 图3是本发明实施例中正常人TACC3表达图片。
【具体实施方式】
[0022] 下面结合附图对本发明【具体实施方式】作详细说明。
[0023] 实施例1 一种TACC3基因的mRNA原位杂交检测试剂盒，包括杂交探针、标记物、增效剂，其中，所 述的杂交探针序列如SEQ ID N0:NM_006342所示中⑶S中一段。杂交探针用地高辛标记。 试剂盒中的其它液体和标本组成如下： 消化液100UL/管1管/盒无色透明液体 保护液100UL/管1管/盒无色透明液体 预杂交液 1300yL/管2管/盒无色透明液体 正义杂交液10uL/管1管/盒无色透明液体 反义杂交液10UL/管1管/盒无色透明液体 封闭液1000UL/管1管/盒无色透明液体 碱性磷酸酶抗体 luL/管1管/盒无色透明液体 显色剂A175yL/管1管/盒黄色液体 显色剂B320UL/管1管/盒无色透明液体 缓冲液I90mL/瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体 缓冲液II80mL/瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体 缓冲液III 20mL/瓶3瓶/盒浅黄色或无色透明液体 缓冲液IV 90mL/瓶1瓶/盒浅黄色或无色透明液体 固定液90mL/瓶1瓶/盒无色透明液体 阳性对照标本6片/盒。
[0024] 上述试剂成分说明：(所有试剂购自SIGMA) 1、 消化液：20mg/ml 蛋白酶 K，100mg 蛋白酶 K，加 DEPC-H20 5ml; 2、 保护液：〇. 2g的glycine加入lml的IX缓冲液I ; 3、 预杂交液：1X缓冲液II 7. 5ml 50XD 3ml 10mg/ml yest t-RNA 750ul llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0. 04M EDTA 3ml 50% formamide 15ml 4、 封闭液：0.03g的bloking (购买自罗氏公司）加入lml IX缓冲液III ; 5、 10x 缓冲液 I :(PH7. 1-7. 4) NaCl80g Na2HP04. 12H20 360g KC1 2g KH2P04 2g 加三蒸水至11，并高压灭菌； 6、 10x缓冲液II:(PH7.0) NaCl175.3g 柠檬酸钠88. 2g HC1几滴 加三蒸水至11，并高压灭菌； 7、 缓冲液III:(PH7.9) Tris 12