一种与西瓜果肉颜色相关的分子标记MluI-6的筛选方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种与西瓜果肉颜色相关的分子标记MluI-6的筛选方法及应用，属 于分子标记辅助育种技术领域。
【背景技术】
[0002] 分子标记辅助选择是随着现代分子生物学技术的迅速发展而产生的新技术，它可 以从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，从而实现对基因型的直接选择，进行分 子育种。分子标记辅助选择成功的关键在于所获得的分子标记是否与待分析的性状相连锁 以及是否在同一物种的不同材料间具有通用性。
[0003] 西瓜的果肉颜色是西瓜品质构成的一项重要指标，西瓜果实中含有番茄红 素、胡萝卜素、叶黄素、玉米黄质等多种色素，不同色素的组成及含量的多少使西 瓜果肉呈现出不同颜色。同时，西瓜果肉中的色素也具有对人体有益的生理功能， 有研宄表明，番茄红素具有高效的抗氧化活性，能有效的降低癌症和心脑血管的发 病率，并可以作为一种功能性色素广泛的应用于功能食品、药品和化妆品中（Sahin K,Tuzcu M, Sahin N, et al. Nrf2/H〇-lsignaling pathway may be the prime target for chemoprevention of cisplatin-induced nephrotoxicity by lycopene. Food Chem Toxicol, 2010, 48(10):2670-2674 ；Mortensen A,Skibsted L H, Sampson J, et al.Comparative mechanisms and rates of free radical scavenging by carotenoid antioxidants.FEBS Lett, 1997,418(12):91-97)。0-胡萝卜素可以减少脂质过氧化保护 有机体不被破坏（Olson J A. Molecular actions of carotenoids. In:Canfield LM(ed). Carotenoids in Human Health, New Y ork. Academy of Sciences, 1993. 156-166)，叶黄素 对维护视力有着重要的作用。因此通过分子标记辅助选择的方法高效的选育不同果肉颜色 的西瓜品种是当前西瓜育种工作的主要部分。
[0004] 随着DNA分子标记技术的快速发展，利用与植物相关基因紧密连锁的分子标记进 行辅助选择，可以极大的加速主要性状的筛选和基因定位，从而大大提高育种选择效率。但 是，西瓜的遗传距离较为狭窄，目前文献已公布的可用的分子标记数目较少且多态性较低， 严重制约了西瓜主要农艺性状基因定位及相关分子标记的开发。近年来，高通量测序技术 迅猛发展，通过测序技术获得的西瓜基因组数据为西瓜主要性状的基因定位及大量分子标 记的开发提供了新的途径。开发大量的与西瓜主要农艺性状相关的分子标记可以为西瓜育 种工作在基因层面上提供强有力的理论依据，快速、高效的服务于传统育种工作。
[0005] CAPS分子标记是以酶切位点单碱基突变产生多态性的分子标记，以其分布范围广 泛、变异稳定成为基因定位及分子生物学研宄的新一代标记，CAPS标记操作简便，结果易于 观测且在相同物种间具有普遍适用性。
【发明内容】
[0006] 本发明提供了一种与西瓜果肉颜色相关的分子标记MluI-6的筛选方法及应用， 用以对含有番茄红素和不含有番茄红素的西瓜植株进行分子标记辅助选择，采用的技术方 案如下：
[0007] 本发明的目的在于提供一种与西瓜果肉颜色相关的分子标记MluI-6的筛选方 法，该方法是对不同果肉颜色品系的西瓜进行测序，再将所得序列与西瓜果肉颜色相关的 基因序列进行比对分析后，获得与西瓜果肉颜色相关的基因序列所在的染色体区间，在染 色体区间内筛选出存在CAPS突变的序列，根据突变序列设计CAPS分子标记引物，再利用 CAPS分子标记引物及西瓜基因组DNA进行PCR扩增，最后对扩增产物酶切后利用电泳进行 验证。
[0008] 所述方法步骤如下：
[0009] 1)选取两种不同果肉颜色品系的西瓜；
[0010] 2)利用高通量测序技术测定步骤1)所选的两种西瓜的基因序列，将所得序列与 西瓜果肉颜色相关的基因序列进行比对分析，获得存在与西瓜果肉颜色相关的基因序列所 在的染色体区间，在该区间内筛选测序序列存在SNP突变位点的碱基区段，分析SNP位点的 酶切信息，获得存在CAPS突变的序列；
[0011] 3)针对步骤2)所得的序列，设计CAPS分子标记引物；
