瓜的幼苗期即可对西瓜果肉颜色进行辅助选择， 大大提高了育种效率缩短育种年限。可以用于今后西瓜高番茄红素的分子标记辅助选择， 并加快育种工作效率。
[0035] 2)本发明获得的CAPS分子标记，在不同的果肉颜色的西瓜材料中可以进行很好 的区分，通过对分子标记所在染色体附近序列进行Blast比对的结果可知，该标记与西瓜 番茄红素环化酶紧密连锁，因此，本发明获得了一个可以高效区分不同西瓜果肉番茄 红色有无的分子标记。
【附图说明】
[0036] 图1为CAPS引物MluI-6在1^-177、0)5、？1及？2代群体中的酶切情况 ；
[0037] (1~3,LSW-177、COS及其杂交所获得的Fjf植株的DNA通过CAPS标记MluI-6 进行PCR反应所获得PCR产物片段（566bp) ;4，D2000marker;5~7号泳道分别为LSW-177、 COS及PCR产物的酶切产物，5号泳道片段大小为566bp，6号泳道片段大小为287和 279bp，7号泳道为566bp和287、279bp各一条（由于1 %琼脂糖分辨率为100bp，无法区分 287和279bp，因此两条带在电泳图上合并为一条）；8~17，F2代中呈现红色果肉的西瓜单 株的酶切产物；18~25,泳道为F2代中呈现浅黄色果肉的西瓜单株的酶切产物；Marker为 D2000marker，条带大小由上至下依次为：2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
[0038] 图2为9种西瓜材料的PCR产物；
[0039] (1，LSW-177 ;2,MSW-28 ;3,PI179881 ;4,PI482255 ;5,WM-Clr-1 ;6,WM-Clr-2 ; 7,COS;8,PI459074 ;9,PI186490;Marker为D2000marker，条带大小由上至下依次为： 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
[0040] 图3为9种西瓜材料的酶切产物；
[0041] (1，LSW-177 ;2,MSW-28 ;3,PI179881 ;4,PI482255 ;5,WM-Clr-1 ;6,WM-Clr-2 ; 7,COS;8,PI459074 ;9,PI186490;Marker为D2000marker，条带大小由上至下依次为： 2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、100bp)。
【具体实施方式】
[0042] 下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明不受实施例的限制。
[0043] 实施例1:引物设计及基因组DNA的提取
[0044] 选用浅黄色西瓜品系CreamofSaskatchewan(简称"COS"）及红色西瓜品系 LSW-177及其杂交获得的Fi、F2R群体为实验材料验证CAPS标记鉴定西瓜果肉中是否存在 番茄红素。结果如图1所示。
[0045] 利用高通量测序技术对COS和LSW-177两个西瓜品系进行测序，并通过NCBI网站 获取西瓜番茄红素0 _环化酶基因的cds区段的序列，通过该序列与测序材料的比对，得到 了存在西瓜番茄红素环化酶基因的cds区段的序列的染色体区间，在该区间内，挖掘测 序数据存在SNP突变位点的碱基区段，分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS突变的序 列，利用Primer6软件在存在CAPS位点的序列上设计CAPS引物。引物长度在18~26bp， 退火温度为56~60°C，GC含量为40%~60%。采集LSW-177,COS及其二者杂交获得的 F1代、F2代植株的幼嫩真叶，利用改良的CTAB法提取基因组DNA。
[0046]CAPS标记的碱基序列的正向引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，反向引物核苷 酸序列如SEQIDNO. 2所示，PCR产物片段大小为566bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。 具体如表1所示：
[0047] 表1用于PCR反应的CAPS标记的引物名称、序列及预期片段大小
【主权项】
1. 一种与西瓜果肉颜色相关的分子标记MluI-6的筛选方法，其特征在于，对不同果 肉颜色品系的西瓜进行测序，再将所得序列与西瓜果肉颜色相关的基因序列进行比对分析 后，获得与西瓜果肉颜色相关的基因序列所在的染色体区间，在染色体区间内筛选出存在 CAPS突变的序列，根据突变序列设计CAPS分子标记引物，再利用CAPS分子标记引物及西瓜 基因组DNA进行PCR扩增，最后对扩增产物酶切后利用电泳进行验证。
2. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，步骤如下： 1) 选取两种不同果肉颜色品系的西瓜； 2) 利用高通量测序技术测定步骤1)所选的两种西瓜的基因序列，将所得序列与西瓜 果肉颜色相关的基因序列进行比对分析，获得存在与西瓜果肉颜色相关的基因序列所在的 染色体区间，在该区间内筛选测序序列存在SNP突变位点的碱基区段，分析SNP位点的酶切 信息，获得存在CAPS突变的序列； 3) 针对步骤2)所得的序列，设计CAPS分子标记引物； 4) 以西瓜基因组DNA为模板，利用步骤3)所得的CAPS分子标记引物进行PCR扩增反 应，获得PCR产物； 5) 利用限制性内切酶对步骤4)所获得的PCR产物进行酶切反应； 6) 利用琼脂糖凝胶电泳对步骤5)所获得的酶切产物进行验证。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述两种不同果肉颜色的西瓜品 系，一种为黄色，另一种为红色。
4. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤1)所述与西瓜果肉颜色相关的 基因序列，位于西瓜番茄红素环化酶基因的cds区段，该区段的GenBank登录号为 ABM90917. 1，其与西瓜番茄红素0-环化酶基因紧密连锁。
5. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤3)所述CAPS分子标记引物，正向引 物核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，反向引物核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示。
6. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤4)所述PCR产物，片段大小为566bp， 核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示。
7. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤5)所述PCR扩增，采用TD-PCR，程序 为：94°〇预变性7!^11，941：变性308,601：退火308，每循环降低0.51：，721：延伸908,30个 循环；94°0变性3〇8,451：退火3〇8,721：延伸4〇8，10个循环 ；721：延伸1〇111111，41：保存。
8. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，步骤6)所述验证，酶切产物条带为566bp 一种片段，西瓜果肉中含有番茄红素；酶切产物条带为287bp和279bp两种片段，西瓜果肉 中不含番茄红素。
9. 根据权利要求1所述方法，其特征在于，具体步骤为： 1) 选择一个浅黄色西瓜品系和一个红色西瓜品系； 2) 利用高通量测序技术对步骤1)所选的两种西瓜品系进行测序，将所得序列与从 NCBI网站上获得的西瓜番茄红素环化酶基因的cds区段的序列进行比对，得到存在西 瓜番茄红素环化酶基因的cds区段的序列的染色体区间，在该区间筛选测序数据存在 SNP突变位点的碱基区段，分析SNP位点的酶切信息，获得存在CAPS突变的序列； 3) 针对步骤2)所得的序列，设计CAPS分子标记引物；所述CAPS分子标记引物，正向 引物核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，反向引物核苷酸序列如SEQIDNO. 2所示； 4) 以西瓜基因组DNA为模板，利用步骤3)所得的CAPS分子标记引物进行TD-PCR扩增 反应，获得PCR产物；所述PCR产物，片段大小为566bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示； 5) 利用限制性内切酶对步骤4)所获得的PCR产物进行酶切反应； 6) 利用琼脂糖凝胶电泳对步骤5)所获得的酶切产物进行验证。
10.权利要求1-9所述的方法，其特征在于，用于鉴定和辅助筛选西瓜的果肉颜色。
【专利摘要】本发明公开了一种与西瓜果肉颜色相关的分子标记MluI-6的筛选方法及应用，属于分子标记辅助育种技术领域。本发明所提供的方法为对不同果肉颜色品系的西瓜进行测序，再将所得序列与西瓜果肉颜色相关的基因序列进行比对分析后，获得与西瓜果肉颜色相关的基因序列所在的染色体区间，在染色体区间内筛选出存在CAPS突变的序列，根据突变序列设计CAPS分子标记引物，再利用CAPS分子标记引物及西瓜基因组DNA进行PCR扩增，最后对扩增产物酶切后利用电泳进行验证。本发明方法在西瓜的幼苗期即可对西瓜果肉颜色进行辅助选择，操作简便结果明确，大大提高了育种效率缩短育种年限，加快育种工作效率。适用于西瓜番茄红素的分子标记辅助选择。
【IPC分类】C12N15-10, C12N15-11, C12Q1-68
【公开号】CN104711353
【申请号】CN201510117027
【发明人】高鹏, 刘识, 栾非时, 叶伟震
【申请人】东北农业大学
【公开日】2015年6月17日
【申请日】2015年3月17日