抗-kir抗体、制剂及其应用【专利说明】[0001]本申请为申请日为2008年1月11日，申请号为200880002001.2,发明名称为"抗-KIR抗体、制剂及其应用"的发明专利申请的分案申请。
技术领域：
[0002]本发明涉及针对某些杀伤免疫球蛋白样受体（KIR)的新型抗体；以及这些和/或其他治疗性抗-KIR抗体的制剂、剂量（剂型，dosage)和给药方案；及其生产方法和使用方法。【
背景技术：
】[0003]KIR是存在于某些淋巴细胞亚群（包括NK细胞和某些T细胞）上的多态1型跨膜分子。KIR与MHCI类分子的a1和a2结构域中的免疫因子相互作用。在患有AML的患者体内，单倍体相合（haplo-identical)干细胞移植（SCT)可导致KIR-HLAI类不合（错配，mis-matchecONK细胞的扩增和激活，并导致白血病复发的速率降低，无移植物抗宿主病，和存活率显著提高（Ruggeri等人，Science2002;295:2029-31)。单倍体相合SCT的临床功效的分子基础是NK细胞介导的肿瘤杀伤由抑制性KIR受体调控。在结合到其特异性HLA-B或-C配体后，这些NK细胞受体发送抑制NK细胞介导的肿瘤杀伤的负信号。由于HLA-B和-C分子在种群中是高度多态的，且不同HLA同种抗免疫球蛋白由KIR2DL1或KIR2DL2/3识别，通常可以发现KIR和HLA不合的供体和受体，即供体的KIR不能结合受体中的HLA配体。在这样的情形中，没有抑制性信号经由不能结合HLA配体的KIR发送，促进NK细胞的激活。然而，这种SCT方案不是对所有患者都是可利用的，如大多数老年AML患者。[0004]为了通过药理学方法实现类似的NK介导的抗白血病活性，可以使用能够阻断抑制性KIR信号转导的人源化或完全人抗-KIR抗体。W02006003179、W02006072626、TO2005003172和W02005003168中描述了抗-KIR抗体具有有利的药理学特性并可用于例如治疗癌症或传染病。然而，对于这类抗体的临床应用，需要优化的制剂和有效的给药方案。[0005]这里所述的本发明涉及抗-KIR抗体的制剂和给药方案，其适用于促进对于治疗癌症和其他病症或疾病有用的生理作用。【
发明内容】[0006]本发明提供抗-KIR抗体的组合物，其在给予（或给药）后，调节体内NK细胞的活性。当以特定的剂量方案应用时，这些组合物导致NK细胞上KIR受体的有效占据（占用，occupancy)，且对治疗如癌症和病毒病有用。[0007]本发明还提供了抗-KIR抗体1-7F9(在TO2006003179中已描述）的S241P变体，可与该变体和/或1-7F9使用的新型药物制剂、其制造方法、以及使用这些组合物来促进生理效应，如治疗癌症和病毒病的方法。【附图说明】[0008]图1示出了编码抗-KIR(1-7F9)的S241P变体的突变重链的氨基酸序列（SEQIDNO:1)，其中突变的脯氨酸残基以黑体示出。[0009]图2示出了来自抗-KIR(1-7F9)的pH溶解性研究的结果，示出了在不同pH值沉淀的数量。[0010]图3示出了与不同赋形剂相关的沉淀分析的结果，示出了对于赋形剂沉淀的数量。[0011]图4示出了来自利用蛋白质A并脱盐到PBS缓冲液中而提纯抗-KIR(1-7F9)S241P突变体的色谱图。来自蛋白质A的洗脱材料，标记为峰起点（保留（"R."）体积（vol)-14mL)和峰终点（R.vol-12mL)，在脱盐柱中注射前存储在环路中。脱盐后，收集流分（fraction)并且将标记为A2和A3的流分汇集并用于进一步的分析。[0012]图5A和图5B给出了通过分析杂种细胞中表达的抗-KIR(1-7F9)和CHOK1细胞中表达的抗-KIR(1_7F9)得到的电泳图（A)和整合表（integrationtable)(B)。[0013]图6示出了野生型B6小鼠和转基因KIR-tgll小鼠中抗-KIR(1-7F9)的群体药代动力学模型的示意图，包括可饱和外周结合位点（peripheralbindingsite)。