[0012] 4)以西瓜基因组DNA为模板，利用步骤3)所得的CAPS分子标记引物进行PCR扩 增反应，获得PCR产物；
[0013] 5)利用限制性内切酶对步骤4)所获得的PCR产物进行酶切反应；
[0014] 6)利用琼脂糖凝胶电泳对步骤5)所获得的酶切产物进行验证。
[0015] 步骤1)所述两种不同果肉颜色的西瓜品系，一种为黄色，另一种为红色。
[0016] 步骤1)所述与西瓜果肉颜色相关的基因序列，位于西瓜番茄红素环化酶基因 的cds区段，该区段的GenBank登录号为ABM90917. 1，其与西瓜番茄红素0 -环化酶基因紧 密连锁。
[0017] 步骤3)所述CAPS分子标记引物，正向引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，反向 引物核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
[0018] 步骤4)所述PCR产物，片段大小为566bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
[0019] 步骤5)所述PCR扩增，采用TD-PCR，程序为：94°C预变性7min，94°C变性30s，60°C 退火30s，每循环降低0. 5°C，72°C延伸40s，30个循环；94°C变性30s，45°C退火30s，72°C延 伸9〇8，10个循环；721：延伸1〇111111，41：保存。
[0020] 步骤6)所述验证，酶切产物条带为566bp-种片段，西瓜果肉中含有番茄红素；酶 切产物条带为287bp和279bp两种片段，西瓜果肉中不含番茄红素。
[0021] 所述方法具体步骤为：
[0022] 1)选择一个浅黄色西瓜品系和一个红色西瓜品系；
[0023] 2)利用高通量测序技术对步骤1)所选的两种西瓜品系进行测序，将所得序列与 从NCBI网站上获得的西瓜番茄红素0 -环化酶基因的cds区段的序列进行比对，得到存在 西瓜番茄红素0 _环化酶基因的cds区段的序列的染色体区间，在该区间筛选测序数据存 在SNP突变位点的碱基区段，分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS突变的序列；
[0024] 所述CAPS突变序列如SEQIDNO. 3所示；
[0025] 3)针对步骤2)所得的序列，设计CAPS分子标记引物；
[0026] 所述CAPS分子标记引物，正向引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，反向引物核 苷酸序列如SEQIDNO. 2所示；
[0027] 4)以西瓜基因组DNA为模板，利用步骤3)所得的CAPS分子标记引物进行TD-PCR 扩增反应，获得PCR产物；所述PCR产物，片段大小为566bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 3所 示；
[0028] 5)利用限制性内切酶对步骤4)所获得的PCR产物进行酶切反应；
[0029] 6)利用琼脂糖凝胶电泳对步骤5)所获得的酶切产物进行验证。
[0030] 本发明方法用于鉴定和辅助筛选西瓜的果肉颜色。
[0031] 本发明利用CAPS分子标记引物通过PCR扩增获得与西瓜果肉颜色相关的DNA片 段，再利用限制性内切酶对获得的片段进行酶切反应，由于两种不同颜色的西瓜材料在所 获得的DNA片段中存在酶切位点的单碱基突变的差异。因此，存在单碱基突变的位点不会 被限制性内切酶切开而获得一条大小为566bp的片段，不存在碱基突变位点的片段会被限 制性内切酶切开，获得287bp及279bp的两个片段，通过琼脂糖凝胶电泳可以清晰的将两中 不同果肉颜色的西瓜材料进行区分。
[0032] 本发明的分子标记MluI-6是首次发现，在现有技术中并没有被发现也没有被命 名。本发明克服了以下技术难度：首先，西瓜的遗传基础较为狭窄，目前已公布可利用的分 子标记数量有限且在不同材料间的多态性极低。其次，目前已公布的大多数分子标记位于 基因的非编码区，很难将这些标记与相关性状紧密结合，因此能用于对西瓜果肉颜色进行 基因定位和分子标记辅助选择的分子标记少之又少。最后，本发明在基因组重测序数据的 基础上开发了大量的CAPS分子标记，通过大量的田间性状调查和基因定位等分子标记试 验获得了可以对西瓜果肉颜色进行区分的CAPS分子标记。
[0033] 本发明有益效果：
[0034] 1)本发明根据高通量测序所得到的西瓜基因组数据，设计并开发了与西瓜果肉颜 色相关的CAPS分子标记。所开发CAPS分子标记在不同材料中具有通用性，操作简便结果 明确。通过分子标记辅助选择的方法，在西