一种检测猪t细胞亚群性状的snp分子标记的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于家畜分子标记制备技术领域，具体涉及一种检测猪T细胞亚群性状的 SNP分子标记。以及这两个SNP构成的单倍型在检测猪T细胞亚群性状鉴定中的应用。
【背景技术】
[0002] 近几年，在猪育种工作中，提高猪的抗病能力一直是育种工作的重要任务。传统以 肉质、瘦肉率等为目标的选育方式为养猪业做出了巨大贡献，但是猪的抗病力性状依然有 待提高，流行性病毒感染频发已严重影响养猪业健康发展，猪的抗病性开始引起养殖户、政 府和科学界的广泛关注。随着国家食品安全战略和体系的不断完善，我们亟待从遗传育种 上改进猪的抗病性能。
[0003] 近年来，猪流行病呈现多元化趋势，主要表现是病毒感染频发，同时病原耐药性不 断增强。一些病毒性疾病，如猪繁殖呼吸综合征病毒（PRRSV)、猪伪狂犬病毒（PRV)、猪圆环 病毒（PCV)等难以根除，局部地区存在用药过多等问题，直接影响养殖企业的利润、消费者 饮食健康和我国的生猪养殖安全。随着人们对动物福利和环境保护意识的增强，发达国家 提出了"5R"生猪健康养殖原则（reduce,reuse,recycle,rescue,reevaluate)。与此同时， 大量药物和疫苗使用带来的病毒抗性和耐药性等问题日益引起人们的重视。因此利用抗病 育种方法从遗传本质上来提高动物的抗性显得尤为重要。
[0004] 常规育种主要通过度量一些方便测量的性状，如生长速度、背膘厚、产仔数等然后 利用常规选择的方法来进行遗传改良。但是由于抗病性状测定的成本高、难度大且没有统 一的测定指标，构建抗病性状的资源家系十分困难，故而使用常规育种手段难以有效改良 特异性抗病力（朱猛进，吴珍芳等.2007)。而从分子角度来说，动物的抗病性能本质上决 定于动物机机体的免疫力，而免疫力又跟免疫系统基因的活跃性和有效性关系密切，所以 找到免疫性状相关的，尤其是病毒性感染相关的分子标记应用于抗病分子育种显得尤为重 要。
[0005] 分子育种主要是一种利用DNA水平上的分子标记对生物群体进行遗传改良的技 术。目前在育种企业常用的分子育种技术是标记辅助选择（MAS)，利用MAS已经在一些群体 中成功清除了氟烷敏感（等位）基因。在肉质和生长性状方面，被检测的基因很多，产生了 良性效果，极大促进了猪肉品质和生长速度。而对于抗病分子育种，虽然一些基因如FUT1 可用于选育抗水肿大肠杆菌，但是报道的用于育种检测的基因和分子标记还不多。整体而 言，抗病分子标记库亟待扩充。
[0006] 近年来，随着猪全基因组序列的测定，通过比较已经测定的猪基因组，大量SNPs 被发现。这些SNPs可以用来设计SNP芯片（Ramos，Crooijmansetal.2009)，进行全基 因组关联分析来发现性状关联的SNP，进而用于基因组选择（Genomicselection)。近年 来基因组育种发展迅猛，基因组育种值（GEBV)的提出大大促进了SNP芯片的实际应用潜 能（Calus2010)。基因组选择的一大优势在于可以用于选择通常很难快速改进的性状如 繁殖性状。另外，不需要通过后裔测定，我们通过预测基因组育种值就可以评估公猪后代大 小，我们也可以在母猪产仔之前直接预测母猪基因组育种值。最为重要的是，基因组选择可 以弥补常规选育对于抗病育种的忽视，从一个更加简捷方便的角度带来抗病育种的真正提 高。从传统的育种值（EBV)到基因组水平的全基因组估计育种值（GEBV)，准确度可以提高 超过 50%(Khatib2014)。
[0007] 在动物抗病育种方面，可以通过测定群内个体免疫性状，然后进行全基因组关联 分析（GWAS)来寻找重要分子标记和关联基因。但是，目前关于猪抗病育种的GWAS研宄报道 相对匮乏，亟待深入和扩充。有的研宄通过测定正常猪群的血液数据来寻找免疫功能基因， 其优点是切入了免疫性状关联研宄的核心指标-血液细胞。但是缺陷是未研宄带病群体， 也未能触及细胞免疫相关的性状如T细胞亚型，导致关联而来的基因未能反映真正的抗病 能力。如测定血液性状如淋巴细胞数量、白细胞数量、血小板数量、粒细胞数量等进行GWAS， 发现干细胞生长因子受体（KIT)基因可能是血液细胞计数性状的候选基因（Zhang，Hong etal. 2013)。也有研宄涉及到较深层次，如猪T细胞亚型性状的GWAS关联研宄（Lu，Fu etal. 2012)，其优点是性状采用了细胞免疫能力的重要指标-T细胞亚群（如⑶4、⑶8)数 量及其比例，但是采用的群体和群体的处理等问题造成获取的T细胞免疫相关基因不够丰 富。总体而言，与猪T细胞亚群性状关联更为紧密的分子标记亟待发现和发掘。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供两个检测猪T细胞亚群性状的SNP 分子标记，这两个SNP标记可以构成一个单倍型用于猪T细胞亚群性状检测的鉴定及应用。 本发明运用全基因组关联分析的方法寻找与猪T细胞亚群性状相关的SNP分子标记及单倍 型，分子标记MARC0028162和ALGA0105397筛选自猪60KSNPs芯片，以此作为猪T细胞亚 群性状相关的SNP分子标记及单倍型在标记辅助选择中的应用。