[0014]图7示出了与在B6小鼠中的平均观察值相比的平均预测PK分布（profile)。模型预测基于组合的B6/KIR-tgIIPK模型。[0015]图8示出了与KIR-tgll小鼠的平均观察值相比的平均预测PK分布。模型预测基于组合的B6/KIR-tgIIPK模型。[0016]图9示出了与在KIR-tgl小鼠中的平均观察值相比的平均预测PK分布。[0017]图10示出了用于人PK预测和猕猴PK估计的两室（two-compartment)药代动力学模型的示意图。[0018]图11示出了在37°C时，通过体外滴定结合到KIR-tgll小鼠的NK细胞和结合到人NK细胞的抗-KIR(1-7F9)所获得的平行的浓度对占据的曲线。KIR-tgll小鼠的脾细胞和人供体的PBMC或NK细胞，以及表达KIR2DL1的YTS细胞系以增加浓度的抗-KIR(1-7F9)培育，然后用流式细胞仪分析。[0019]图12示出了AML患者体内抗-KIR(1-7F9)血浆浓度对给药后时间的曲线图，示出了1975-1733:AML患者中的抗-KIR(1-7F9)血浆浓度。[0020]图13示出了给予后2小时人体内KIR占据和1-7F9血清浓度之间的关系。绘出了在l/2L0Q(2.5ng/ml)处的低于定量限（L0?的血浆浓度。实线不是实际数据的拟合，而是Kd=4ng/ml的单价饱和等温线拟合（方程10)。[0021]图14示出了给予后24小时到6周时间点人体内KIR占据和1-7F9血清浓度间的关系。绘出了在1/2L0Q(2.5ng/ml)处的低于L0Q的值。实线不是实际数据的拟合，而是Kd=20ng/ml的单抗原饱和等条件拟合（方程10)。点线示出了Kd=9ng/ml(针对24小时预测的值）。[0022]图15示出了给予抗-KIR(1-7F9)后患者血液中NK细胞和T细胞上CD107a的水平，其中在给予后24小时NK细胞上⑶107a水平增加。【具体实施方式】[0023]如上所述，本发明提供适于NK细胞激活的组合物、制剂、剂量和给药方案，以及抗-KIR抗体的治疗应用，以及包括一种或多种抗-KIR抗体及用于治疗癌症或病毒病（过滤性病毒）的说明书的药剂盒。[0024]在一个方面，本发明提供抗-KIR-种抗体给药方案，其特征在于表1中描述的不例性剂量-给药方案（或给药频率）组合。[0025]表1-抗-KIR抗体的剂量和给药方案[0026][0027]表1中所述的特定值应理解为近似值。例如，对于表1中每个剂量-给药方案，有效的NK细胞调控也可通过以同样的给药频率给予更高的剂量而实现，或通过以更高给药频率给予同样的剂量而实现。[0028]所提供的给药方案部分基于PK/H)模拟和针对抗-KIR抗体1-7F9的患者研究的数据的组合，如在实施例中所描述的。不受理论束缚，表1中的给药方案通过给予患者抗-KIR抗体后血液中NK细胞上实现高KIR占据水平，如至少约90%，或至少约95%，而达到有效的NK细胞调控。根据本发明，其他具有合适特性的用于获得类似高占据水平的抗-KIR抗体也可用于给药方案中，如这里所述。[0029]在KIR和HLA不合（或不匹配）的供体和受体之间的单倍体相合SCT的临床情况中，可以在移植后长达约3个月内在患者血液循环中检测到供体源（donor-derived)NK细胞；然而，NK细胞可以以排除（或防止）其识别的量维持显著更长的时间。应该指出，每个个体表达克隆地分布在NK细胞上的不同KIR的所有成分，并且即使在单倍体相合SCT情况下，仅一个供体源NK细胞亚群将表达不能结合受体中的HLA的特定KIR。因此，至少3个月，完全没有经由NK细胞亚群上的特定KIR亚群的信号转导，足以实现显著的临床益处。[0030]基于这些前提，中和性抗-KIR抗体的治疗有效剂量方案是这样的方案，其导致足够高（如全部或近似全部）的阻断KIR受体至少约3个月的时间，优选至少6个月。然而，直到现在还未知是否可在患者体内实现足够高的阻断，或者要求怎样剂量的抗-KIR抗体来实现这种阻断。如这里所述，令人惊讶的是，低剂量的抗-KIR(1-7F9)足以在患者体内（ii)可检测地激活NK细胞介导的体内肿瘤细胞的杀伤，和（i)实现近似全部受体阻断。虽然全长人抗体或人源化抗体通常在血液中具有长半衰期从而实现几个月的全部或近似全部KIR占据，但需要在某些规定的时间间隔重复给予。从PK/H)模拟和人类临床数据组合看，现在已经揭示了什么给药方案可实现持续的KIR阻断（参见表1和实施例12)。[0031]在另一方面，本发明提供适于1-7?9、1-7?9(5241?)、或类似1864抗体、特别是类似抗-KIRIgG4抗体和/或交叉反应性（cross-reactive)抗-KIR抗体的制剂。已经确定这里所述的制剂与有利的药理特性关联，这些有利的药理特性包括（a)低水平抗体分子沉淀（合适的溶解度和低水平的颗粒形成）、（b)可接受水平的抗体分子稳定性（在单体结构和二级结构元素的维持方面）、和（c)低水平的聚集体形成。[0032]抗-KIR抗体[0033]可用于本发明的抗-KIR抗体是NK细胞调控的，即有效地调控NK细胞活性，通常通过减少KIR信号转导。这可通过抗体阻断HLA配体结合到KIR分子，或通过抗体的非竞争性拮抗机理（参见W02006072626)而实现。对于减少或阻断一个或多个抑制性KIR，如KIR2DL1、KIR2DL2、和KIR2DL3的信号转导的抗-KIR抗体，这里称为"中和性(neutralizing)抗-KIR抗体"，高KIR占据导致NK细胞活性增强。合适的抗-KIR抗体也可是单特异性的，即结合到单一类型的KIR分子上，或者是多特异性的，即结合到多于一种的KIR分子上。至少结合到所有KIR2DL1、KIR2DL2、和KIR2DL3的抗-KIR抗体在这里称为"交叉反应性抗体"。可用于根据本发明用途的示例性抗体包括在W02006003179和TO2006072626中描述的那些抗体。例如，中和性与交叉反应性抗-KIR抗体1-7F9(也称为"抗-KIR(1_7F9)"、"1-7F9"、和"抗-KIR"）阻断抑制性KIR2DL受体KIR2DL1、KIR2DL2、和KIR2DL3与它们的HLA-C配体相互作用，由此增强NK细胞的细胞毒素活性。如在实施例13和14中所述，迄今在对患有AML或多发性骨髓瘤患者进行的剂量递增试验(dose-escalationtrial)中，即使单一、低剂量的1-7F9也能够减少大多测试的患者中的肿瘤标记物。抗-KIR(1-7F9)的可变轻和重链序列分别在SEQIDN0:2和SEQIDN0:3中给出。[0034]然而，本发明也提供了抗-KIRIgG4抗体1-7F9的新型变体。所提供的变体包括IgG4重链，其中该IgG4重链包括1-7F9可变重链序列和残基241中丝氨酸至脯氨酸突变，相应于根据EU索引（EU-index)的位置228(Kabat等人，"Sequencesofproteinsofimmunologicalinterest"，第5版，见11，1361:1168(^，]\^，1991)。而且还提供了包括根据这里提供的SEQIDNO:1的重链的IgG4同种型（isotype)的1-7F9变体。编码SEQIDNO:1的核苷酸序列在SEQIDNO:6中给出，且其互补序列在SEQIDNO:7中给出。该变体可进一步包括轻链，其中该轻链包括根据SEQIDN0:2的轻链可变区。该变体也称为1-7F9(S241P)。通常，抗体变体在CH0细胞或另一合适细胞类型中重组地表达。如实施例所示，突变不影响变体抗体通过1-7F9结合到KIR抗原的能力。同样，1-7F9(S241P)抗体通常可以以TO2006003179中所述的抗体1-7F9应用的任何方式使用。[0035]编码1_7F9(S241P)变体的突变重链的序列在图1中示出。