[0009] 本发明通过以下技术方案实现：
[0010] 申请人通过全基因组分析方法（简称GWAS)从猪60KSNPs芯片中筛选得到一个 与猪T细胞亚群性状相关的SNP分子标记MARC0028162,该分子标记的核苷酸序列如下所 示：
[0011] GGATTTTAAATATCTTGGCAAAACARGAGAAAGTTGGTATTAGAATCCTTA
[0012] 上述序列的第26位的突变碱基R是A或G，该突变导致多态性。
[0013] 本发明通过GWAS方法从猪60KSNPs芯片中筛选得到一个与猪T细胞亚群性状相 关的SNP分子标记ALGA0105397,该分子标记的核苷酸序列如下所示：
[0014] CAGGAATTTGGGCAGAGCTGGGTTGRGGAAGTCTCCGGTGTGAGGTGGCCT
[0015] 上述序列的第26位中的突变碱基R是A或G，该突变导致多态性。
[0016] 上述制备的SNP分子标记可以单独或组合使用在猪T细胞亚群性状检测中的应 用。
[0017] 申请人提供了一种与猪T细胞亚群性状相关的SNP分子标记的制备方法，其步骤 如下所述：
[0018] 1)提取猪（杜洛克与二花脸杂交所得的F2)基因组DNA;
[0019] 2)对35日龄小猪进行聚肌胞苷酸PolyI:C刺激，刺激后4小时采血在流式细胞 仪进行T细胞亚群检测；
[0020] 3)将猪基因组DNA样品在全基因组芯片上做基因分型；
[0021] 4)采用PLINK软件进行数据的质量控制，保证数据可靠性。用GAPIT软件进行 全基因组关联分析；从中选取与T细胞亚型显著关联的SNP，运用Ensembl网站的Variant EffectPredictor工具，注释该SNP;然后利用生物信息学方法，对目标区域内的基因进行 功能注释；利用Haploview软件进行连锁不平衡分析和单倍型分析。
[0022] 本发明通过全基因组关联分析的方法得到与猪的T细胞亚群性状相关联的连锁 SNP分子标记，为猪的分子标记辅助选择提供了两个新的分子标记和一个单倍型。
[0023] 更详细的技术方案参见《【具体实施方式】》。
【附图说明】
[0024] 序列表SEQIDNO: 1是本发明制备的一个SNP分子标记的核苷酸序列（原SNP芯 片序列号码MARC0028162)。该序列的长度为51bp，在该序列的26bp处存在一个等位基因 的突变A或G(即由A突变为G)。
[0025] 序列表SEQIDNO:2是本发明制备的另一个SNP分子标记的核苷酸序列（原SNP 芯片序列号码ALGA0105397)。该序列的长度为51bp，在该序列的26bp处存在一个等位基 因的突变A或G(即由A突变为G)。
[0026] 图1 :是本发明的技术流程图。
[0027] 图2 :本发明得到的第一个分子标记（编号MARC0028162)，该标记位于猪5号染色 体的67231214处，是一个等位基因的突变位点。
[0028] 图3 :本发明得到的第二个分子标记（编号ALGA0105397)，该标记位于猪5号染色 体的67191233处，是一个等位基因的突变位点。
[0029] 图4 :本发明得到的第一个分子标记（编号MARC0028162)经过Ensembl定位和功 能注释后在基因组中的实际位置图。
[0030] 图5 :本发明得到的第二个分子标记（编号ALGA0105397)经过Ensembl定位和功 能注释后在基因组中的实际位置图。
[0031] 图6 :本发明分析得到的由多态性位点MARC0028162和ALGA0105397构成的一个 单倍型。
【具体实施方式】
[0032] 一、样品采集
[0033] 实验猪群来自杜洛克与二花脸杂交所得的F2群体的293头小猪（获得杜洛克与 二花脸杂交所得的F2群体为常规方法，猪品种杜洛克为国外血缘的品种，二花脸为中国地 方猪血缘，为常用品种，实验猪品种来自华中农业大学实验猪场）。猪群自由采食、饮水，整 个饲喂方式