根据突变重链和野生型轻链的转染，变体在CH0细胞中表达。当然，这些方法仅是示例性的，因为这样的抗体分子可用任何合适方法制备（其实例在W02006003179中描述）。[0036]用于制备、鉴定和表征（例如，亲合力（Kd))中和性和/或交叉反应性抗-KIR抗体的不同方法，以及用于重组地表达这类抗体的方法和其他相关技术是本领域公知的，并在例如TO2006003179、TO2006072626、TO2005003172和TO2005003168中说明，所有文献的全部内容以引用方式结合于此。[0037]药物制剂[0038]在一个方面，本发明提供药学可接受的抗体制剂。当然，虽然以l_7F9IgG4抗-KIR抗体或上述1-7F9变体IgG4分子（其可称为，如"1-F79v"、"1-7F9S241P"、或"S241P变体"等）作为示例，但是这类制剂的特性可适用于包括类似的IgG4抗体，特别是类似的抗-KIRIgG4抗体和/或交叉反应性抗-KIR抗体的制剂。例如，W02006003179中所述的任何人类抗-KIR抗体、以及鼠类抗-KIR抗体的人源化IgG4变体，如DF200、NKVSF1、EB6、或GL183，有或没有S241P变异，都可类似地用在根据本发明的制剂中。[0039]本发明还提供了包括变体1-7F9抗体的这样的制剂或其他组合物。这样的制剂特征为具有少于约15%，如少于约10%(如约5%或更少、约4%或更少、约3%或更少、或甚至约1%或更少）的IgG4"半抗体（halfantibody)"（包括单个重链/轻链对）。这样的IgG4"半抗体"副产物由于铰链区重链间的二硫桥（disulphidebridge)的异质性(heterogeneity)与分泌的人IgG4成比例形成（关于IgG4"半抗体"、S241P变异和相关原理的说明，参见Angal等人，MolecularImmunology，30(1):105_108,1993)。该效果通常仅在变性、非还原条件下可检测。在1-7F9变体中，S241P突变能够减少这样的半抗体产物的形成。半抗体形成的显著减少是通过标准技术观察到的。[0040]在一个方面，本发明提供药学可接受的活性制剂，其包括（a)约0.05mg/mL至约10mg/mL的IgG4抗体；(b)约10-50mM磷酸钠；（c)约160-250mM的蔗糖或约lOOmM的NaCl;和（d)聚山梨醇酯80，pH为约7。抗体通常是中和抗-KIR抗体，并且也可以是交叉反应性抗体。在个别实施方式中，抗体包括根据SEQIDN0:3或SEQIDNO:1的重链序列。在另一种实施方式中，抗体进一步包括根据SEQIDN0:2的轻链序列。这样的制剂中IgG4抗体分子的浓度可以在例如约1至约l〇mg/ml的范围内，如约10mg/ml。在特定实施方式中，磷酸钠在约20mM至约50mM变化，蔗糖从约220mM至约250mM变化，以及聚山梨醇酯例如可以为约0.001%。在另一种特定的实施方式中，磷酸钠浓度为约20mM且蔗糖浓度为约220mM。[0041]在另一个示例性方面，本发明提供药学可接受的活性制剂，其包括（a)约0.05mg/mL至约10mg/mL包括重链和轻链的IgG4抗体分子，其中该重链包括根据SEQIDNO:3的可变区，而该轻链包括根据SEQIDN0:2的轻链可变区；(b)约50mM磷酸钠；（c)约250mM蔗糖；和（d)约0.001%的聚山梨醇酯80,pH为约7。在一种实施方式中，该重链包括SEQIDNO:1的序列。[0042]在另一个举例说明性方面，本发明提供药学可接受的活性制剂，其包括（a)约0?05mg/mL至约10mg/mL包括重链和轻链的IgG4抗体分子，其中该重链包括根据SEQIDNO:3的重链可变区，而该轻链包括根据SEQIDNO:2的轻链可变区；（b)约50mM磷酸钠；(c)约250mM的蔗糖或约lOOmM氯化钠；和⑷约0.001%的聚山梨醇酯80,其中所述制剂的pH为约7。在特定方面，该抗体是具有S241P突变的1-F79。[0043]在一个示例性方面，本发明提供药学可接受的活性制剂，其包括（a)约0.05mg/mL至约10mg/mL包括重链和轻链的IgG4抗体分子，其中该重链包括根据SEQIDNO:3的重链可变区，该轻链包括根据SEQIDN0:2的轻链可变区；(b)约20mM磷酸钠；（c)约220mM的蔗糖；和（d)约0.001%的聚山梨醇酯80,pH值为约7。在一种实施方式中，该重链包括SEQIDNO:1的序列。[0044]在另一个举例说明性方面，本发明提供药学可接受的活性制剂，其包括（a)约0?05mg/mL至约10mg/mL包括重链和轻链的IgG4抗体分子，其中该重链包括根据SEQIDNO:3的重链可变区，而该轻链包括根据SEQIDNO:2的轻链可变区；（b)约20mM磷酸钠；(〇)约2201111的蔗糖或约1001111氯化钠；和（(1)约0.001%的聚山梨醇酯80，其中所述制剂的pH为约7。在特定方面，该抗体是具有S241P突变的1-F79。[0045]在另一个示例性方面，本发明提供由以下成分的混合物制备的药学可接受的活性制剂，包括（a)-定量的包括重链和轻链的IgG4抗体分子，其使得该制剂中的抗体浓度为约1〇11^/1^，其中该重链包括根据3￡〇10勵:3的重链可变区，而该轻链包括根据3￡〇10N0:2的轻链可变区，；(b)约8.4mg/mL的磷酸氢二钠（七水合物）；（c)约2.6mg/mL的磷酸二氢钠；⑷约85mg/mL的鹿糖；和（e)约0?01mg/mL的聚山梨醇酯80,其中所述制剂的pH为约7。在一个方面，抗体包括根据SEQIDNO:1的重链。在另一个方面，抗体是1-F79。[0046]在另一方面，本发明提供制备适于由具有上述特征的浓缩制剂注射到患者体内的制剂的方法，其包括提供在约5°C存储的浓缩制剂，利用包括制剂的组分（b-)-(d)的制剂稀释该浓缩制剂，从而得到稀释的（可立即注射/输注）产品，且可选在给予前在约5°C存储该稀释产物长达24小时。[0047]在又一个方面，本发明提供药学可接受的活性制剂，其包括（a)约0.05mg/mL至约10mg/mL包括重链和轻链的IgG4抗体分子，其中该重链包括根据SEQIDN0:3的重链可变区，而该轻链包括根据SEQIDN0:2的轻链可变区；(b)约5-20mM磷酸钠（如约5mM磷酸钠、约10mM磷酸钠、约15mM磷酸钠、或约20mM磷酸钠）；（c)约180至约250mM的鹿糖（如约180-240禮、如190-2301111，如约200-2251111，如约2201111);和（(1)约0.001%或约0.01-0.1%的聚山梨醇酯80(如约0?02-0.1%、0.03-0.1%、0.05-0.09%、0.05-0.08%等），其中所述制剂pH值为约7。在一个方面，制剂包括低于约35mM(如低于约25mM)的磷酸钠。较低的磷酸钠浓度可能在需要长期冷冻贮藏该制剂的情况下是特别理想的。在另一个方面，该制剂包括多于约〇.005%的聚山梨醇酯80。在特定的示例性方面，包含在这样的制剂中的抗体是1-F79。在另一个特定的示例性方面，这样的制剂中的抗体具有由或基本上由SEQIDNO:1构成的重链。在又一个方面，该抗体是另一种IgG4抗体，如另一种抗-KIRIgG4抗体，或如另一种至少与KIR2DL1和KIR2DL2/3是交叉反应性的抗-KIR抗体。在一个方面，该制剂可具有等张性特征。[0048]作为另一个方面，本发明提供制备适于由具有根据以上段落的制剂特征的浓缩制剂注射到患者体内的制剂的方法，其包括提供在约5°C存储的浓缩制剂，利用包括制剂的组分（b)-(d)的制剂或无菌等张盐水溶液稀释该浓缩制剂，从而得到稀释的（可立即注射/输注的）产品，且可选在给予前在约5°C存储该稀释产物长达约24小时。例如，该方法当前第1页1 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